通过冷冻切片初步验证立体定向注射坐标

摘要

本方案描述了一种实用策略，用于在使用染料和冷冻切片进行病毒示踪之前加快立体定位注射坐标的验证步骤。

摘要

特定大脑区域的立体定向注射构成了基础神经科学中的一项基本实验技术。研究人员通常根据小鼠脑图谱或已发表的材料来选择立体定位注射参数，这些材料采用了不同群体/年龄的小鼠和不同的立体定位设备，因此需要进一步验证立体定位坐标参数。钙成像、化学遗传学和光遗传学操作的功效依赖于感兴趣区域内报告基因的精确表达，通常需要数周的努力。因此，如果不事先验证目标大脑区域的坐标，这将是一项耗时的任务。使用适当的染料代替病毒并实施冷冻切片，研究人员可以在染料给药后立即观察注射部位。这有助于在实际注射位置和理论位置之间存在差异的情况下及时调整坐标参数。在随后的实验中，这种调整显著提高了靶区域内病毒表达的准确性。

引言

几乎所有现代神经调控工具，包括体内钙记录、光遗传学和化学遗传学工具，都需要使用立体定位坐标来靶向感兴趣的大脑区域 ^1,2,3，从而形成神经操作的基础。小鼠大脑区域的立体定位坐标是相对于前囟和λ（颅骨上的骨标志）定义的，形成了所谓的颅骨衍生的立体定位坐标系统。bregma 或 lambda 都可以用作三维坐标的零点。这三个轴是前后轴 （AP）、内外侧轴 （ML） 和背腹轴 （DV），代表立体定位仪器数字显示屏上的 y、x 和 z 轴。对于众所周知的大脑区域，特定区域的立体定位坐标参数可以从小鼠脑^图谱4（例如，Paxinos和Franklin的小鼠大脑在立体定位坐标中）和/或已^{发表的文献5,6}中获得。然而，由于立体定位设备的变化和不同研究人员使用的小鼠的年龄/群体，需要进一步验证。

结构是功能的基础。神经回路构成了许多大脑功能的基础，例如认知活动、情绪、记忆、感觉和运动功能¹.标记结构和操纵神经回路的活动对于理解特定神经回路的功能至关重要。在过去的几十年里，神经示踪剂已经进化了好几代;早期研究采用小麦胚芽凝集素（WGA）和菜豆凝集素（PHA）作为顺行示踪剂，氟金（FG）、霍乱毒素B亚基（CTB）、痰花青作为逆行示踪剂。然而，与病毒示踪剂不同，这些传统的神经示踪剂不能将外源基因整合到宿主中，也不具有细胞类型选择性。如今，病毒策略已成为基础神经科学研究中的一个重要命题。针对不同的研究目的，可以选择各种病毒工具^7,8。有非跨突触病毒、反式多突触病毒（逆行和顺行）和跨单突触病毒（逆行和顺行）。每个类别都包含几种具有各自特征的类型。

病毒给药和表达的过程非常耗费时间和资源，通常需要数周甚至更长时间。在各种病毒载体中，腺相关病毒已被确定为一种有前途的基因递送手段，为实验程序提供了注射后 3 至 8 周的广泛窗口 ^7,8。随着 AAV 的发展，可以在给药后 2-3 周进行分析 ^9,10。其他神经回路示踪剂，如伪狂犬病病毒 （PRV） 和狂犬病病毒 （RV），也需要至少 2-7 天的追踪期 11,12,13,14,15。因此，在观察荧光信号之前对注射部位进行初步验证既省时又经济。

为了便于简单快速地验证立体定向注射，在这项研究中，在病毒载体之前施用染料，冷冻切片使研究人员能够在注射后 30 分钟内观察注射部位并对其进行追踪。

方案

所有动物实验均按照《动物研究报告体内实验》（ARRIVE）指南和美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行。本研究经上海交通大学医学院附属仁济医院动物护理与使用专业委员会批准。本研究采用8周龄C57BL/6J雄性小鼠。这些动物是商业获得的（见 材料表）并饲养在标准笼子中（22°C±2°C，12小时/ 12小时光照/黑暗循环，食物和水随意）。

