方法文章

二维液相色谱-质谱联用技术结合分子网络法用于鉴定藏药Aconitum pendulum 中的化学成分

DOI：

10.3791/66239

⸱

2023年12月8日

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1Ethnic Medicine Academic Heritage Innovation Research Center, Meishan Hospital, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Chemical Biology & Traditional Chinese Medicine Research, Ministry of Education, 4Key Laboratory of Phytochemical R&D of Hunan Province, Hunan Normal University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本研究采用二维高效液相色谱-质谱联用技术（2D-HPLC-MS）结合分子网络分析方法，解析藏药植物Aconitum pendulum Busch（APB）复杂的化学成分。本文提供了一套系统探索和鉴定草药复杂化学成分的详细实验方案。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究采用了一种综合方法，结合二维高效液相色谱-质谱（2D-HPLC-MS）技术与分子网络分析，以解析藏药植物APB复杂的化学成分。通过实施二维高效液相色谱，实现了对复杂混合物的增强分离，从而能够分离出单个化合物用于后续分析。分子网络方法进一步有助于阐明这些化合物之间的结构关系，有助于鉴定潜在的生物活性分子。该整合策略高效地鉴定了植物中存在的多种化学成分。研究结果揭示了APB中存在多样化的化学组分，包括生物碱等。本研究不仅加深了对这种传统藏药植物化学成分的认识，也为探讨其潜在治疗特性提供了有价值的线索。二维高效液相色谱-质谱联用分子网络分析被证明是系统探索和鉴定草药中复杂化学成分的有力工具，为天然产物发现领域的进一步研究与开发奠定了基础。

引言

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藏医药是中国传统医学的重要组成部分，遵循藏医的诊疗原则，用于疾病的预防与治疗1。然而，藏药植物化学成分复杂，且含量波动显著，对其中关键活性成分的认知不足已成为藏医药现代化发展的瓶颈2。液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）结合了色谱强大的分离能力和质谱的高度灵敏性，已广泛应用于天然药物分析3。然而，由于单一分离机制的局限性，结构高度相似的组分在一维液相色谱分离中容易共洗脱。在后续的质谱分析中，低丰度共洗脱组分常因高丰度组分引起的离子抑制效应而难以被检测4。

二维高效液相色谱法（2D-HPLC）是一种新型色谱技术，通过使用一对色谱柱，将不同的分离机制有机结合。该方法包括正相色谱与反相液相色谱的融合或交替使用，以及亲水相互作用液相色谱与反相液相色谱的结合5。通过整合这些互补的色谱特性，显著提升了分离能力，有效解决了复杂样品基质带来的分析难题6。此外，将二维色谱与质谱（MS）联用，可充分结合2D-HPLC强大的分离能力和MS的高灵敏度检测优势，为复杂药物体系及其基本组分的研究提供有力支持7,8,9。

藏药通常具有多种成分和功能，其中活性成分往往以复杂的组分形式存在，且浓度极低。通过将二维液相色谱（2D-LC）作为高效的分离系统，并结合质谱（MS）这一超高灵敏度检测器，能够更有效地应对复杂样品在分离与鉴定方面的挑战10,11,12。该联用技术显著推动了藏药化学成分研究的深入发展。

无论是传统的液相色谱-质谱（LC-MS）还是二维液相色谱-质谱（2D-LC-MS），均可获得大量信息。然而，从如此庞大的数据中提取复杂体系组分的结构信息始终是一项重大挑战。因此，研究人员已开发出多种用于筛选和挖掘质谱数据的方法。全球天然产物社会分子网络（Global Natural Products Social Molecular Networking, GNPS）是一个质谱/质谱（MS/MS）数据组织与可视化平台，可上传二维液相色谱-质谱的质谱数据13。每个质谱图被视为一个向量，并通过余弦相似性与其他所有质谱图进行比较。当两个质谱图之间的相似性超过设定阈值时，它们将在分子网络（MN）中相互连接。该方法可用于快速鉴定已知化合物，并确定多种未知天然产物14。

藏药通常具有多种功能，但其成分复杂且浓度差异显著，使得功能与物质基础之间的关系难以有效阐明15。深入研究藏药需要对尽可能多的化学成分进行系统表征。在本研究框架中，我们以藏药APB为研究对象，旨在展示利用二维高效液相色谱-质谱联用技术（2D-HPLC-MS）和分子网络技术（MN）系统研究藏药复杂化学成分的策略与流程。在构建二维色谱系统时，我们结合了分离机制差异显著的反相液相色谱和亲水相互作用液相色谱，以实现对APB复杂成分更有效的分离16。此外，为克服两维之间溶剂不兼容的问题，采用了柱上稀释调节模式。通过将二维液相色谱强大的分离能力与质谱的高灵敏度检测能力相结合，更有效且全面地获取了APB中复杂成分的质谱信息。进一步利用分子网络技术对大量质谱数据进行网络化和可视化处理，系统分析APB中的化学成分。本研究所展示的策略与流程有望应用于其他藏药的研究，推动藏药物质基础的探索，对促进藏药资源开发及提升藏药材质量控制标准具有重要意义17。整体实验流程见图1。

