基于实时聚合酶链式反应的乙型肝炎病毒DNA检测与定量

摘要

基于实时聚合酶链式反应（PCR）的乙型肝炎病毒（HBV）DNA检测与定量是一种用于诊断和监测HBV感染的高灵敏度、高准确性方法。本文介绍了一种用于检测HBV DNA及测定样本中病毒载量的实验方案。

摘要

乙型肝炎病毒（HBV）是全球范围内导致肝病的重要病因，可引起急性或慢性感染，使个体极易发展为致命性肝硬化和肝癌。准确检测和定量血液中的HBV DNA对于HBV感染的诊断与监测至关重要。目前最常用的HBV DNA检测方法是实时PCR，该方法可用于病毒检测及病毒载量评估，从而监测抗病毒治疗的疗效。本文介绍一种使用经IVD认证的基于实时PCR的试剂盒检测和定量人血清或血浆中HBV DNA的详细实验方案。该试剂盒采用针对HBV基因组高度保守的核心区域设计的引物和探针，能够准确量化所有HBV基因型（A、B、C、D、E、F、G、H、I和J）。试剂盒还包含内源性内参对照，用于监测可能发生的PCR抑制。本检测共进行40个循环，其临界值为38 Ct。为实现临床样本中HBV DNA的定量，试剂盒提供了一组5个定量标准品，这些标准品含有已知浓度的HBV特异性DNA，并以世界卫生组织国际标准进行校准^th 世界卫生组织乙型肝炎病毒DNA核酸检测国际标准品（NIBSC编号10/266）。该标准品用于验证针对乙型肝炎病毒特异性DNA扩增的检测功能，并建立标准曲线，从而实现对样本中乙型肝炎病毒DNA的定量检测。使用该PCR试剂盒可检测低至2.5 IU/mL的乙型肝炎病毒DNA。该试剂盒具有高灵敏度和良好重复性，是临床实验室中的有力工具，有助于医疗专业人员有效诊断和管理乙型肝炎病毒感染。

引言

乙型肝炎病毒（HBV）是一种部分双链DNA病毒，属于Orthohepadnavirus属和Hepadnaviridae科¹。该病毒可引发慢性感染，持续终生，可能导致肝硬化和肝细胞癌^2,3,4。根据世界卫生组织（WHO）的数据，2019年约有2.96亿人患有慢性乙型肝炎感染，每年新增感染人数达150万⁵。

血清或血浆样本中乙型肝炎病毒（HBV）DNA的检测与定量是识别持续性乙型肝炎感染个体、评估抗病毒治疗效果以及预测治疗成功可能性的重要方法^{6,7,8,9,10,11}。高病毒载量与肝脏疾病进展风险增加相关，包括肝硬化和肝癌^12,13。因此，准确测定病毒载量对于监测HBV感染进展及指导治疗决策至关重要。

与传统PCR技术相比，定量实时PCR检测具有更高的灵敏度、更宽的动态范围以及对HBV DNA更准确的定量能力^14,15,16,17。目前市场上已有多种基于实时PCR的商业化分子诊断试剂盒，可用于血清或血浆样本中HBV DNA的定量检测。本文介绍了一种使用市售的、具有IVD标志的实时PCR试剂盒检测和定量人血清或血浆中HBV DNA的详细操作流程。该试剂盒应用广泛^18,19，成本较低，且具有高度灵敏性，其性能特征与其他市售的CE标志试剂盒相当¹⁸。除扩增HBV靶区域外，该试剂盒还包含一个内源性内参基因，用于验证样本质量、提取DNA的质量、PCR扩增效率以及是否存在PCR抑制。

方案

本研究未涉及任何人类受试者或临床样本。所使用的唯一生物材料是4^th WHO乙型肝炎病毒DNA核酸检测国际标准品（NIBSC编号10/266）。该标准品为公开可用的参考物质，不包含任何个人身份信息或可识别数据，因此本研究无需伦理审批。

