本方案描述了一种利用二氢乙啶（DHE）作为荧光染料探针，通过高通量筛选方法定量检测细胞内活性氧（ROS）的新方法。该方案详细介绍了在三种不同的人肝细胞癌细胞系中定量评估细胞内活性氧（ROS）的实验方法。
本文内容
摘要
摘要
活性氧（ROS）在生理和病理过程中对细胞代谢的调控起着关键作用。生理条件下的活性氧生成在细胞正常功能（如增殖、信号传导、凋亡和衰老）的时空调控中具有核心地位。相反，活性氧的长期过度产生则与多种疾病相关，包括癌症、心血管疾病和糖尿病等。因此，以准确且可重复的方式定量活性氧水平对于理解细胞正常功能至关重要。基于荧光成像的方法是表征细胞内活性氧种类的常用手段。文献中许多活性氧检测方案使用2'-7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）染料。然而，该染料在使用和结果解读方面存在显著局限性。本方案展示了二氢乙啶（DHE）荧光探针作为一种替代方法，在高通量条件下定量总活性氧生成的应用。本研究采用CX7 Cellomics高通量成像平台对活性氧的生成进行测量和定量分析。实验在三种肝细胞癌细胞系——HepG2、JHH4和HUH-7中进行。本方案详细描述了细胞内活性氧评估所涉及的各项操作步骤，包括DHE溶液的配制、细胞与DHE溶液的孵育，以及用于表征活性氧生成所必需的DHE荧光强度的测定。本方案表明，DHE荧光染料是一种稳健且可重复用于高通量检测细胞内活性氧生成的方法。高通量活性氧检测方法可能在毒理学、药物筛选和癌症生物学等多种研究中发挥重要作用。
引言
活性氧（ROS）是一类在正常细胞代谢过程中自然产生、具有高度反应性且存在时间短暂的化学自由基 细胞。活性氧（ROS）在调控细胞内正常的生理和生化过程中发挥着关键且必不可少的作用1,2细胞内活性氧（ROS）产生的主要来源是线粒体电子传递链（ETC）途径，这是正常生物能量循环的一部分。其他重要的ROS产生来源包括细胞内的酶促反应，例如NADPH氧化酶的作用。食物分子（如葡萄糖）的代谢通过线粒体基质中的氧化磷酸化途径进行。基础水平的ROS产生对于调控正常的生理细胞信号传导过程至关重要。已知许多参与葡萄糖代谢信号通路的关键蛋白分子（如Akt和PTEN）会响应细胞内ROS水平的变化。此外，多种细胞内酶也会在细胞酶促途径中产生ROS，这些酶包括黄嘌呤氧化酶、一氧化氮合酶以及过氧化物酶体组分。1,2与活性氧（ROS）的天然来源不同，某些环境因素（如异生物质、病原体、紫外线、污染、吸烟和辐射）也会导致ROS过度产生，这是细胞内氧化应激的关键驱动因素。1,3细胞内氧化应激水平升高可导致细胞内天然生物分子（如脂质、蛋白质和DNA）受损，从而引发癌症、糖尿病、心血管疾病、慢性炎症及神经退行性疾病等多种疾病。1,3,4因此，准确测量活性氧（ROS）对于理解其生物学作用至关重要 氧化应激诱导的疾病病理生理过程中所涉及的细胞机制。
由于细胞内活性氧（ROS）的产生和清除时间尺度较短，对多种ROS自由基进行定量测量仍具挑战性。目前常用电子顺磁共振（EPR）5、高效液相色谱（HPLC）以及基于荧光探针的成像方法来检测各类细胞内ROS6。尽管EPR和HPLC等方法可提供定量准确的结果，但这些方法会破坏细胞的空间形态，通常只能对样本进行整体性、群体性的测量。相比之下，基于成像的方法（如荧光探针法）能够保留ROS生成过程中的细胞形态和空间背景信息。然而，不同荧光探针对各类ROS自由基的特异性尚未得到充分验证7,8。