本方案描述了一种利用二氢乙啶（DHE）作为荧光染料探针，通过高通量筛选方法定量检测细胞内活性氧（ROS）的新方法。该方案详细介绍了在三种不同的人肝细胞癌细胞系中定量评估细胞内活性氧（ROS）的实验方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
活性氧（ROS）在生理和病理过程中对细胞代谢的调控起着关键作用。生理条件下的活性氧生成在细胞正常功能（如增殖、信号传导、凋亡和衰老）的时空调控中具有核心地位。相反，活性氧的长期过度产生则与多种疾病相关，包括癌症、心血管疾病和糖尿病等。因此，以准确且可重复的方式定量活性氧水平对于理解细胞正常功能至关重要。基于荧光成像的方法是表征细胞内活性氧种类的常用手段。文献中许多活性氧检测方案使用2'-7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）染料。然而，该染料在使用和结果解读方面存在显著局限性。本方案展示了二氢乙啶（DHE）荧光探针作为一种替代方法，在高通量条件下定量总活性氧生成的应用。本研究采用CX7 Cellomics高通量成像平台对活性氧的生成进行测量和定量分析。实验在三种肝细胞癌细胞系——HepG2、JHH4和HUH-7中进行。本方案详细描述了细胞内活性氧评估所涉及的各项操作步骤，包括DHE溶液的配制、细胞与DHE溶液的孵育，以及用于表征活性氧生成所必需的DHE荧光强度的测定。本方案表明，DHE荧光染料是一种稳健且可重复用于高通量检测细胞内活性氧生成的方法。高通量活性氧检测方法可能在毒理学、药物筛选和癌症生物学等多种研究中发挥重要作用。
引言
活性氧（ROS）是一类在正常细胞代谢过程中自然产生、具有高度反应性且存在时间短暂的化学自由基 细胞。活性氧（ROS）在调控细胞内正常的生理和生化过程中发挥着关键且必不可少的作用1,2细胞内活性氧（ROS）产生的主要来源是线粒体电子传递链（ETC）途径，这是正常生物能量循环的一部分。其他重要的ROS产生来源包括细胞内的酶促反应，例如NADPH氧化酶的作用。食物分子（如葡萄糖）的代谢通过线粒体基质中的氧化磷酸化途径进行。基础水平的ROS产生对于调控正常的生理细胞信号传导过程至关重要。已知许多参与葡萄糖代谢信号通路的关键蛋白分子（如Akt和PTEN）会响应细胞内ROS水平的变化。此外，多种细胞内酶也会在细胞酶促途径中产生ROS，这些酶包括黄嘌呤氧化酶、一氧化氮合酶以及过氧化物酶体组分。1,2与活性氧（ROS）的天然来源不同，某些环境因素（如异生物质、病原体、紫外线、污染、吸烟和辐射）也会导致ROS过度产生，这是细胞内氧化应激的关键驱动因素。1,3细胞内氧化应激水平升高可导致细胞内天然生物分子（如脂质、蛋白质和DNA）受损，从而引发癌症、糖尿病、心血管疾病、慢性炎症及神经退行性疾病....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 细胞培养
- 将测试细胞（HepG2、HUH7 和 JHH4 肝细胞癌细胞）以每孔 10,000 个细胞的接种密度接种于 96 孔板中，每孔终体积为 200 µL。
- 在培养 HepG2 细胞前，需用 IV 型胶原蛋白（50 µg/mL）在室温（RT）下对 96 孔板的孔进行 2 小时的包被处理。为防止胶原蛋白原液凝固，应将原液置于冰上，并在此条件下开始稀释至所需浓度。
- 经过 2 小时孵育后，吸除多余胶原蛋白溶液，并用 1× PBS 洗涤孔壁三次。
- 将细胞在含 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）的湿润培养箱中，于 37 °C 及 5% CO2 条件下培养过夜。
- 次日或当细胞融合度达到 80%–90% 时（以先到者为准），分别用 H2O2 （未处理、250 µM、500 µM、750 µM 和 1000 µM）以及 Menadione（未处理、25 µM、50 µM、75 µM、100 µM）处理细胞 30 分钟，以诱导典型的氧化应激反应。
- 或者，也可选择使用其他能够诱导细胞内氧化应激的待测物质进行测试。
2. 细胞DHE染色用储备液及稀释液的配制
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