1. DNA 提取

1. 从人血清或血浆样本中提取病毒DNA。将提取的DNA在-20 °C下保存，直至后续用于PCR。
   ​注意：推荐用于DNA提取的血清或血浆体积为500 µL，洗脱体积为50 µL。本研究中使用病毒核酸提取试剂盒（材料表）进行病毒DNA提取。

2. 实时荧光定量PCR

1. 解冻所有试剂（表1实时荧光定量 PCR 试剂盒在室温（RT；15–25 °C）下解冻后，短暂涡旋振荡 10 秒（中等速度）混匀各组分，并在 8,000 × g 在室温下持续15秒。将所有解冻的组分置于冷却块上保存。
2. 反应准备
   1. 按照以下步骤配制PCR反应混合液 表2根据样本、标准品和无模板对照的数量计算需添加的试剂体积。
      注意：配制PCR反应体系时，每种试剂应至少多加10%的额外体积（例如，若需要10个反应，则按11个反应进行计算）。
   2. 将上述配制好的PCR混合液各15 µL加入每个PCR管中。然后，向各管中加入15 µL提取的样本DNA。作为检测HBV DNA的阳性对照（PC），需加入至少一种HBV标准品（HBV Standard 1–5）各15 µL；同时以15 µL PCR级无核酸酶水作为阴性对照（NC）。为建立HBV DNA定量所需的标准曲线，每次PCR扩增均应使用试剂盒提供的全部5种定量标准品（HBV Standard 1–5）。
   3. 盖上管盖，中等速度脉冲振荡10秒以混匀组分，然后在8,000 × g 室温下静置15秒，然后转入热循环仪。确保反应体系中无气泡，以免干扰荧光检测。
3. 程序设置
   1. 使用热循环仪时，按照推荐的循环条件进行程序设置 表3.
4. 通道/荧光染料选择
   1. 选择常用于实时 PCR 平台的荧光染料，如文中所述 表4.
5. 数据分析
   1. 运行结束后，在线性刻度下分析扩增曲线。
   2. 阈值设置
      1. 在PCR反应的指数扩增阶段设置阈值。该试剂盒推荐的阈值参数已在文中提及。 表5. 保持阈值设置的一致性。一旦确定了该检测的最佳阈值，应针对特定的PCR仪器对所有样本始终使用相同的阈值。这有助于确保结果的准确性和可重复性。
         ​注意：如果阈值设置过低，信号可能低于噪声水平，导致Ct值不可靠。如果阈值设置过高，信号可能处于扩增反应的平台期，此时扩增效率下降，Ct值可能不准确。
   3. 临界值
      1. 运行试剂盒共40个扩增循环。任何超过38个循环的扩增均不应纳入结果判读。
   4. 定性结果分析
      1. 使用该试剂盒定性检测乙型肝炎病毒（HBV）DNA。以标准品2作为阳性对照（PC），HBV的预期Ct值为20 ± 2，内标（IC）的预期Ct值为24 ± 3。
      2. 确保无模板对照（NTC）在HBV和内参对照（IC）靶标中均未出现任何扩增。若NTC反应中发生扩增反应，则可能发生了样本污染。
      3. 由于检测的阈值为38，因此HBV靶标在38 Ct之前出现扩增的样本均视为HBV阳性样本。当所有对照均符合上述要求时，应根据前述解释对样本进行判定。 表6.
   5. 定量结果分析
      1. 使用一组已知浓度的乙型肝炎病毒（HBV）特异性DNA定量标准品，该标准品系列共5个，已根据第四代世界卫生组织乙型肝炎病毒DNA国际标准品对核酸扩增技术（NAT）进行校准。²⁰ (表7).
      2. 采用这些标准品绘制标准曲线。利用标准曲线定量未知样本中的HBV DNA。
         注意：实时 PCR 软件将利用 5 个标准品中 HBV 目标序列的 Ct 值及其对应的国际单位每微升（IU/µL）浓度，生成标准曲线。
      3. 只有当标准品的斜率在 -3.1 至 -3.6 之间，且 R 值满足条件时，才对未知样品的数值进行解读² 值介于0.99至1.0之间，PCR扩增效率为90%-110%（0.9-1.1），阴性对照中无扩增产物。
      4. 软件将计算每个乙型肝炎病毒（HBV）阳性样本的浓度，单位为国际单位每微升（IU/µL）。为计算病毒载量（将IU/µL转换为国际单位每毫升 [IU/mL]），请使用以下公式：
         结果（IU/mL）=（结果 [IU/µL] × 洗脱体积 [µL]）/ 样品体积 (mL)
         注意：第4^th 世界卫生组织乙型肝炎病毒DNA国际标准品（NIBSC编号10/266）从0.5 mL血浆中提取病毒DNA，将纯化的病毒DNA洗脱至50 µL洗脱缓冲液中，并作为参考样本与5种HBV标准品及无模板对照（NTC）一同用于PCR试剂盒检测。参考样本（NIBSC编号10/266）的HBV病毒载量计算如下：(6659 IU/µL × 50 µL)/0.5 mL = 665,900 IU/mL。

