本方案描述了一种实用策略，可在使用染料和冷冻切片进行病毒示踪前，加快立体定位注射坐标的验证步骤。
本文内容
摘要
摘要
对特定脑区进行立体定位注射是基础神经科学研究中的一项基本实验技术。研究人员通常根据小鼠脑图谱或已发表的文献来确定立体定位注射参数，但这些图谱或文献所使用的可能是不同品系或年龄的小鼠，以及不同的立体定位设备，因此需要对立体定位坐标参数进行进一步验证。钙成像、化学遗传学和光遗传学操作的效果依赖于报告基因在目标区域内的精确表达，而这种表达往往需要数周时间才能完成。因此，如果未预先验证目标脑区的坐标，将耗费大量时间。通过使用适当的染料代替病毒，并结合冷冻切片技术，研究人员可在染料注射后立即观察注射位点，从而在实际注射位置与理论位置存在偏差时，及时调整坐标参数。这种调整可显著提高后续实验中病毒在目标脑区内的表达准确性。
引言
几乎所有现代神经调节工具，包括体内钙成像、光遗传学和化学遗传学工具，都需要使用立体定位坐标来靶向目标脑区1,2,3，这是神经操控的基础。小鼠脑区的立体定位坐标是相对于颅骨上的骨性标志——前囟（bregma）和后囟（lambda）来定义的，由此构成了所谓的颅骨来源立体定位坐标系统。前囟或后囟均可作为三维坐标的零点。三个轴分别为前后轴（AP）、内外侧轴（ML）和背腹轴（DV），对应于立体定位仪器数字显示器上的 y、x 和 z 轴。对于已知的脑区，特定区域的立体定位坐标参数可从小鼠脑图谱4（如Paxinos和Franklin的小鼠脑立体定位坐标图谱）和/或已发表的文献中获得5,6。然而，由于不同研究者所使用的立体定位设备以及小鼠的年龄和种群存在差异，仍需进行进一步验证。
结构是功能的基础。神经环路构成了大脑多种功能的基础，例如认知活动、情绪、记忆、感觉和运动功能1。标记神经环路的结构并操控其活动，对于理解特定神经环路的功能至关重要。在过去的几十年中，神经示踪剂经历了多代发展；早期研究采用麦芽凝集素（wheat germ agglutinin, WGA）和菜豆凝集素（phaseolus vulgaris agglutinin, PHA）作为顺行性示踪剂，氟金（fluorogold, FG）、霍乱毒素B亚基（cholera toxin subunit B, CTB）和碳菁染料（carbocyanine）作为逆行性示踪剂。然而，与病毒示踪剂不同，这些传统神经示踪剂无法将外源基因整合到宿主细胞中，也不具备细胞类型选择性。如今，病毒示踪策略已成为基础神经科学研究中的重要手段。针对不同的研究目的，可选择多种病毒工具7,8。主要包括非跨突触病毒、跨多突触病毒（逆行性和顺行性）以及跨单突触病毒（逆行性和顺行性）。每一类均包含若干具有各自特性的病毒类型。
病毒注射与表达过程耗时且资源消耗大，通常需要数周甚至更长时间。在各类病毒载体中，腺相关病毒（adeno-associated virus）已被确认为一种有前景的基因递送手段，可在注射后3至8周的较宽时间窗内进行实验操作7,8。随着AAV的不断优化，注射后2-3周即可开展分析9,10。其他神经环路示踪剂，如伪狂犬病病毒（pseudorabies virus, PRV）和狂犬病病毒（rabies virus, RV），同样需要至少2至7天的示踪周期11,12,13,14,15。因此，在观察荧光信号前对注射位点进行初步验证，既节省时间又降低成本。
为了简便快速地验证立体定位注射效果，本研究在给予病毒载体之前先注射染料，通过冷冻切片技术，研究人员可在注射后30分钟内观察并追踪注射位点。
方案
所有动物实验均按照《动物研究体内实验报告指南》（ARRIVE）和美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》进行。本研究经上海交通大学医学院仁济医院动物护理与使用委员会批准。本研究使用8周龄C57BL/6J雄性小鼠。动物购自商业来源（见材料表），饲养于标准笼具中（22 °C ± 2 °C，12 h/12 h明暗循环，自由摄食和饮水）。
1. 目标脑区的选择
注意：此操作为无菌过程。确保所有外科器械均已灭菌。在接触外科器械前，用酒精喷洒手套。避免用手套触碰器械尖端或手术区域。在开始操作前，通过检查小鼠是否失去翻正反射以及对皮肤刺激无反应，确认其已充分麻醉。在钻孔和注射前，密切监测呼吸频率（每分钟60-220次，平均为每分钟100-150次）和呼吸幅度（应保持稳定，既不过浅也不过深）。任何呼吸频率或幅度的显著变化均应记录。