1. 目标脑区域的选择

注意:这是一个无菌程序。确保所有手术器械都经过消毒。在接触手术器械之前，用酒精喷洒手套。避免戴手套触摸器械尖端或手术区域。在开始手术之前，通过检查矫正反射的丧失和对皮肤刺激没有反应，确保小鼠得到充分麻醉。在钻孔和注射之前，密切监测呼吸频率（每分钟60-220次呼吸，平均每分钟100-150次呼吸）和呼吸幅度（应保持一致，不要过浅或过深）。应注意呼吸频率或振幅的任何显着变化。

1. 使用29G针头腹膜内注射1.25%三溴乙醇（250mg / kg）麻醉小鼠。一旦矫正反射消失，就剃掉头骨上的毛发。用鼻夹固定上门牙并使用两个耳杆稳定头部，将鼠标固定在立体定位框架中（参见 材料表）。
2. 使用眼药膏以防止眼睛干燥。用 Anerdian（消毒溶液;见 材料表）擦拭头皮三次对头皮进行消毒。使用 29 G 胰岛素针头皮下注射 0.2 mL 1% 利多卡因以提供局部镇痛。
3. 用眼剪刀做一个 0.5 厘米的切口，露出颅骨。使用蘸有 3% H₂O₂ 的棉签擦洗暴露的颅骨以去除骨膜。让颅骨干燥。
4. 将钻头固定在立体定位仪器上。借助放大镜调整立体定位臂的旋钮，将钻尖精确定位在前囟上，并使用 LCD 数字显示屏记录 z 轴值。
   1. 调整旋钮并将钻头放置在 lambda 上并记录 z 轴的值。调整鼻夹和耳杆，使两个 z 值更近，然后重复上述步骤，直到两个 z 值之间的差异小于 0.1 mm。
      注意: LCD 数字显示屏上的 x、y 和 z 轴分别对应于内外侧 （ML）、前后 （AP） 和背腹 （DV）。一旦两个 z 值之间的差值小于 0.1 mm，就可以认为 bregma 和 lambda 位于同一水平面上。
5. 确保大脑的左右水平度。使用相同的刻度调整连接到立体定位框架的耳杆。以侧齿被盖腹侧部分（LDTgV）为例;根据 Paxinos 和富兰克林的小鼠大脑图谱¹⁶，它的立体定位坐标为 -5.2 表示 x，+0.8 表示 y，表示 z。
   1. 调整耳杆，使钻头在（-5.2，+0.8）处测量背腹方向的z值，将钻头移动到（-5.2，-0.8）处测量z值。
      注意: 当两个 z 值之间的差值小于 0.2 毫米时，左右被视为处于相等水平。耳杆需要插入正确的位置，因为外耳道是对称的。如果两个 z 值之间的差异超过 0.5 毫米，则耳杆可能插入了错误的位置。
6. 再次将钻头定位到前门，并在 LCD 数字显示屏上将三个坐标设置为零。使用参考坐标将钻头放置在感兴趣区域上方。开始演练。
   1. 使用垂直臂逐渐降低钻头，直到它穿透颅骨。用棉签清除碎屑和血液。
      注意:注意不要损伤脑组织。

2.染料溶液的制备和脑显微注射

1. 将 25 μL 含有溴酚蓝的 SDS-PAGE 上样缓冲液（参见 材料表）放入 200 μL 微量离心管中。向试管中加入 50 μL ddH₂O 以制备染料溶液。
2. 用盐水湿的化妆棉盖住颅窗。通过反复抽吸和排出生理盐水来确保微注射器通畅。将 0.3 μL 染料加载到微量注射器中。将注射器和电动立体定位显微注射器连接到立体定位臂上。
3. 将注射器尖端放在前囟处，并在 LCD 数字显示屏上将坐标设置为零。根据参考坐标将针头调整到感兴趣的区域。将进样速度设置为 0.1 μL/min，然后启动电动显微注射器，将 0.3 μL 蓝色染料输送到目标区域。将注射器保持在原位至少 10 分钟，然后慢慢抽出注射器。
   注意:在同一只小鼠中可以使用不同的颜色染料来区分紧密定位的区域。根据其他染料的物理特性测试其合适的浓度。建议使用溴酚蓝配方，并在使用前后彻底冲洗注射器，以防止堵塞。根据染料扩散调整进样体积。