目前市面上已有多种可用于检测ROS的荧光探针，包括二氢乙啶（DHE）、二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）、二氢罗丹明（DHR）、二甲基蒽（DMA）、2,7-二氯二氢荧光素（DCFH）、1,3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）以及MitoSox等。在过去几十年中，DHE、MitoSox和DCFH-DA是细胞与组织中检测ROS最常用的荧光染料8,9。DCFH-DA是一种广泛用于检测细胞内H2O2和氧化应激的染料。尽管DCFH-DA应用广泛，但多项先前研究表明，其无法可靠地用于测定细胞内H2O2及其他ROS水平8,9,10,11,12,13,14。
相比之下，荧光探针二氢乙啶（DHE）对细胞内超氧阴离子自由基（O₂•⁻）具有特异性响应2-）。尽管超氧阴离子自由基是细胞中多种活性氧（ROS）物种之一，但它在过渡金属的还原、过氧亚硝酸盐的转化以及氢过氧化物的形成等多种细胞内效应中发挥着重要作用。DHE 可迅速被细胞摄取，并在红色波长范围内产生荧光发射。15. DHE 与超氧阴离子自由基特异性反应后，生成红色荧光产物 2-羟基乙锭（2-OH-E）+）。因此，DHE 可被视为一种用于超氧阴离子检测的特异性探针。然而，DHE 也可与过氧亚硝酸根（ONOO⁻）发生非特异性氧化反应- 或 OH.，H2O2, 以及细胞色素c形成第二种荧光产物，即溴化乙锭E+, 可能会干扰测定的2-OH-E+ 水平。然而，这些2-OH E+ 和 E+ 产物联合起来代表了用DHE染色时在细胞内观察到的总细胞ROS物种的主要部分。+ 插入DNA，显著增强其荧光信号8,9,10,11,13,14,15,16由于溴化乙锭和2-羟基溴化乙锭的荧光光谱差异较小，因此可利用DHE荧光产物检测并测量细胞中由超氧阴离子产生所引起的大部分活性氧水平。这些活性氧物种通过480 nm波长激发和610 nm波长发射进行鉴定。15,16,17.
除了选择特定的荧光活性氧（ROS）检测探针外，选择一种灵敏的检测方法来测量细胞内活性氧水平也至关重要。因此，准确评估细胞内活性氧水平是识别疾病细胞或暴露于各种环境应激因素（如辐射、毒理学化合物和基因毒性试剂）的细胞中发生的氧化还原平衡紊乱状态的关键18。由于活性氧是细胞中常见的现象，参与调控多种细胞信号传导活动，因此必须采用可靠的活性氧检测方法。为了实现对细胞内活性氧生成的高通量评估，本方案采用高内涵筛选（HCS）平台来检测活性氧种类。当前方案可实现对细胞内活性氧生成的高通量分析，在许多毒理学研究中具有重要意义19。本方案旨在提供一种简便且多功能的方法，用于检测和测量贴壁生长的肝细胞癌细胞中的细胞内活性氧。使用化学试剂过氧化氢（H2O2）和甲萘醌作为强效的活性氧刺激剂，以在受控且高通量的条件下测量活性氧生成的相对水平。根据需要，本方案可进一步优化，用于在适当条件下检测贴壁和非贴壁细胞中的活性氧生成。
方案
1. 细胞培养
- 将测试细胞（HepG2、HUH7 和 JHH4 肝细胞癌细胞）以每孔 10,000 个细胞的接种密度接种于 96 孔板中，每孔终体积为 200 µL。
- 在培养 HepG2 细胞前，需用 IV 型胶原蛋白（50 µg/mL）在室温（RT）下对 96 孔板的孔进行 2 小时的包被处理。为防止胶原蛋白原液凝固，应将原液置于冰上，并在此条件下开始稀释至所需浓度。
- 经过 2 小时孵育后，吸除多余胶原蛋白溶液，并用 1× PBS 洗涤孔壁三次。
- 将细胞在含 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）的湿润培养箱中，于 37 °C 及 5% CO2 条件下培养过夜。
