本文描述了一种使用半发酵无菌饲料饲养无菌葱蝇（Delia antiqua）的简单方法。通过PCR检测，在无菌葱蝇（D. antiqua）的每个龄期中仅检出一种沃尔巴克氏体菌株。
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本文内容
摘要
摘要
无菌昆虫是通过使用无菌培养基的无菌人工饲养系统获得的。这类昆虫具有个体小、生长周期短、饲料需求低等特点，非常适合用于研究微生物与宿主之间的关系。肠道微生物群显著影响昆虫宿主的生理特征，将特定菌株引入无菌昆虫体内，可为验证肠道微生物功能提供有效方法。Delia antiqua 是双翅目（Diptera）、花蝇科（Anthomyiidae）、葱蝇属（Delia）的一种重要害虫，主要取食洋葱、大蒜、韭菜等百合科（Liliaceae）植物。其幼虫取食植物鳞茎，导致鳞茎腐烂、植株萎蔫，甚至整株死亡。通过饲养无菌幼虫，可进一步开展研究，观察肠道微生物群对D. antiqua生长发育的影响。与使用抗生素清除共生微生物的方法不同，本文介绍了一种低成本、高效率的无菌D. antiqua饲养方法。在对D. antiqua卵进行表面消毒后，采用半发酵的无菌饲料饲养幼虫，并通过依赖培养和非依赖培养的方法验证了D. antiqua的无菌状态。综上所述，结合昆虫卵的表面灭菌与无菌饲料制备技术，已成功建立了一种高效且简便的获得无菌D. antiqua的方法。该方法为研究昆虫与微生物群落的相互作用提供了有力工具。
引言
无菌动物是指无法检测到任何可存活微生物或寄生虫的动物，是研究宿主与微生物相互作用的宝贵实验模型1,2。昆虫作为最大的无脊椎动物类群，能够与微生物形成共生关系3。无菌昆虫可用于研究共生系统中的宿主-共生体相互作用4。例如，Nishide 等人5建立了一种针对臭虫Plautia stali的实用无菌饲养方法，从而能够在模式共生系统中对宿主-共生体相互作用进行可靠且严谨的分析。无菌昆虫可通过对卵阶段进行消毒，并为幼虫和成虫提供无菌食物来获得6,7。无菌昆虫在生物学研究中具有重要意义并被广泛应用。例如，Somerville 等人8开展的一项研究表明，接种了Enterobacter cloacae的小菜蛾可提高转基因雄性个体的适应能力。
Delia antiqua Meigen 是一种在全球范围内对洋葱及其他百合科作物具有重要经济影响的害虫，其幼虫会危害洋葱和其他百合科作物的鳞茎
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方案
D. antiqua 采自泰安范镇的田间。
1. 无菌饲料的制备
- 剥去葱的外层，去除绿色叶子部分，保留葱的白色部分（图1A）并用无菌水清洗，重复冲洗三次。用剪刀将葱白部分切成1-2厘米见方的小块（参见 材料表用75% EtOH溶液（见步骤2.5）灭菌，以备后续使用。
- 称取50 g切碎的葱段，放入食品加工机中（参见 材料表）。加入50 mL无菌水，研磨5次，每次2分钟。所有切碎的葱应研磨至呈糊状。图2A).
- 使用镊子转移10片3rd 龄幼虫 D. antiqua 加入含有10 mL 1×PBS的10 mL离心管中，使用一次性研磨杵进行研磨（参见 材料表约5分钟，以获得幼虫研磨液。
- 将葱糊状液体和幼虫研磨液倒入一个洁净的500 mL锥形瓶中（参见 材料表）。用两层透明封口膜包裹锥形瓶瓶口，然后将锥形瓶置于摇床培养箱中（参见 材料表在25 °C、180 rpm条件下发酵12小时（图2....