3. 脑组织采集和冷冻切片

1. 将鼠标从立体定位帧中释放出来。使用29G针头腹膜内注射50mg / kg戊巴比妥钠麻醉小鼠。用胶带将鼠标固定在泡沫板上。
2. 打开胸部两侧以引起快速窒息。在右心耳上做一个 1-2 毫米的切口。将输液针插入左心室。输注 20 mL 预冷盐水和 20 mL 冰镇 4% 多聚甲醛溶液。
3. 用组织解剖剪刀斩首小鼠（遵循机构批准的方案）。从颈部到鼻子的中线切开一个切口，去除皮肤，然后露出头骨。用镊子或剪刀清除颅骨上的残留肌肉。
4. 将细剪刀的一根刀片的尖端放在枕骨大孔和大脑之间，锋利的边缘朝向骨头，位于矢状缝合线中部的喙端。继续沿着中矢状缝合线滑动并切割颅骨。用镊子切除头骨，露出暴露的大脑。
   注意: 请注意，以免在手术过程中对大脑造成任何伤害。在取出骨屑之前，小心地剥去可能附着在颅骨上的任何脑膜。这种预防措施对于防止在此过程中无意中切开脑组织至关重要。
5. 打开旋转式切片机低温恒温器的电源（参见 材料表）并将腔室温度设置为 -20 °C。 倒入少许 OCT 化合物，均匀地覆盖标本盘的表面。将其放入冷冻室中，让 OCT 凝固。
6. 将圆盘连接到标本头上。将刀片靠近块，并修剪 OCT 块以形成平行于圆盘的平面。
7. 用剃须刀片在脑切片模具中，将大脑沿冠状方向切开，远离注射部位。将包含注射部位的脑组织，切口面朝下，放在 OCT 平面上。
   1. 将 OCT 倒入大脑中，然后将圆盘放入冷冻室，让标本块凝固。将 OCT 反复倒入大脑，直到大脑完全嵌入 OCT。
      注意:逐层添加 OCT 化合物。一旦前一层 OCT 被冻结，将下一层 OCT 化合物倒入大脑。
8. 修剪试样块，直到目标区域接近。从注射部位级别开始制作几个部分。使用保持在-20°C的小书写刷将冠状脑切片收集到含有室温PBS的6孔板中。
   注意: 将切割厚度设置为更大的厚度以修剪块，然后在刀片接近注射部位时将切割厚度设置为 40 μm。如果使用神经回路示踪剂，则不会立即处死小鼠。将小鼠置于加热毯上的无菌术后恢复笼中，以便从麻醉中恢复。一旦醒来，将小鼠放回原来的笼子或新的笼子。

4. 影像学检查

1. 用室温PBS洗涤OCT。用刷子捡起大脑部分并将它们放在载玻片上。让切片在室温下风干。
2. 目视观察注射区域，当目标细胞核很小时，使用显微镜观察。将注射染料的位置与大脑图谱中的相应区域进行比较。
   注意: 根据注射点偏差的方向和距离调整 x、y 和 z 轴的值。可能需要多次重复此协议中的所有步骤才能准确确定坐标。

结果

该研究使用演示的方法在 30 分钟内成功确定了注射部位。最初，将含有溴酚蓝的SDS-PAGE样品上样溶液注射到C57 / BL小鼠的LDTgV中。 图1A 显示了染料溶液注入的示意图。蓝色染料在LDTgV中的分布如图 1B所示。

还将溴酚蓝注射到 mPFC 前边缘皮层、mPFC 边缘下皮层和基底杏仁核 （BMA） 中，以评估该方案的普遍性。如图1C-E和图2A所示，蓝色染料分布在mPFC前边缘皮层、mPFC下边缘皮层和BMA中。

此外，将携带荧光 mCherry 蛋白的腺相关病毒注射到 LDTgV 中（使用染料溶液验证坐标）。病毒的表达花了四个星期。LDTgV中mCherry+神经元的分布如图 2B所示。

图1:染料溶液的注射 。 （A）染料溶液注射示意图。（B） 蓝色染料在LDTgV中的分布。 （C） 蓝色染料在mPFC前缘皮层中的分布。（D） 蓝色染料在mPFC下脑圈皮层中的分布。（E） 蓝色染料在BMA中的分布。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 2:在显微镜下观察的蓝色染料分布和 mCherry 分布。 （A） 蓝色染料在 mPFC 前缘皮层中的分布（10 倍放大，比例尺 = 500 μm）。（B） 通过荧光显微镜（10 倍放大，比例尺 = 500 μm）获取的 LDTgV 区域中 mCherry 分布的代表性图像。 请点击这里查看此图的较大版本.