- 次日或当细胞融合度达到 80%–90% 时（以先到者为准），分别用 H2O2 （未处理、250 µM、500 µM、750 µM 和 1000 µM）以及 Menadione（未处理、25 µM、50 µM、75 µM、100 µM）处理细胞 30 分钟，以诱导典型的氧化应激反应。
- 或者，也可选择使用其他能够诱导细胞内氧化应激的待测物质进行测试。
2. 细胞DHE染色用储备液及稀释液的配制
- 通过将5 mg DHE溶解于1 mL DMSO中，制备DHE储备液（5 mg/mL 或 15.9 mM）。
- 用双蒸灭菌水将DHE储备液稀释至终浓度为100 µM。
- 为避免染料反复冻融（可能随时间推移损害其荧光特性），将100 µM的DHE溶液分装至若干1.5 mL离心管中，每管适量，于-20 °C保存。
- 为获得10 µM的终工作浓度，取一管100 µM DHE溶液，用预热的DMEM培养基稀释。
注意：工作液必须在实验当天新鲜配制。 - 将工作用荧光染料溶液涡旋震荡5-10秒，以确保染料充分混匀。
3. DHE 染色过程
- 从每个孔中移除含有药物或待测物质的培养基，并用1× PBS或DMEM轻轻洗涤一次。
注意：在进行实验中的加样或洗涤步骤时，必须避免移液器与细胞直接接触。可通过沿孔壁轻轻加入PBS的方式，以尽量减少对细胞可能造成的机械损伤。确保移液器不直接触碰细胞，有助于在整个实验过程中维持细胞的完整性和活力。 - 向每孔中加入含10 µM DHE（工作液）的100 µL DMEM培养基，在37 °C下孵育30分钟。
- 孵育30分钟后，移除含DHE的培养基，并用1×磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗涤每孔三次。可使用多通道移液器操作，以确保快速完成洗涤。
- 向每孔中加入含Hoechst 33342核染色染料的200 µL 1× PBS，在室温下孵育10分钟。
- 移除Hoechst 33342核染色溶液，并向每孔中加入200 µL 1× PBS。
注意：如需获得固定细胞，请按照活细胞实验相同的操作流程进行，额外增加一步：在处理及DHE染色后，加入4% PFA固定5分钟。随后移除PFA溶液，并用1× PBS洗涤细胞，再将细胞与核染色染料共同孵育10分钟。 - 尽快将培养板转移至高内涵筛选系统、荧光显微镜或酶标仪，进行图像采集。
4. 图像采集与强度测量
- 平板加样
- 打开Cellomics CX7高内涵筛选（HCS）软件以进行数据采集。
- 根据所选的特定96孔板，在使用前严格按照制造商的说明对成像平台进行仔细校准，以避免数据中出现模糊或不清晰的图像。
注意：不同供应商提供的多孔板可能具有不同的材料特性，这会影响最终成像的质量。 - 校准后，将针对该品牌酶标板的系统参数保存至仪器数据库中，并在后续的数据采集过程中重复使用。
- 将装有已制备样品的培养板小心放置于HCS成像系统的加热载物台上。确保培养板牢固固定，并在微孔板支架上处于正确的成像方向（即，找到读板仪载物台上标记为A1的位置，然后旋转微孔板，使孔A1的位置与贴有标签的角落对齐）。
- 轻轻按压微孔板，确保其平整地贴合在载物台上。HCS系统中微孔板不平整可能导致成像过程中出现误差。
- 在将板子放好后，按住并保持 Ctrl 键，然后单击 Ctrl-OK 在软件的“板加载/卸载”对话框中。
- 选择成像参数
- 在HCS成像系统中，打开 靶点激活 在Cellomics生物应用界面中选择模式，并使用与（a）细胞核染色和（b）DHE荧光探针数据采集兼容的双通道设置协议创建新方案。在本方案中，滤光片 386_BGSRS_BGSRS、480_BGS_RS 和 386_BGS_RS 是 分别用于 (a) Hoechst 33342 核染色、(b) 总活性氧（ROS）生成检测，以及 (c) 超氧阴离子自由基检测。这些滤光片的选择依据是本实验方案中所用染料（DAPI 和 DHE）各自发射光谱特性的特定重叠情况。