在本实验中，一种新型的柱上稀释调制器被引入到安捷伦二维液相色谱（2D-LC）系统18中。通过增加一个独立的输送泵，改变了分析流程，从而实现了二维液相色谱分析的高度正交性。两个维度之间的耦合与切换由两个六通阀完成，如图2所示。当第一维填充一个样品环时，第二维同时分析另一个样品环。这意味着一维样品环的填充时间与二维的运行时间相等。这要求二维修二元泵能够产生快速梯度。在对全部流出液进行分析时，不会丢失任何峰，这对于未知样品的分析尤为有利。但由此会产生大量二维色谱图，需在数据分析时进行整合。

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方案

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1. 准备

  1. 样品制备
    1. 使用万分之一精度天平在3 mL微量离心管中称取0.25 g（干重）APB，加入2.5 mL甲醇，然后超声30 min（功率240 W，频率40 kHz）。
    2. 以1.2 × g 离心5 min，收集上清液，并通过孔径0.22 µm的膜过滤器过滤。
  2. 实验材料准备
    1. 配制二维流动相，以乙腈作为有机相B相，以0.1%甲酸超纯水配制水相A相。
    2. 对两相进行0.22 µm滤膜过滤，并使用超声仪（40 kHz）超声15 min。冲洗更换后的流动相以去除气泡。本实验中，C18色谱柱作为一维柱，亲水色谱柱作为二维柱，并将色谱柱安装至仪器上。
  3. 调节合适的分流比
    1. 将二维液相色谱仪的出口通过三通连接至质谱进样口，三通的另一端连接分流管路。调节流速至合适值，确保进入质谱的流速为0.3–0.5 mL/min。
      ​注意：由于二维液相色谱的第二维流速通常设定在2 mL/min以上，该流速对质谱而言过高，因此需要进行分流。

2. 二维液相色谱操作

  1. 双击 Instrument 1 Online 图标，化学工作站将自动与1260 LC通信并进入工作站界面。
  2. 进行二维液相色谱（2D-LC）方法参数设置时，从 View 菜单中选择 Method and Run Control 界面以调用所需界面，该界面通常默认进入。点击进样器模块，右键点击 Method，设置1D泵的进样体积、流速和流动相时间梯度。
  3. 在 Stop Time 下输入样品运行时间。点击主菜单 Instrument ，然后在下拉菜单中点击 2D-LC Method 。在 2D-LC Mode 中选择 Comprehensive 模式。在 Modulation 时间中输入2 min，在 2D Gradient Stop 时间中输入1.9 min。将 Flow Settings 设置为2 mL。编辑 2D-Gradient 并设置波长。方法编辑完成后，在 Method 菜单中选择 Save Method As 为新方法命名，然后点击 OK。
    ​注意：外接传输泵需手动设置流速。

3. 质谱操作

  1. 打开真空泵的开关。打开氩气瓶主阀和减压阀，并将压力调节至约 0.3 MPa。打开氮气阀。
  2. 至少等待 8 小时，以确保达到实验所需的足够真空度。在分析前检查氩气和氮气的气压是否充足。
  3. 启动质谱控制软件，在软件面板中点击 Heating SEI Source，并输入质谱参数，包括加热器温度（350 °C）、鞘气流速（35 arb）、辅助气流速（15 arb）、喷雾电压（正离子模式为 3.8 KV，负离子模式为 -2.5 KV）以及毛细管温度（275 °C）。点击 Apply 按钮以激活离子源。
  4. 设置质谱方法时，输入采集时间、极性、质量范围、传输值数量、传输值持续时间等参数。设置 MS 运行时间（分钟）：93.00。配置 ScanEvent 详细信息：ITMS + c norm o (100.0-1200.0)，CV=0.0 V；ITMS + c norm Dep MS/MS，来自（1）的最强离子：激活类型：CID，最小所需信号：500，隔离宽度：2.00，归一化碰撞能量：35.0，默认电荷态：3，激活 Q：0.250，激活时间：93.000。设置数据依赖采集参数时，禁用单独的极性设置，中性丢失前导离子数：3，产物离子前导离子数：3。点击 Save 按钮，将这些设置保存为仪器方法。
    NOTE: 运行结束时间与二维液相色谱（2D-LC）保持一致。
  5. 点击 Sequence Setup 按钮以打开序列表格。在表单中输入样品类型、文件名、路径、样品编号、仪器方法、位置、进样量及其他相关信息。
  6. 点击 Save 按钮保存序列列表，然后点击 Start Analysis 按钮以设置并启动质谱采集。同时，在二维液相色谱（2D-LC）仪器上点击 Run Control，并选择 Run Method。与此同时，质谱仪器也需点击 Run 按钮。
    ​NOTE: 由于本实验中二维液相色谱（2D-LC）与质谱（MS）并非由同一软件控制，因此需要分别在两台仪器上独立进行设置。