讨论

本文描述了一种稳定的策略，可以在病毒追踪之前更快、更简单地验证立体定向脑注射的准确性 ^5,6，^但报告基因在大脑区域表达的不可替代性对于大脑区域标记至关重要。我们使用的蓝色染料可以立即看到注射部位。

该协议中的几个关键步骤有助于提高注射部位的准确性。首先，从步骤1.5开始，确保大脑在立体定位仪中的左右水平度;此步骤要求操作人员熟悉颅骨解剖结构，确保耳杆放置在正确的位置。耳杆上的刻度和立体定位框架也可作为参考。其次，在步骤 1.6 和步骤 2.3 中找到精确的零点，即 bregma。有时，在步骤 1.6 和 2.3 中发现的坐标存在显着差异是由于零点定位存在相当大的差异。这可能导致显微注射针无法穿透颅窗。在这种情况下，有必要重新定位零点，如果需要，需要创建一个新的颅窗。尽管如此，在步骤 2.3 中重新建立零点并重新找到坐标仍然至关重要;不能直接从先前制作的颅窗插入微注射器。

与在小鼠脑切片模具中切割非冷冻的大脑相比，这种策略提供了更准确的结果，因为固体标本块避免了刀片挤压大脑并导致染料从注射点移位。此外，由脑切片模具切割的脑切片相对较厚，无法定位小脑核。然而，与标准脑组织冷冻切片过程 11,12,13,14,15 相比，我们通过跳过脱水步骤将处理时间缩短了至少 72 小时，这导致脑切片更脆弱并且更难在载玻片上拾取，这代表了该协议的主要弱点。

在制作用于染料注射的颅窗时，将牙钻紧紧地连接到立体定位臂上，而不是用手握住它，可以更容易地使用微调旋钮控制钻孔深度，从而减少损伤脑组织的可能性。

综上所述，该研究提供了一种有前途的方法，可以在病毒追踪前初步验证精确的立体定位坐标，使后续的神经元标记和追踪过程更加可靠。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.0 和微;L， Neuros 注射器，型号 7001 KH，32 G，Point Style 3	Hamilton	65458-01
200 μL 移液器吸头	biosharp	BS-200-T
20 mL 注射器	Kindly 组
3%H2O2 溶液	Lircon Company
6 孔板	盛友生物科技	20006
安尔电	利康高新	31001002
抗卷板	Leica	14047742497
BD 胰岛素注射器	Becton，Dickinson and Company	328421
弯曲齿形解剖钳	金中	JD1050
Cellsens 尺寸软件	奥林巴斯
棉签	Fisher Scientific	23-400-122
Dapi-Fluoromount-G	南方生物科技	0100-20
钻头	龙翔
细刷	华宏
精剪刀	金钟	y00030
荧光显微镜	奥林巴斯	BX63
冷冻切片机	徕卡	CM1950
止血钳 直齿	金钟	J31010
输液针 0.7 毫米	友情达组
盐酸利多卡因注射液	Harvest Pharmaceutical Company	71230803
放大镜	M&G 晨光文具
雄性 C57/BL 小鼠	上海计划生育研究所–BK 实验室
小鼠冠状脑切片模具	RWD 生命科学	68713
微量离心管	biosharp	BS-02-P
切片机刀片	徕卡	819
眼用软膏	Cisen Pharmaceutical Company	G23HDM9M4S5
多聚甲醛	Biosharp	BL539A
蠕动泵	Harvard Apparatus	70-4507
磷酸盐缓冲盐水	Servicebio	G4202
Piette 2-200 μL	thermofisher	4642080
SDS-PAGE 样品装载量，含溴酚蓝	Beyotime	P0015A
剃须刀片	91560618
载玻片	Citotest Scientific	188105
立体定位仪	RWD 生命科学	68807
直齿解剖钳	金中	JD1060
注射器支架	RWD 生命科学	68206
纸巾剪刀	晋中	J21040
纸巾-泰克 O.C.T 化合物	樱花	4583
三溴乙醇	爱贝生物	M2910