注意：滤光片的命名规则，例如 386-23_BGRFRN_BGRFRN，表示使用中心波长为 386 nm、带宽为 23 nm 的激发光照射样品，随后使用二向色镜滤光片透射特定波长范围的蓝光（B）、绿光（G）、红光（R）、远红光（FR）和近红外光（N）；而 386_BGS_RS 则表示在二向色镜之后使用的发射滤光片，用于透射 BGS 和 RS 波长范围的发射光。 - 在软件协议界面中指定图像采集过程的目标参数，例如根据需要选择10倍或20倍放大倍数。
- 根据实验所需的成像细节水平和分辨率，选择合适的物镜放大倍数。然而，每个物镜的分辨率是固定的，若需更高分辨率的细节，则必须更换平台上的物镜。在本方案中，使用的是20倍、数值孔径（NA）0.45的物镜，该物镜属于本方案所用的高内涵筛选平台的一部分。
注意：20倍物镜在成像分辨率细节与捕获随时间变化的活性氧（ROS）所需的采集速度之间提供了良好的平衡。虽然可选择更高放大倍数的物镜（例如40倍），但这将导致采集时间延长。 - 根据实验方案的具体要求，设置图像采集相机的曝光参数，例如曝光时间、相机像素合并（binning）和z轴扫描间隔。
注意：曝光时间（通常以毫秒计）取决于所用特定荧光染料的信号强度和灵敏度，且可能因染料浓度和染色质量的不同而在不同实验间略有差异。在本方案中，采集参数设定如下：目标百分比为35%，图像采集模式为1104 × 1104（2×2像素合并），物镜为20倍、0.45 NA。这些参数可根据具体实验条件进行调整。
- 在HCS成像系统中，打开 靶点激活 在Cellomics生物应用界面中选择模式，并使用与（a）细胞核染色和（b）DHE荧光探针数据采集兼容的双通道设置协议创建新方案。在本方案中，滤光片 386_BGSRS_BGSRS、480_BGS_RS 和 386_BGS_RS 是 分别用于 (a) Hoechst 33342 核染色、(b) 总活性氧（ROS）生成检测，以及 (c) 超氧阴离子自由基检测。这些滤光片的选择依据是本实验方案中所用染料（DAPI 和 DHE）各自发射光谱特性的特定重叠情况。
- 成像配置参数
注意：成像参数设置完成后，可使用软件界面启动图像采集过程。- 图像采集参数
- 使用仪器中提供的不同算法（光学 - 等值分割法、固定阈值法和三角法）识别目标主要追踪对象（细胞核）。
注意：本方案采用等值线阈值法（isodata method）对主要目标物进行识别和标记。 - 根据形状或强度参数对物体（如有）进行分割。
- 根据每种细胞类型特有的大小、形状和强度参数，对主要对象进行验证。
- 然后，在该主要对象周围定义“感兴趣区域”（ROI）。
注意：ROI（感兴趣区域）是数据采集的一个关键参数，用于定义荧光染料强度在不同细胞类型间保持一致且可重复的区域位置。ROI确定了针对每个主要追踪对象（即细胞）在仪器不同通道中所测量的关键参数（如染料强度）。ROI可定义为围绕每个细胞核的圆形或环形区域。HCS软件会自动对已分割并进行自动化分析的每个细胞，在ROI范围内获取通道2中DHE荧光染料标记的强度值。 - 在主要对象（细胞核）周围设置一个20 µm的圆形区域。本研究中选择20 µm的距离，是基于本实验方案所用各种细胞系（HepG2、JHH-4和HUH-7）的近似大小。围绕细胞设置的20 µm环形感兴趣区域（ROI）能够以一致且可重复的方式获取荧光强度。