- 使用29 G针头通过腹腔注射1.25%三溴乙醇（250 mg/kg）对小鼠进行麻醉。当翻正反射消失后，剃除颅骨表面的毛发。使用鼻夹固定上门齿，并用耳杆稳定头部，将小鼠固定于立体定位仪（见材料表）中。
- 涂抹眼用软膏以防止角膜干燥。用安尔碘（消毒液；见材料表）擦拭头皮三次进行消毒。使用29 G胰岛素针头皮下注射0.2 mL 1%利多卡因，以提供局部镇痛。
- 使用眼科剪做一道0.5 cm的切口，暴露颅骨。用蘸有3% H2O2的棉签擦洗暴露的颅骨，以去除骨膜。让颅骨自然干燥。
- 将钻头安装至立体定位装置上。借助放大镜，调节立体定位臂的旋钮，使钻头尖端精确定位于前囟，并通过LCD数字显示屏记录Z轴数值。
- 调节旋钮，将钻头尖端移至后囟并记录Z轴数值。调整鼻夹和耳杆，使两个Z轴读数尽可能接近，重复上述步骤，直至两者的差值小于0.1 mm。
注：LCD数字显示屏上的X、Y、Z轴分别对应内侧-外侧（ML）、前-后（AP）和背-腹（DV）方向。当两个Z轴读数之差小于0.1 mm时，可认为前囟与后囟处于同一水平面。
- 调节旋钮，将钻头尖端移至后囟并记录Z轴数值。调整鼻夹和耳杆，使两个Z轴读数尽可能接近，重复上述步骤，直至两者的差值小于0.1 mm。
- 确保脑组织左右水平对称。调节立体定位仪上两侧耳杆至相同刻度。以前脑桥被盖外侧核腹侧部（LDTgV）为例，根据Paxinos与Franklin小鼠脑图谱16，其立体定位坐标为X = -5.2，Y = +0.8，Z = -4.0。
- 调节耳杆，使钻头位于(-5.2, +0.8)处测量背-腹方向的Z值，再将钻头移至(-5.2, -0.8)处测量另一侧Z值。
注：当两侧Z值之差小于0.2 mm时，认为左右已处于同一水平。由于外耳道具有对称性，耳杆必须插入正确位置。若两侧Z值相差超过0.5 mm，则提示耳杆可能插入位置错误。
- 调节耳杆，使钻头位于(-5.2, +0.8)处测量背-腹方向的Z值，再将钻头移至(-5.2, -0.8)处测量另一侧Z值。
- 再次将钻头移回前囟位置，并将LCD数字显示屏上的三个坐标归零。根据目标区域的参考坐标，将钻头移至相应位置，启动钻头。
- 通过垂直臂缓慢降低钻头，直至穿透颅骨。使用棉签清除碎屑和血液。
注：操作时需小心，避免损伤脑组织。
- 通过垂直臂缓慢降低钻头，直至穿透颅骨。使用棉签清除碎屑和血液。
2. 配制染料溶液与脑部微量注射
- 取25 µL含有溴酚蓝的SDS-PAGE上样缓冲液（见材料表）至200 µL微量离心管中。向管中加入50 µL ddH2O，以配制染料溶液。
- 用生理盐水浸湿的棉垫覆盖颅窗。通过反复吸入和排出生理盐水确保微量注射器通畅。将0.3 µL染料装入微量注射器中。将注射器和电动立体定位微量注射仪连接至立体定位臂。
- 将注射器针尖置于前囟位置，并在LCD数字显示屏上将坐标归零。根据参考坐标将针头调整至目标区域。设定注射速度为0.1 µL/min，启动电动微量注射仪，向目标区域注入0.3 µL蓝色染料。注射完成后，保持注射器原位至少10分钟，再缓慢撤出注射针。
注意：可在同一只小鼠中使用不同颜色的染料以区分位置相近的脑区。可根据染料的物理性质测试其他染料的适宜浓度。建议使用溴酚蓝配方，并在使用前后彻底冲洗注射器，以防堵塞。根据染料的扩散情况调整注射体积。
3. 脑组织采集与冷冻切片
- 将小鼠从立体定位仪上取下。使用29 G针头通过腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉。用胶带将小鼠固定在泡沫板上。
- 打开双侧胸腔以诱导快速窒息。在右心耳处做1-2 mm切口。将灌注针插入左心室。灌注20 mL预冷的生理盐水和20 mL冰冻的4%多聚甲醛溶液。
- 使用组织解剖剪将小鼠断头（遵循机构批准的实验方案）。从颈部至鼻部沿中线切开皮肤，暴露颅骨。用镊子或剪刀清除颅骨上残留的肌肉组织。
- 将精细剪刀的一侧刀尖置于枕骨大孔与脑组织之间，刀刃朝向颅骨，在矢状缝前端开始操作。沿正中矢状缝滑动并剪开颅骨。使用镊子移除颅骨，暴露脑组织。
注意：操作过程中需谨慎，避免损伤脑组织。在移除骨片前，应小心剥离可能附着在颅骨上的脑膜组织。此步骤至关重要，可防止在操作过程中意外切割脑组织。 - 打开轮转式冷冻切片机（见材料表）电源，将切片室温度设定为-20 °C。取少量OCT包埋剂均匀覆盖在样本托盘表面，放入冷冻室，使OCT完全凝固。
