基于聚合酶链反应的乙型肝炎病毒DNA实时检测和定量

Summary

基于实时聚合酶链反应 （PCR） 的乙型肝炎病毒 （HBV） DNA 检测和定量是一种诊断和监测 HBV 感染的灵敏且准确的方法。在这里，我们提出了一种用于HBV DNA检测和样本病毒载量测量的方案。

Abstract

乙型肝炎病毒（HBV）是全球肝病的重要原因。它可能导致急性或慢性感染，使个人极易患致命性肝硬化和肝癌。准确检测和定量血液中的HBV DNA对于诊断和监测HBV感染至关重要。检测HBV DNA的最常用方法是实时荧光定量PCR，可用于检测病毒并评估病毒载量，以监测对抗病毒治疗的反应。在这里，我们描述了使用IVD标记的基于实时PCR的试剂盒检测和定量人血清或血浆中HBV DNA的详细方案。该试剂盒使用靶向 HBV 基因组高度保守的核心区域的引物和探针，可以准确定量所有 HBV 基因型（A、B、C、D、E、F、G、H、I 和 J）。该试剂盒还包括一个内源性内控品，用于监测可能的PCR抑制。该测定运行 40 个循环，其截止值为 38 Ct。 对于临床样品中 HBV DNA 的定量，试剂盒随附一组 5 种定量标准品。这些标准品包含已知浓度的 HBV 特异性 DNA，这些 DNA 是根据 WHO 第 4^个 用于核酸检测的 HBV DNA 国际标准（NIBSC 代码 10/266）校准的。这些标准品用于验证HBV特异性DNA扩增的功能，并生成标准曲线，从而可以定量样品中的HBV DNA。使用PCR试剂盒检测低至2.5 IU/mL的HBV DNA。该试剂盒的高灵敏度和可重复性使其成为临床实验室的强大工具，帮助医疗保健专业人员有效诊断和管理 HBV 感染。

Introduction

乙型肝炎病毒 （HBV） 是一种部分双链 DNA 病毒，来自正肝病毒属和肝萘病毒科 ¹。它可以引发持续一生的慢性感染，可能导致肝硬化和肝细胞癌 ^2,3,4。根据世界卫生组织 （WHO） 的数据，2019 年估计有 2.96 亿人患有慢性乙型肝炎感染，每年有 150 万人新感染⁵.

血清或血浆样本中HBV DNA的鉴定和测量是检测持续乙型肝炎感染个体、评估抗病毒治疗疗效和预测^{治疗成功概率}的宝贵方法6,7,8,9,10,11。高病毒载量与肝病进展的风险增加有关，包括肝硬化和肝癌^12,13。因此，精确测量病毒载量对于跟踪HBV感染的进展和为治疗决策提供信息至关重要。

与传统的PCR技术相比，实时荧光定量PCR检测具有更高的灵敏度、更宽的动态范围和更准确的HBV DNA定量^14,15,16,17。市场上有几种基于实时荧光定量PCR的商业分子诊断试剂盒，用于定量血清或血浆样本中的HBV DNA。在这里，我们描述了使用市售的、带有IVD标记的基于实时荧光定量PCR的试剂盒检测和定量人血清或血浆中HBV DNA的详细工作流程。该试剂盒是一种广泛使用的 ^18,19、低成本但高灵敏度的检测试剂盒，其性能特征可与其他市售的带有 CE 标志的试剂盒¹⁸ 相媲美。除了HBV靶区扩增外，试剂盒中还包括一个内源性内控基因，以验证样品质量、提取DNA的质量、PCR扩增和可能的PCR抑制。

Protocol

这项研究不涉及任何人类参与者或临床样本。唯一使用的生物材料是世卫组织第四条用于核酸检测的HBV DNA国际标准（NIBSC代码10/266）。本标准是公开可用的参考资料，不包含任何个人信息或可识别数据。因此，本研究不需要伦理批准。