注意：选择感兴趣区域（ROI）的关键参数是能够充分覆盖细胞区域；圆形ROI的大小取决于细胞尺寸。较大的细胞可能需要较大的ROI，而较小的细胞则相反。这些参数必须针对每种细胞类型和目标荧光染料预先确定。
- 使用仪器中提供的不同算法（光学 - 等值分割法、固定阈值法和三角法）识别目标主要追踪对象（细胞核）。
- 图像采集参数
- 群体特征描述及用于存储的选择性特征
- 在高内涵筛选成像方案中定义各项采集参数后，将高内涵筛选系统设置为数据采集模式。
- 本方案的图像采集参数设置如下：每孔扫描上限为1000个细胞，每个视野至少需检测到10个目标（细胞）。
注意：每个孔检测的视野数量由最终细胞计数达到1000个细胞确定。高内涵筛选系统将持续搜索孔内不同位置，直至获得每孔1000个细胞的目标细胞群体。因此，采集速度取决于细胞融合度以及96孔板中每个孔内的总细胞数量。在本实验方案中，从每个孔收集通道2（代表超氧阴离子和总活性氧生成）的总强度和平均强度，用于后续分析。
- 图像采集、处理与分析
- 在调整并确定图像采集参数后，启动每块96孔板的扫描过程。
注意：Cellomics CX7 成像系统能够以高通量方式对多种参数的样本进行高内涵筛选和自动化分析，包括细胞内活性氧（ROS）的产生。除了 ROS 生成外，高内涵筛选（HCS）系统还能提供有关细胞形态、亚细胞定位以及其他多种感兴趣细胞特征的额外有价值信息。在优化采集条件后，HCS 成像平台可对细胞参数进行系统、定性和定量的稳健表征。 - 扫描过程完成后，启动 查看分析 软件并将各种定量数据参数以 .csv 格式导出，以便进行进一步分析。
- 使用第三方软件，复制并粘贴感兴趣的各项定量数值，以进行后续分析。
注意：在本实验方案中，使用 GraphPad Prism 软件分析由 H 诱导的氧化应激条件下的 DHE 荧光强度值2O2 以及甲萘醌暴露。
- 在调整并确定图像采集参数后，启动每块96孔板的扫描过程。
- 数据与统计分析
- 计算通道2的平均平均强度（代表总ROS值和超氧阴离子自由基）。
注：所有用于计算强度值的实验均在每个给药水平下重复三次，每次设6个复孔。 - 采用单因素方差分析（one-way ANOVA）或 t 检验来评估不同测试条件下强度值之间的差异。
- 计算通道2的平均平均强度（代表总ROS值和超氧阴离子自由基）。
结果
二氢乙啶（DHE）是一种对超氧阴离子响应的荧光染料，可提供有关细胞内活性氧（ROS）状态的特异性信息。DHE染料本身在细胞质中发出蓝色荧光；然而，当其与超氧自由基相互作用后，会转化为2-羟基乙啶，后者在红色波长范围内发射荧光。>550 nm）（图1）。DHE染料可轻易进入细胞及细胞核，其发出的荧光可用大多数实验室常见的荧光显微镜装置进行观察。在本研究中，采用高内涵筛选平台，检测了DHE染料在多种肝细胞癌细胞系（HUH7、JHH4和HepG2细胞）中作为活性氧（ROS）生成探针的适用性。细胞以两种ROS生成剂——（a）过氧化氢和（b）甲萘醌，进行剂量依赖性处理，处理时间为30分钟（见 图2 和 图3 用于给药细节）以在细胞中诱导氧化应激，随后在96孔板中进行DHE染料标记。两种H2O2 且甲萘醌以剂量依赖性方式显著增强了所有三种细胞系的荧光强度。利用高通量筛选平台中的图像分割与定量算法，对每孔1000个细胞中由活性氧诱导的DHE荧光强度进行了定量分析，共设置六个重复孔。实验独立重复三次，结果合并后进行分析。Hoechst 33342核染料在确定贴壁细胞所在焦平面方面发挥了重要作用。此外，2-OH-E+ 和 E+ 可在高通量筛选平台上分别检测到受试细胞的细胞核和细胞质中的荧光（参见 图4).