二氢乙啶（DHE）是一种对超氧阴离子响应的荧光染料，可提供有关细胞内活性氧（ROS）状态的特异性信息。DHE染料本身在细胞质中发出蓝色荧光；然而，当其与超氧自由基相互作用后，会转化为2-羟基乙啶，后者在红色波长范围内发射荧光。>550 nm）（图1）。DHE染料可轻易进入细胞及细胞核，其发出的荧光可用大多数实验室常见的荧光显微镜装置进行观察。在本研究中，采用高内涵筛选平台，检测了DHE染料在多种肝细胞癌细胞系（HUH7、JHH4和HepG2细胞）中作为活性氧（ROS）生成探针的适用性。细胞以两种ROS生成剂——（a）过氧化氢和（b）甲萘醌，进行剂量依赖性处理，处理时间为30分钟（见 图2 和 图3 用于给药细节）以在细胞中诱导氧化应激，随后在96孔板中进行DHE染料标记。两种H2O2 且甲萘醌以剂量依赖性方式显著增强了所有三种细胞系的荧光强度。利用高通量筛选平台中的图像分割与定量算法，对每孔1000个细胞中由活.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本研究建立了一种在高内涵筛选系统上利用二氢乙啶（DHE）荧光染料检测超氧阴离子驱动的细胞内活性氧（ROS）生成的实验方案。目前文献中大多数现有方案均采用DCFH-DA作为荧光成像探针来定量ROS。然而，多项研究表明，DCFH-DA并非检测细胞内ROS的理想探针。其不适合作为探针的原因包括：（i）DCFH-DA不与H2O2发生直接反应，因此不适合用于评估细胞内H2O2水平；（ii）多种单电子氧化物，如OH.、NO2.和ONOO-，均可将DCFH氧化为DCF.；（iii）过渡金属、细胞色素c和血红素过氧化物酶可在氧气和H2O2存在下促进DCFH的氧化；（iv）最重要的是，DCFH-DA会产生中间产物DCFH.-/DCF.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
RK 和 RRG 获得了美国国立卫生研究院普通医学科学研究所（NIH NIGMS）资助项目 P20 GM130422 通过新墨西哥大学金属生物学与医学中心（CMBM）提供的资助。RRG 还获得了 NM-INSPIRES P30 资助项目 1P30ES032755 提供的试点资助。CX7 Cellomics 仪器的影像核心支持由美国国立卫生研究院资助项目 P20GM121176 资助的 AIM 中心核心设施提供。 我们衷心感谢 Sharina Desai 博士和 Li Chen 博士在使用 CX7 Cellomics 成像平台过程中对技术问题提供的宝贵帮助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 离心管 | VWR | 20170-038 | |
| 96孔板 | Corning Costar | 07-200-90 | |
| Cellomics Cx7 | ThermoFisher | HCSDCX7LEDPRO | |
| 胶原蛋白 | Advanced Biomatrix | 5056 | |
| DHE（二氢乙啶） | ThermoFisher | D1168 | |
| DMEM | Sigma | 6046 | |
| FBS | VWR | 97068-085 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | 版本 6.0 | |
| HepG2 细胞系 | ATCC | ||
| Hoechst | ThermoFisher | 33342 | |
| HUH7 细胞系 | ATCC | ||
| 过氧化氢 | Sigma | 88597 | |
| JHH4 细胞系 | ATCC | ||
| 甲萘醌 | Sigma | M5625 |
参考文献
- Juan, C. A., et al. The chemistry of reactive oxygen species (ros) revisited: Outlining their role in biological macromolecules (DNA, Lipids and Proteins) and induced pathologies. Int J Mol Sci. 22 (9), 4642(2021).
- Magnani, F., et al.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