4. 分子网络操作

  1. 数据准备：导出二维高效液相色谱-质谱（2D-HPLC-MS）原始质谱数据，并通过 ProteoWizard 的 Msconvert 工具将二级质谱数据转换为 mzXML 或 mzML 格式。（http://proteowizard.sourceforge.net/）。
  2. 为上传数据，请在官方网站下载 WinSCP 软件，并使用 FTP 协议将 mzML 数据上传至 GNPS 创建的账户。安装完成后，启动 WinSCP。
  3. 连接 GNPS FTP 服务器：在 WinSCP 界面的会话配置页面中，填写以下连接信息：文件协议：选择 FTP；主机名：输入 massive.ucsd.edu，端口号：保持默认的 22。
  4. 输入账号和密码。填写完上述信息后，点击登录按钮，以建立与 GNPS FTP 服务器的连接。
  5. 通过打开网页浏览器并访问 GNPS 网站（https://gnps.ucsd.edu/）来创建分子网络。新用户需先注册账户，然后登录。
  6. 在 GNPS 网站主界面，点击顶部导航栏中的任务选项卡，从下拉菜单中选择创建新任务。在任务创建页面，点击添加文件按钮，选择并上传数据文件（例如，mzML 格式）。
  7. 在任务参数选项卡中，设置生成分子网络（MN）的各项参数。这些参数包括峰提取算法、峰漂移值、相似性计算方法等。根据需要进行适当的参数设置，然后点击页面底部的启动分析按钮以运行任务。
  8. 任务运行完成后，在任务列表中找到已创建的任务，点击服务名称以查看分析结果。网站将提供分子网络图谱、替代物、共生网络及其他相关信息。

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结果

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采用APB作为模式生物，以验证二维高效液相色谱-质谱（2D-HPLC-MS）技术联合分子网络（MN）方法的可行性。将质谱原始数据导入分子网络（MN）中，并使用默认参数设置，生成了分子网络。分子网络是一种可视化计算策略，可呈现完整液相色谱-串联质谱（LC-MS-MS）实验中检测到的所有分子离子及其之间的化学关系13。

分子网络（MN）基于化合物进入串联质谱（MS-MS）后产生的二级质谱碎片；在相同条件下，结构相似的化合物会产生相似的MS-MS离子碎片，计算机算法通过计算这些质谱数据之间的相似性（以0到1之间的余弦值表示，相似性越高，余弦值越大；即若两个MS-MS质谱图完全不相关，则余弦值为0）14。若两个MS-MS质谱图完全一致，余弦值为1，则根据相似性大小将这些质谱图整合成可视化的网络图。在此MN图中，每个节点代表一个化合物的MS-MS质谱图，节点之间的连接表示两个化合物MS-MS图谱之间的关联性，说明它们在结构上相似或属于同一类化合物。

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讨论

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本实验的主要目标是优化二维液相分离框架中的一种部分方法。为此，一种新型的柱后稀释调制器被无缝整合到二维液相色谱（2D-LC）系统中。这一技术改进至关重要，因为它显著提升了对藏药APB中化学成分的分析能力。通过采用二维高效液相色谱-质谱（2D-HPLC-MS）技术，实现了对APB复杂组分的全面分析。借助二维分离技术的优势，我们在分辨率和灵敏度方面均取得了显著提升，从而成功鉴定并定量了更广泛种类的化合物。

此外，该技术的故障排除也值得讨论。当液相峰形异常时，主要考虑流路中是否存在气泡以及流动相比例是否正常。解决方法是对流动相进行脱气处理，并优化流动相比例。当液相压力异常时，主要考虑堵塞和泄漏问题。解决方法是更换或清洗堵塞部件，并加固泄漏部位。

然而，该方法存在某些局限性，值得关注。由于挥发性成分和油类成分具有特定的理化性质，该方法可能并不完全适用于其分析。尽管存在这些限制，二维分离技术的应用仍代表了分析能力的重要进步。该技术不仅在藏医药研究中具有应用价值，还在药物、天然产物以及环境分析等领域展现出广阔的应用前景。

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披露

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作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

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本工作由国家自然科学基金（82130113）、国家自然科学基金（82204765）、四川省自然科学基金（2022NSFSC1470）、四川省博士后特别资助项目（TB2023020）以及成都中医药大学杏林学者科研提升计划（BSH2021030）资助。这些资金为实验设备、实验材料及出版费用提供了支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙腈Fisher chemicalF22M81203流动相
伏毛铁棒锤//中药材
Agilent 1290 Infinity (II) 2D-LC Agilent TechnologiesG2198-90001液相色谱
一次性注射器成都科恩实验设备/1ml
EP管成都科恩实验设备/3ml
液相进样瓶成都科恩实验设备/1.5ml
LTQ XL 质谱仪Thermo FisherLTQ21991质谱仪
微孔滤膜 成都科恩实验设备/0.22μm
Ultimate XB-C18,5 μm,2.1 x 200 mmWelch00201-31015反相色谱柱
超声波清洗器GT SonicUGT20DEC048Y超声波清洗器 240W 40KHz
XAmide,3 μm,100A大连蒙迪科技D2019110601亲水性色谱柱

参考文献

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