暴露于 H2O2 后，所有分析的细胞系中 ROS 诱导的荧光强度均呈剂量依赖性显著增加（见图2；下图）。然而，在甲萘醌处理的情况下未观察到这种剂量依赖性反应。在甲萘醌处理中，JHH4 细胞系显示出荧光强度的剂量依赖性增加，而在 HepG2 和 HUH7 细胞系中，仅在较高浓度的甲萘醌处理下才观察到荧光强度的显著差异（见图3；下图）。这些 ROS 生成反应的差异可能是由于 H2O2 和甲萘醌产生 ROS 的机制不同所致。H2O2 通过更直接的方式（例如，通过过氧化物酶和过氧化氢酶等抗氧化酶的作用）触发细胞内 ROS 的形成，而甲萘醌则被认为通过诱导线粒体功能障碍以间接方式产生 ROS 物种。由于甲萘醌产生 ROS 的机制较为间接，DHE 荧光可能需要更长时间才能显现。这些结果表明，依赖 ROS 的 DHE 荧光对氧化应激暴露的持续时间、浓度以及细胞类型均具有敏感性。因此，针对每种特定细胞类型优化实验方案是必不可少的。更重要的是，本方案证明了 DHE 染料可用于高通量检测 ROS，这在毒理学、癌症生物学和药物筛选等领域具有重要应用价值。
图1：DHE荧光分子经氧化转化分别生成2-羟基乙锭（2-OH-E+）和乙锭（E+）的反应通路示意图。 2-OH-E+ 和 E+ 的荧光发射光谱在480 nm激发波长下存在重叠。请点击此处查看该图的高清版本。
图 2：过氧化氢处理以剂量依赖方式增加细胞内活性氧水平。肝细胞癌细胞系——(A) HUH7、(B) JHH4 和 (C) HepG2 在 30 分钟内分别用 250 µM、500 µM、750 µM 和 1000 µM 的 H2O2 处理。随后在培养基中加入 DHE（10 µM）染料染色 30 分钟，并用 Hoechst 33342 进行细胞核染色。每孔总计数 1000 个细胞。在所有三种细胞系中均观察到 DHE 荧光信号呈线性、剂量依赖性升高（上图）。在所有细胞系中，当剂量达到 500 µM 及以上时，荧光信号的增加具有统计学显著性（下图）。每组数据来自三次独立实验（n = 3），取 96 孔板中六次重复的平均值。通过单因素方差分析（one-way ANOVA）将处理组与未处理组进行比较（**** - p < 0.0001，*** - p < 0.001；图像比例尺 - 50 µm）请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：甲萘醌处理以剂量依赖方式增加细胞内活性氧水平。 肝细胞癌细胞系——(A) HUH7、(B) JHH4 和 (C) HepG2——用 25 µM、50 µM、75 µM 和 100 µM 的甲萘醌处理 30 分钟。随后在培养基中加入 DHE（10 µM）染料染色 30 分钟，并进行 Hoechst 33342 核染色。每孔计数 1000 个细胞。在所有三种细胞系中均观察到 DHE 荧光信号呈线性、剂量依赖性增强（上图）。在最高剂量（100 µM）下，荧光信号的增加具有统计学显著性（下图）。不同细胞系对剩余剂量的甲萘醌反应存在差异（JHH4 > HUH7 > HepG2）。每组数据来自三次独立实验（n = 3），在 96 孔板中每组设六个重复，取平均值。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）将处理组与未处理组进行比较（**** - p < 0.0001，*** - p < 0.001；图像比例尺：50 µm）请点击此处查看该图的放大版本。
图4：单细胞DHE荧光 - 显示经（A）过氧化氢和（B）甲萘醌处理30分钟后观察到的DHE荧光变化的局部放大图像。可见不同细胞中DHE荧光在细胞质和细胞核中的变化。同时可见高内涵筛选平台生成的自动分割掩膜。图像比例尺 - 10 µm。放大倍数 - 20x。 请点击此处查看该图的高清版本。
