基于聚合酶链反应的乙型肝炎病毒DNA实时检测和定量

Summary

基于实时聚合酶链反应 （PCR） 的乙型肝炎病毒 （HBV） DNA 检测和定量是一种诊断和监测 HBV 感染的灵敏且准确的方法。在这里，我们提出了一种用于HBV DNA检测和样本病毒载量测量的方案。

Abstract

乙型肝炎病毒（HBV）是全球肝病的重要原因。它可能导致急性或慢性感染，使个人极易患致命性肝硬化和肝癌。准确检测和定量血液中的HBV DNA对于诊断和监测HBV感染至关重要。检测HBV DNA的最常用方法是实时荧光定量PCR，可用于检测病毒并评估病毒载量，以监测对抗病毒治疗的反应。在这里，我们描述了使用IVD标记的基于实时PCR的试剂盒检测和定量人血清或血浆中HBV DNA的详细方案。该试剂盒使用靶向 HBV 基因组高度保守的核心区域的引物和探针，可以准确定量所有 HBV 基因型（A、B、C、D、E、F、G、H、I 和 J）。该试剂盒还包括一个内源性内控品，用于监测可能的PCR抑制。该测定运行 40 个循环，其截止值为 38 Ct。 对于临床样品中 HBV DNA 的定量，试剂盒随附一组 5 种定量标准品。这些标准品包含已知浓度的 HBV 特异性 DNA，这些 DNA 是根据 WHO 第 4^个 用于核酸检测的 HBV DNA 国际标准（NIBSC 代码 10/266）校准的。这些标准品用于验证HBV特异性DNA扩增的功能，并生成标准曲线，从而可以定量样品中的HBV DNA。使用PCR试剂盒检测低至2.5 IU/mL的HBV DNA。该试剂盒的高灵敏度和可重复性使其成为临床实验室的强大工具，帮助医疗保健专业人员有效诊断和管理 HBV 感染。

Introduction

乙型肝炎病毒 （HBV） 是一种部分双链 DNA 病毒，来自正肝病毒属和肝萘病毒科 ¹。它可以引发持续一生的慢性感染，可能导致肝硬化和肝细胞癌 ^2,3,4。根据世界卫生组织 （WHO） 的数据，2019 年估计有 2.96 亿人患有慢性乙型肝炎感染，每年有 150 万人新感染⁵.

血清或血浆样本中HBV DNA的鉴定和测量是检测持续乙型肝炎感染个体、评估抗病毒治疗疗效和预测^{治疗成功概率}的宝贵方法6,7,8,9,10,11。高病毒载量与肝病进展的风险增加有关，包括肝硬化和肝癌^12,13

Protocol

这项研究不涉及任何人类参与者或临床样本。唯一使用的生物材料是世卫组织第四条用于核酸检测的HBV DNA国际标准（NIBSC代码10/266）。本标准是公开可用的参考资料，不包含任何个人信息或可识别数据。因此，本研究不需要伦理批准。

1. DNA提取

1. 从人血清或血浆样本中提取病毒DNA。将提取的DNA储存在-20°C，直到进一步用于PCR。
   注:用于 DNA 提取的推荐血清或血浆体积为 500 μL，洗脱体积为 50 μL。在这项研究中，使用病毒核酸提取试剂盒（材料表）提取病毒DNA。

2. 实时荧光定量PCR

1. 在开始PCR之前，在室温（RT;15-25°C）下解冻实时荧光定量PCR试剂盒的所有试剂（表1）。解冻时，通过以中等速度脉冲涡旋 10 秒混合组分，并在室温下以 8,000 × g 离心 15 秒。 将所有解冻的组分放在冷却块上。
2. 反应制备
   1. 根据 表2制备PCR混合物。根据样品数量、标准品和无模板对照计算要添加的试剂的体积。
      注意:制备PCR混合物时，应添加每种试剂至少10%的额外体积（例如，如果需要10个反应，....

Results

从人血浆/血清中检测和定量HBV DNA的工作流程示意图如 图1所示。HBV 和 IC 的标准 2（用作 PC）和 NTC 的扩增曲线如 图 2 所示。 图3 显示了HBV阳性样本、HBV阴性样本和PCR抑制样本的扩增曲线。图 4显示了HBV的扩增曲线、Ct值和获得的HBV浓度（以国际单位/微升（IU/μL）为单位，NIBSC代码为10/266。 图5显示了试剂盒中所有5种HBV标准品的HBV靶标的扩增曲线及其具有代表性的标准品曲线。标准曲线的斜率为-3.361，R² 为0.99996，效率为0.98。所有 5 种 HBV 标准品的 IC 靶标的扩增曲线如 图 6 所示。

Discussion

根据供应商信息^21，NIBSC 代码 10/266 在 0.5 mL 无核酸酶水中复溶时，单位为 9,55,000 IU/mL。这可以被认为是高负荷HBV阳性样本。本研究中使用的病毒载量试剂盒测定的HBV病毒载量为6,65,900 IU/mL（图4）。由于任何DNA提取试剂盒的DNA提取效率都不是100%，因此在纯化过程中经常会丢失一些DNA。尽管试剂盒确定的病毒载量略低于试剂（NIBSC 代码 10/266）供应商的指定值，但数据仍然令人满意，因为两个值之间的 log10 差异仅为 0.157，小于临界值 （0.5）²²。

该协议中使用的病毒载量试剂盒具有高度稳定性，可提供可重复的数据，如 图7所示。在本实验中，所有 5 个标准品和 NTC 一式三份运行，其 Ct 值、平均值、标准偏差和变异系数 （CV%） 如 表 8 所示。如

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4th WHO 乙型肝炎病毒 DNA	国际标准 NIBSC	NIBSC 代码：10/266	乙型肝炎病毒 （HBV） DNA 第 4 项国际标准，NIBSC 代码 10/266，旨在用于校准 HBV 核酸扩增技术 （NAT） 中使用的二级参比试剂。
ABI 实时荧光定量 PCR 仪	赛默飞世尔科技	ABI 7500;QuantStudio 5	这是一台实时 PCR 机器
HBV、HCV 和 HIV 多重检测 14/198	NIBSC	NIBSC 代码：14/198	这是一种非常低阳性的三重试剂，适用于含有乙型肝炎 （HBV）、丙型肝炎 （HCV） 和人类免疫缺陷病毒-1 （HIV-1） 的 NAT 检测
QIAGEN 实时 PCR 机	Qiagen	Rotor-Gene Q	这是一台实时 PCR 机器
TRUPCR HBV 病毒载量试剂盒	Kilpest India Limited	3B294	这是本研究中用于 HBV DNA 检测和病毒载量测定的基于实时 PCR 的试剂盒
TRUPCR 病毒核酸提取试剂盒	Kilpest India Limited	3B214	这是一种用于从 NIBSC：10/266 和 NIBSC：14/198 中提取 HBV 病毒 DNA 的 DNA 提取试剂盒