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结果
生命阶段 D. antiqua 如图所示 图4完整的生命周期包括卵、幼虫、蛹（图4C）以及成虫（图 4D）。它们在无菌离心管中培养，其外观和存活率与 D. antiqua 在非无菌条件下培养。每个阶段的生长和发育时间 D. antiqua 可在 图6非无菌培养条件下卵的阶段 D. antiqua 为 2.83 ± 0.29 天，无菌培养条件下的 D. antiqua 为2.83 ± 0.29天，两者之间无显著差异（独立 t检验，t = 0.00，p = 1.00）。无菌幼虫阶段持续时间为14.50 ± 0.50天，与正常幼虫阶段的13.83 ± 0.76天相比，两者之间无显著差异（独立 t检验，t = 1.27，p = 0.27）。正常饲养条件下的蛹期阶段 D. ant.......
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讨论
昆虫拥有高度复杂的肠道微生物群20,21，因此在研究昆虫与微生物相互作用时，需要使用经特定肠道微生物菌株接种的无菌昆虫。制备无菌昆虫对这类研究至关重要。抗生素处理是一种用于清除肠道微生物群的方法。例如，Jung 和 Kim22 用青霉素饲喂Spodoptera exigua，而 Raymond23 则用含利福平的人工饲料饲喂P. xylostella以清除肠道细菌。然而，抗生素处理无法完全消除肠道细菌，并且对宿主昆虫具有多种副作用，包括代谢酶活性的改变、肠道功能受损、生长、发育和繁殖受到抑制，以及死亡率升高23,24,25。因此，抗生素处理后可能掩盖昆虫肠道微生物群的真实功能。幸运的是，通过化学方法对卵表面.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（32272530）、济南市高校新二十条政策项目（2021GXRC040）、山东省重大科技创新工程项目（2021TZXD002）以及齐鲁工业大学科教融合项目（2022PYI009、2022PY016、2022PT105）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 μM 滤瓶 | 赛默飞世尔科技 | 450-0045 | |
| 0.22 μM型注射器滤器 | Biosharp | BS-QT-011 | |
| 100目筛网 | 浙江上虞金鼎标准筛网厂 | 无目录编号 | |
| 1x PBS 溶液 | Solarbio | P1020 | |
| 2x Taq PCR预混液 | 基因视图 | GR1113-1ML | |
| 5.2% NaClO 溶液 | 国药集团化学试剂有限公司 | 80010428 | |
| 500 mL 锥形瓶 | 赛默飞世尔科技 | 4103-0500 | |
| 50 mL 通气离心管 | JET BIOFIL | BRT-011-050 | |
| 50x TAE 缓冲液 | 基因视图 | GT1307 | |
| 琼脂粉 | Ding Guo | DH010-1.1 | |
| 生化培养箱 | STIK | 21040121500010 | |
| 细胞筛 | 赛宁 | 5022200 | |
| 氯化胆碱 | Sangon Biotech | A600299-0100 | |
| ddH₂O2O | Ding Guo | PER018-2 | |
| 一次性研磨杵 | JET BIOFIL | CSP-003-002 | |
| DNA提取试剂盒 | Sangon Biotech | B518221-0050 | |
| DNA 标记 | Sangon Biotech | B600335-0250 | |
| 无水乙醇 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10009218 | |
| 滤纸 | NEWSTAR | 1087309025 | |
| 食物加工机 | 广东美的生活电器制造有限公司 | WBL25B26 | |
| 被照亮的 培养箱 | 上海艾斯特分析仪器有限公司 | A16110768 | |
| L-抗坏血酸 | Sangon Biotech | A610021-0100 | |
| L形涂布棒 | 赛宁 | 6040000 | |
| 营养琼脂培养基 | 霍普生物 | HB0109 | |
| 剪刀 | Bing Yu | BY-103 | 在京东购买 |
| 震荡培养箱 | 上海芝楚仪器有限公司 | 2020000014 | |
| 蔗糖 | 基因视图 | CS326-500G | |
| Super Green 核酸染料 | Biosharp | BS355A | |
| 超净工作台 | Heal Force | AC130052 | |
| TSB | 霍普生物 | HB4114 | |
| 真空泵 | 浙江台州寻精真空泵有限公司 | 22051031 | |
| 酵母提取物 | 赛默飞世尔科技 | LP0021B |
参考文献
- Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
- Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. Germ-free mice model for studying host-microbial interaction....
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重印与许可