补充图1：响应过氧化氢的超氧阴离子驱动DHE荧光成像。 肝细胞癌细胞——（A）HUH7、（B）JHH4 和 （C）HepG2——用 250 µM、500 µM、750 µM 和 1000 µM 的 H2O2 处理 30 分钟。随后，细胞在培养基中用 DHE（10 µM）染料染色 30 分钟。接着用 386 nm LED 照明细胞，并在 >560 nm 处收集荧光图像。未进行核复染，以避免光谱串扰。在 >500 µM 剂量下观察到 DHE 荧光呈剂量依赖性增强。紫外光激发的 DHE 荧光主要归因于超氧自由基的大量产生。每组数据来自两次独立实验（n = 2），在 96 孔板中各设六个重复，取其平均值。使用单因素方差分析将处理组与未处理样本进行比较（**** - p < 0.0001，*** - p < 0.001；图像比例尺 - 50 µm）请点击此处下载该文件。
补充图 2：检测萘醌诱导的超氧阴离子驱动型 DHE 荧光反应 — 肝细胞癌细胞 — （A）HUH7、（B）JHH4 和（C）HepG2 用 25 µM、50 µM、75 µM 和 100 µM 剂量的萘醌处理 30 分钟。随后在培养基中加入 DHE（10 µM）染料染色 30 分钟。与过氧化氢类似，观察到 DHE 荧光呈剂量依赖性增强。每组数据来自两次独立实验（n = 2），在 96 孔板中取六个重复的平均值。采用单因素方差分析将处理组与未处理样本进行比较（**** - p < 0.0001，*** - p < 0.001；图像比例尺 — 50 µm）请点击此处下载该文件。
讨论
本研究建立了一种在高内涵筛选系统上利用二氢乙啶（DHE）荧光染料检测超氧阴离子驱动的细胞内活性氧（ROS）生成的实验方案。目前文献中大多数现有方案均采用DCFH-DA作为荧光成像探针来定量ROS。然而，多项研究表明，DCFH-DA并非检测细胞内ROS的理想探针。其不适合作为探针的原因包括：（i）DCFH-DA不与H2O2发生直接反应，因此不适合用于评估细胞内H2O2水平；（ii）多种单电子氧化物，如OH.、NO2.和ONOO-，均可将DCFH氧化为DCF.；（iii）过渡金属、细胞色素c和血红素过氧化物酶可在氧气和H2O2存在下促进DCFH的氧化；（iv）最重要的是，DCFH-DA会产生中间产物DCFH.-/DCF.，该产物在氧气存在下可诱导额外超氧阴离子的生成。这些超氧阴离子与O2.-发生歧化反应，进一步生成H2O2，可能导致荧光强度出现人为假象的升高，从而错误地高估ROS水平。多位研究者已指出，使用DCFH-DA作为检测细胞内H2O2及其他ROS物种的荧光探针并不可靠8,9,10,11,12,13,14。
与DCFH-DA不同，DHE特异性地与超氧阴离子自由基反应，生成荧光产物2-羟基乙啶（2-OH E）+）。非超氧化物的活性氧物种也可与DHE反应，生成第二种荧光产物——溴化乙锭（E+）。尽管2-OH-E的荧光光谱+ 和 E+ 相对相似，但这两个分子代表了细胞内活性氧（ROS）与DHE特异性相互作用的终产物，并负责因氧化应激在细胞内观察到的总荧光强度。一些研究指出，在较短的紫外波长范围内选择性激发（<400 nm）可能对2-OH乙锭的激发更具特异性（相对于E而言）+）因此，超氧自由基的产生7,12,14。通过仅使用386 nm LED光激发细胞来评估这一现象。与480 nm波长激发相比，在560 nm波长处观察到发射强度降低（见 补充图1 和 补充图2）。然而，无法确定该现象完全归因于2-OH Ethidium的荧光，这反映出当前方法可能存在一定局限性。其他研究显示，紫外激发（如386 nm）也可能同时引起Ethidium的荧光发射，尽管其强度低于2-OH Ethidium7,15尽管如此，我们的实验方案确立了DHE作为更优的染料，用于通过高内涵成像与筛选系统定量检测大多数细胞内活性氧生成的差异。