1. DNA提取

1. 从人血清或血浆样本中提取病毒DNA。将提取的DNA储存在-20°C，直到进一步用于PCR。
   注:用于 DNA 提取的推荐血清或血浆体积为 500 μL，洗脱体积为 50 μL。在这项研究中，使用病毒核酸提取试剂盒（材料表）提取病毒DNA。

2. 实时荧光定量PCR

1. 在开始PCR之前，在室温（RT;15-25°C）下解冻实时荧光定量PCR试剂盒的所有试剂（表1）。解冻时，通过以中等速度脉冲涡旋 10 秒混合组分，并在室温下以 8,000 × g 离心 15 秒。 将所有解冻的组分放在冷却块上。
2. 反应制备
   1. 根据 表2制备PCR混合物。根据样品数量、标准品和无模板对照计算要添加的试剂的体积。
      注意:制备PCR混合物时，应添加每种试剂至少10%的额外体积（例如，如果需要10个反应，则计算11个反应）。
   2. 将15μL上述制备的PCR混合物移入每个PCR管中。然后，加入 15 μL 提取的样品 DNA。加入 15 μL 至少一种 HBV 标准品（HBV 标准品 1-5）作为检测 HBV DNA 的阳性对照 （PC），加入 15 μL PCR 级无核酸酶水作为阴性对照 （NC）。要生成定量HBV DNA所需的标准曲线，请使用试剂盒随附的所有5种定量标准品（HBV标准品1-5）进行每次PCR运行。
   3. 关闭试管，通过脉冲涡旋以中等速度混合组分10秒，并在室温下以8,000× g 离心15秒，然后进入热循环仪。确保反应混合物中没有气泡，因为它可能会干扰荧光检测。
3. 程序设置
   1. 按照 表3中的建议，使用循环条件对PCR仪进行编程。
4. 通道/荧光基团选择
   1. 为常用的实时荧光定量PCR平台选择荧光染料，如 表4所示。
5. 数据分析
   1. 运行完成后，线性刻度分析扩增图。
   2. 阈值设定
      1. 在PCR反应的指数阶段设置阈值。 表 5 中提到了该套件的推荐阈值。与阈值设置一致。一旦确定了测定的最佳阈值，就将其一致地用于特定PCR仪的所有样品。这将有助于确保结果的准确性和可重复性。
         注意: 如果阈值设置得太低，信号可能低于噪声水平，Ct 值将不可靠。如果阈值设置得太高，则信号可能处于反应的平台期，放大效率不高，Ct值可能不准确。
   3. 近路
      1. 运行试剂盒 40 个扩增周期。不要考虑任何超过 38 个周期的放大进行任何解释。
   4. 定性结果分析
      1. 使用该试剂盒对HBV DNA进行定性检测。使用标准 2 作为 PC，HBV 的预期 Ct 值为 20 ± 2，IC 的 Ct 值为 24 ± 3。
      2. 确保无模板对照 （NTC） 对 HBV 和内部对照 （IC） 靶标均未表现出任何扩增。如果在NTC反应中发生扩增反应，则可能发生了样品污染。
      3. 由于测定临界值为 38，因此考虑在 38 Ct 之前将 HBV 靶标作为 HBV 阳性样品进行任何扩增。当所有对照都满足上述要求时，考虑按照 表6中提到的解释进行试样。
   5. 定量结果分析
      1. 使用已知浓度的 5 种 HBV 特异性 DNA 定量标准品，这些标准品根据 WHO 第 4 个核酸扩增技术 HBV DNA 国际标准 （NAT）²⁰ 进行校准（表 7）。
      2. 使用这些标准来生成标准曲线。利用标准曲线定量未知样品的HBV DNA。
         注:实时荧光定量PCR软件将使用所有5种标准的HBV靶标获得的Ct值及其相应的浓度（以国际单位/微升（IU / μL）为单位）生成标准曲线。
      3. 仅当标准品斜率在-3.1和-3.6之间，R² 值在0.99和1.0之间，PCR效率在90%-110%（0.9-1.1）之间，并且阴性对照中没有扩增时，才解释未知样品的值。
      4. 该软件将以国际单位/微升 （IU/μL） 计算每个 HBV 阳性样本的浓度。要计算病毒载量（IU/μL 转换为国际单位/毫升 [IU/mL]），请使用以下公式:
         结果 （IU/mL） = （结果 [IU/μL] x 洗脱体积 [μL]）/样品体积 （mL）
         注:从0.5 mL血浆中提取第4个WHO国际标准HBV DNA，NIBSC代码10/266用于病毒DNA纯化，将纯化的病毒DNA洗脱到50μL洗脱缓冲液中，并与PCR试剂盒一起用作参考样品以及5种HBV标准品和NTC。参考样品（NIBSC 代码 10/266）的 HBV 病毒载量计算为 （6659 IU/μL x 50 μL）/0.5 mL = 6,65,900 IU/mL。