结果

检测和定量人血浆/血清中乙型肝炎病毒（HBV）DNA 的工作流程示意图见图1。图2展示了标准品2（作为阳性对照）以及HBV和内参（IC）的无模板对照（NTC）的扩增图谱。图3显示了HBV阳性样本、HBV阴性样本以及存在PCR抑制的样本的扩增曲线。图4展示了NIBSC编码10/266样本的扩增曲线、HBV的Ct值以及测得的HBV浓度（以国际单位每微升，IU/µL表示）。试剂盒中全部5个HBV标准品的HBV靶标扩增曲线及其代表性标准曲线见图5。该标准曲线的斜率为-3.361，R²为0.99996，扩增效率为0.98。图6展示了全部5个HBV标准品的内参（IC）靶标的扩增曲线。

讨论

根据供应商提供的信息，NIBSC 编码 10/266 在用 0.5 mL 无核酸酶水中重悬后，其赋值为 9,55,000 IU/mL²¹。该样本可视为高载量的乙型肝炎病毒（HBV）阳性样本。本研究所用病毒载量检测试剂盒测定的 HBV 病毒载量为 6,65,900 IU/mL（图 4）。由于任何DNA提取试剂盒的提取效率均无法达到100%，在纯化过程中通常会损失部分DNA。尽管试剂盒测定的病毒载量略低于试剂（NIBSC 编码 10/266）供应商提供的赋值，但数据仍属满意，因为两者之间的 log10 差值仅为 0.157，低于临界值（0.5）²²。

本方案中使用的病毒载量检测试剂盒具有高度的稳健性，并能提供可重复的数据，如图7所示。在本实验中，5个标准品和无模板对照（NTC）均设置三个重复，其Ct值、平均值、标准偏差以及变异系数（CV%）见表8

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4th 乙型肝炎病毒DNA世界卫生组织国际标准品	NIBSC	NIBSC 编码：10/266	世界卫生组织第四代乙型肝炎病毒（HBV）DNA国际标准品，NIBSC编号10/266，旨在用于乙型肝炎病毒核酸扩增技术（NAT）中二级参考试剂的校准。
ABI 实时荧光定量 PCR 仪	赛默飞世尔科技	ABI 7500；QuantStudio 5	这是一台实时荧光定量PCR仪
乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒多重检测 14/198	NIBSC	NIBSC 编码：14/198	这是一种用于HBV、HCV和人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）核酸检测（NAT）的极低阳性三联试剂
QIAGEN 实时荧光定量 PCR 仪	Qiagen	Rotor-Gene Q	这是一台实时荧光定量PCR仪
TRUPCR HBV 病毒载量检测试剂盒	Kilpest India Limited	3B294	本研究中用于HBV DNA检测和病毒载量测定的实时PCR试剂盒
TRUPCR 病毒核酸提取试剂盒	Kilpest India Limited	3B214	这是一种用于从NIBSC:10/266和NIBSC:14/198中提取HBV病毒DNA的DNA提取试剂盒