与DCFH-DA中所见的中间活性氧生成驱动分子不同，DHE缺乏此类中间驱动分子，这被认为是在评估细胞内活性氧（ROS）生成时使用DHE的一大优势。然而，DHE荧光的这一机制目前尚未完全确立。在需要对ROS水平进行精确定量的情况下，建议采用其他正交的定量验证方法，例如高效液相色谱（HPLC）和/或液相色谱-质谱联用（LC-MS）方法，以准确估算细胞内2-OH-E+的含量8,9,13。但需注意，HPLC和LC-MS方法必然涉及细胞的聚集与溶解处理，因此在这些方法中，当前方案所依赖的基于荧光成像的空间-时间信息将会丢失，这也凸显了基于成像的ROS检测方法的主要优势。DHE荧光发生红移的另一个优势在于，其发射的较长波长光（红光）能量较低，因而对细胞的毒性较小。
通过使用甲萘醌和过氧化氢作为氧化应激诱导剂，验证了DHE荧光测定细胞内活性氧（ROS）相对变化的剂量依赖性。选择甲萘醌和过氧化氢作为测试物质，是因为它们诱导ROS和氧化应激的机制各不相同20,21。甲萘醌暴露引起的ROS产生是间接的（通过线粒体功能障碍），而H2O2则以更直接的方式引发氧化应激。随着甲萘醌浓度的增加，DHE荧光信号呈线性、可重复且剂量依赖性增强。与甲萘醌类似，H2O2是一种已知的ROS诱导剂，可通过芬顿反应直接生成羟基自由基（OH.）22。在H2O2处理后，DHE荧光同样表现出线性和剂量依赖性响应。由于DHE对超氧阴离子自由基具有特异性，它并不直接与H2O2反应；相反，细胞内最初产生的超氧阴离子自由基会与H2O2反应，通过哈伯-韦斯反应和芬顿反应生成如羟基自由基等次级ROS物种，这些产物随后被DHE荧光检测到23。本实验方案通过测量两种不同氧化物质作用下主要的细胞内ROS生成情况，建立了DHE荧光发射光谱8,13。这些结果证实了荧光染料DHE在利用高通量筛选方法检测和定量细胞内ROS水平方面具有更高的应用价值。
DHE 具有优异的选择性、灵敏度和光学特性，使其成为以高通量方式研究活性氧（ROS）生成及氧化损伤的有力替代方法，这一点已在本实验方案中得到证实。我们实验室的后续研究将进一步探索在高通量条件下，DHE 作为 ROS 标记物在不同生理和病理状态下 ROS 与细胞信号转导机制之间交叉反应中的作用。
披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
RK 和 RRG 获得了美国国立卫生研究院普通医学科学研究所（NIH NIGMS）资助项目 P20 GM130422 通过新墨西哥大学金属生物学与医学中心（CMBM）提供的资助。RRG 还获得了 NM-INSPIRES P30 资助项目 1P30ES032755 提供的试点资助。CX7 Cellomics 仪器的影像核心支持由美国国立卫生研究院资助项目 P20GM121176 资助的 AIM 中心核心设施提供。 我们衷心感谢 Sharina Desai 博士和 Li Chen 博士在使用 CX7 Cellomics 成像平台过程中对技术问题提供的宝贵帮助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 离心管 | VWR | 20170-038 | |
| 96孔板 | Corning Costar | 07-200-90 | |
| Cellomics Cx7 | ThermoFisher | HCSDCX7LEDPRO | |
| 胶原蛋白 | Advanced Biomatrix | 5056 | |
| DHE（二氢乙啶） | ThermoFisher | D1168 | |
| DMEM | Sigma | 6046 | |
| FBS | VWR | 97068-085 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | 版本 6.0 | |
| HepG2 细胞系 | ATCC | ||
| Hoechst | ThermoFisher | 33342 | |
| HUH7 细胞系 | ATCC | ||
| 过氧化氢 | Sigma | 88597 | |
| JHH4 细胞系 | ATCC | ||
| 甲萘醌 | Sigma | M5625 |
参考文献
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