Results

从人血浆/血清中检测和定量HBV DNA的工作流程示意图如 图1所示。HBV 和 IC 的标准 2（用作 PC）和 NTC 的扩增曲线如 图 2 所示。 图3 显示了HBV阳性样本、HBV阴性样本和PCR抑制样本的扩增曲线。图 4显示了HBV的扩增曲线、Ct值和获得的HBV浓度（以国际单位/微升（IU/μL）为单位，NIBSC代码为10/266。 图5显示了试剂盒中所有5种HBV标准品的HBV靶标的扩增曲线及其具有代表性的标准品曲线。标准曲线的斜率为-3.361，R² 为0.99996，效率为0.98。所有 5 种 HBV 标准品的 IC 靶标的扩增曲线如 图 6 所示。

Discussion

根据供应商信息^21，NIBSC 代码 10/266 在 0.5 mL 无核酸酶水中复溶时，单位为 9,55,000 IU/mL。这可以被认为是高负荷HBV阳性样本。本研究中使用的病毒载量试剂盒测定的HBV病毒载量为6,65,900 IU/mL（图4）。由于任何DNA提取试剂盒的DNA提取效率都不是100%，因此在纯化过程中经常会丢失一些DNA。尽管试剂盒确定的病毒载量略低于试剂（NIBSC 代码 10/266）供应商的指定值，但数据仍然令人满意，因为两个值之间的 log10 差异仅为 0.157，小于临界值 （0.5）²²。

该协议中使用的病毒载量试剂盒具有高度稳定性，可提供可重复的数据，如 图7所示。在本实验中，所有 5 个标准品和 NTC 一式三份运行，其 Ct 值、平均值、标准偏差和变异系数 （CV%） 如 表 8 所示。如

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4th WHO 乙型肝炎病毒 DNA	国际标准 NIBSC	NIBSC 代码：10/266	乙型肝炎病毒 （HBV） DNA 第 4 项国际标准，NIBSC 代码 10/266，旨在用于校准 HBV 核酸扩增技术 （NAT） 中使用的二级参比试剂。
ABI 实时荧光定量 PCR 仪	赛默飞世尔科技	ABI 7500;QuantStudio 5	这是一台实时 PCR 机器
HBV、HCV 和 HIV 多重检测 14/198	NIBSC	NIBSC 代码：14/198	这是一种非常低阳性的三重试剂，适用于含有乙型肝炎 （HBV）、丙型肝炎 （HCV） 和人类免疫缺陷病毒-1 （HIV-1） 的 NAT 检测
QIAGEN 实时 PCR 机	Qiagen	Rotor-Gene Q	这是一台实时 PCR 机器
TRUPCR HBV 病毒载量试剂盒	Kilpest India Limited	3B294	这是本研究中用于 HBV DNA 检测和病毒载量测定的基于实时 PCR 的试剂盒
TRUPCR 病毒核酸提取试剂盒	Kilpest India Limited	3B214	这是一种用于从 NIBSC：10/266 和 NIBSC：14/198 中提取 HBV 病毒 DNA 的 DNA 提取试剂盒