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基于实时聚合酶链式反应的乙型肝炎病毒DNA检测与定量

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DOI：

10.3791/66249

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2023年12月15日

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13B BlackBio Biotech India Limited

通讯作者： Satyabrata Bag <satya@3bblackbio.com>, Dhirendra Dubey <d.dubey@3bblackbio.com>

本文内容

摘要

基于实时聚合酶链式反应（PCR）的乙型肝炎病毒（HBV）DNA检测与定量是一种用于诊断和监测HBV感染的高灵敏度、高准确性方法。本文介绍了一种用于检测HBV DNA及测定样本中病毒载量的实验方案。

摘要

乙型肝炎病毒（HBV）是全球范围内导致肝病的重要病因，可引起急性或慢性感染，使个体极易发展为致命性肝硬化和肝癌。准确检测和定量血液中的HBV DNA对于HBV感染的诊断与监测至关重要。目前最常用的HBV DNA检测方法是实时PCR，该方法可用于病毒检测及病毒载量评估，从而监测抗病毒治疗的疗效。本文介绍一种使用经IVD认证的基于实时PCR的试剂盒检测和定量人血清或血浆中HBV DNA的详细实验方案。该试剂盒采用针对HBV基因组高度保守的核心区域设计的引物和探针，能够准确量化所有HBV基因型（A、B、C、D、E、F、G、H、I和J）。试剂盒还包含内源性内参对照，用于监测可能发生的PCR抑制。本检测共进行40个循环，其临界值为38 Ct。为实现临床样本中HBV DNA的定量，试剂盒提供了一组5个定量标准品，这些标准品含有已知浓度的HBV特异性DNA，并以世界卫生组织国际标准进行校准th 世界卫生组织乙型肝炎病毒DNA核酸检测国际标准品（NIBSC编号10/266）。该标准品用于验证针对乙型肝炎病毒特异性DNA扩增的检测功能，并建立标准曲线，从而实现对样本中乙型肝炎病毒DNA的定量检测。使用该PCR试剂盒可检测低至2.5 IU/mL的乙型肝炎病毒DNA。该试剂盒具有高灵敏度和良好重复性，是临床实验室中的有力工具，有助于医疗专业人员有效诊断和管理乙型肝炎病毒感染。

引言

乙型肝炎病毒（HBV）是一种部分双链DNA病毒，属于Orthohepadnavirus属和Hepadnaviridae科1。该病毒可引发慢性感染，持续终生，可能导致肝硬化和肝细胞癌2,3,4。根据世界卫生组织（WHO）的数据，2019年约有2.96亿人患有慢性乙型肝炎感染，每年新增感染人数达150万5。

血清或血浆样本中乙型肝炎病毒（HBV）DNA的检测与定量是识别持续性乙型肝炎感染个体、评估抗病毒治疗效果以及预测治疗成功可能性的重要方法6,7,8,9,10,11。高病毒载量与肝脏疾病进展风险增加相关，包括肝硬化和肝癌12<....

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方案

本研究未涉及任何人类受试者或临床样本。所使用的唯一生物材料是4th WHO乙型肝炎病毒DNA核酸检测国际标准品（NIBSC编号10/266）。该标准品为公开可用的参考物质，不包含任何个人身份信息或可识别数据，因此本研究无需伦理审批。

1. DNA 提取

  1. 从人血清或血浆样本中提取病毒DNA。将提取的DNA在-20 °C下保存，直至后续用于PCR。
    ​注意：推荐用于DNA提取的血清或血浆体积为500 µL，洗脱体积为50 µL。本研究中使用病毒核酸提取试剂盒（材料表）进行病毒DNA提取。

2. 实时荧光定量PCR

  1. 解冻所有试剂（表1实时荧光定量 PCR 试剂盒在室温（RT；15–25 °C）下解冻后，短暂涡旋振荡 10 秒（中等速度）混匀各组分，并在 8,000 × g 在室温下持续15秒。将所有解冻的组分置于冷却块上保存。
  2. 反应准备
    1. 按照以下步骤配制PCR反应混合液 表2根据样本、标准品和无模板对照的数量计算需添加的试剂体积。
      注意：配制PCR反应体系时，每种试剂应至....

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结果

检测和定量人血浆/血清中乙型肝炎病毒（HBV）DNA 的工作流程示意图见图1。图2展示了标准品2（作为阳性对照）以及HBV和内参（IC）的无模板对照（NTC）的扩增图谱。图3显示了HBV阳性样本、HBV阴性样本以及存在PCR抑制的样本的扩增曲线。图4展示了NIBSC编码10/266样本的扩增曲线、HBV的Ct值以及测得的HBV浓度（以国际单位每微升，IU/µL表示）。试剂盒中全部5个HBV标准品的HBV靶标扩增曲线及其代表性标准曲线见图5。该标准曲线的斜率为-3.361，R2为0.99996，扩增效率为0.98。图6展示了全部5个HBV标准品的内参（IC）靶标的扩增曲线。

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讨论

根据供应商提供的信息，NIBSC 编码 10/266 在用 0.5 mL 无核酸酶水中重悬后，其赋值为 9,55,000 IU/mL21。该样本可视为高载量的乙型肝炎病毒（HBV）阳性样本。本研究所用病毒载量检测试剂盒测定的 HBV 病毒载量为 6,65,900 IU/mL（图 4）。由于任何DNA提取试剂盒的提取效率均无法达到100%，在纯化过程中通常会损失部分DNA。尽管试剂盒测定的病毒载量略低于试剂（NIBSC 编码 10/266）供应商提供的赋值，但数据仍属满意，因为两者之间的 log10 差值仅为 0.157，低于临界值（0.5）22。

本方案中使用的病毒载量检测试剂盒具有高度的稳健性，并能提供可重复的数据，如图7所示。在本实验中，5个标准品和无模板对照（NTC）均设置三个重复，其Ct值、平均值、标准偏差以及变异系数（CV%）见表8

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披露

作者与本研究中所用乙型肝炎病毒载量检测试剂盒的生产商Kilpest India Limited有关联。

致谢

我们感谢 Praveen、Kusum、Chandan、Isha、Rashmi、Babli、Shivani、Ankita 和 Shikha 提供的技术协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4th 乙型肝炎病毒DNA世界卫生组织国际标准品NIBSCNIBSC 编码：10/266世界卫生组织第四代乙型肝炎病毒（HBV）DNA国际标准品，NIBSC编号10/266，旨在用于乙型肝炎病毒核酸扩增技术（NAT）中二级参考试剂的校准。
ABI 实时荧光定量 PCR 仪 赛默飞世尔科技ABI 7500；QuantStudio 5这是一台实时荧光定量PCR仪 
乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒多重检测 14/198NIBSCNIBSC 编码：14/198这是一种用于HBV、HCV和人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）核酸检测（NAT）的极低阳性三联试剂
QIAGEN 实时荧光定量 PCR 仪QiagenRotor-Gene Q这是一台实时荧光定量PCR仪 
TRUPCR HBV 病毒载量检测试剂盒 Kilpest India Limited3B294本研究中用于HBV DNA检测和病毒载量测定的实时PCR试剂盒
TRUPCR 病毒核酸提取试剂盒Kilpest India Limited3B214这是一种用于从NIBSC:10/266和NIBSC:14/198中提取HBV病毒DNA的DNA提取试剂盒

参考文献

  1. Ryu, W. -S. Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. , Elsevier, Academic Press. (2016).
  2. Lin, X., et al. Chronic hepatitis b virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: Review of disease progression. Journal of Gastroenterology and....

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DNA PCR PCR DNA PCR

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