- 将托盘固定于样本头。将刀片移近组织块，修切OCT包埋块，使其形成一个与托盘平行的平整切面。
- 使用剃刀刀片，在脑切片模具中从注射部位的冠状面方向切割脑组织。将包含注射部位的脑组织切面朝下放置于OCT平面上。
- 向脑组织上倾倒OCT包埋剂，将托盘放入冷冻室，使样本块完全凝固。重复倾倒OCT，直至脑组织被完全包埋。
注意：应逐层添加OCT包埋剂。待前一层OCT冻结后，再倾倒下一层。
- 向脑组织上倾倒OCT包埋剂，将托盘放入冷冻室，使样本块完全凝固。重复倾倒OCT，直至脑组织被完全包埋。
- 修切样本块直至接近目标区域。从注射部位水平连续切取多个切片，使用置于-20 °C的小号绘图笔将冠状脑切片收集至含有室温PBS的6孔板中。
注意：修块时可设置较大的切片厚度，当刀片接近注射部位时，将切片厚度调整为40 µm。若使用神经环路示踪剂，则不应立即处死小鼠。将小鼠置于无菌术后恢复笼内，并放置于加热垫上以促进麻醉复苏。待小鼠清醒后，将其放回原笼或新笼中。
4. 成像
- 用室温的 PBS 清洗 OCT。使用刷子拾取脑切片并将其放置在载玻片上。在室温下静置晾干。
- 通过肉眼观察注射区域，或在目标核团非常微小的情况下使用显微镜进行观察。将染料注射部位的位置与脑图谱中相应区域进行比对。
注意：根据注射点偏移的方向和距离，调整 x、y 和 z 轴的数值。可能需要多次重复本方案中的所有步骤，以准确确定坐标。
结果
本研究通过所述方法在30分钟内成功确定了注射位点。首先，将含有溴酚蓝的SDS-PAGE上样缓冲液注射至C57/BL小鼠的LDTgV区域。图1A展示了染料溶液注射的示意图，图1B显示了蓝色染料在LDTgV中的分布情况。
为评估该方案的普适性，还将溴酚蓝注入到内侧前额叶皮层的前边缘皮层（mPFC prelimbic cortex）、内侧前额叶皮层的下边缘皮层（mPFC infralimbic cortex）以及基底内侧杏仁核（BMA）。如图1C-E和图2A所示，蓝色染料分布在内侧前额叶皮层的前边缘皮层、内侧前额叶皮层的下边缘皮层以及BMA中。
此外，将携带荧光蛋白 mCherry 的腺相关病毒注射至 LDTgV（注射位点通过染料溶液验证）。病毒表达周期为四周。LDTgV 中 mCherry+ 神经元的分布情况如图 2B所示。
图 1：染料溶液注射。 （A）染料溶液注射的示意图。（B）蓝染料在LDTgV中的分布。（C）蓝染料在mPFC前边缘皮层中的分布。（D）蓝染料在mPFC下边缘皮层中的分布。（E）蓝染料在BMA中的分布。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：显微镜下观察到的蓝色染料与 mCherry 的分布情况。（A）蓝色染料在内侧前额叶皮层（mPFC）前肢带皮层区域的分布（10 倍放大，比例尺 = 500 µm）。（B）通过荧光显微镜获取的 LDTgV 区域 mCherry 分布的代表性图像（10 倍放大，比例尺 = 500 µm）。请点击此处查看该图的高清版本。
讨论
本文介绍了一种稳定且快速简便的策略，可在病毒示踪前验证立体定位脑注射的准确性5,6，但报告基因在脑区内的表达对于脑区标记仍具有不可替代的关键作用。我们所使用的蓝色染料可实现对注射位点的即时可视化。
该方案中有几个关键步骤有助于提高注射位点的准确性。首先，在步骤1.5中确保脑组织在立体定位仪中的左右水平；此步骤要求操作者熟悉颅骨解剖结构，确保耳杆放置在正确位置，耳杆和立体定位仪框架上的刻度也可作为参考依据。其次，在步骤1.6和步骤2.3中准确定位零点——前囟（bregma）。有时步骤1.6与步骤2.3中所确定的坐标出现显著偏差，是由于零点定位存在较大差异所致，这可能导致微量注射针无法穿透颅窗。在此情况下，必须重新定位零点，必要时需制作新的颅窗。尽管如此，仍必须在步骤2.3中重新确立零点并重新确定坐标，不可直接通过先前制作的颅窗插入微量注射器。
与使用小鼠脑切片模具切割未冷冻脑组织相比，该方法能提供更准确的结果，因为固定的组织块可避免刀片挤压脑组织导致染料从注射位点移位。此外，使用脑切片模具制备的脑切片相对较厚，难以精确定位较小的脑核团。然而，与标准的脑组织冷冻切片流程11,12,13,14,15相比，本方法省略了脱水步骤，使处理时间至少缩短了72小时；但由此导致脑切片更为脆弱，更难转移至载玻片上，这是本方案的一个主要缺陷。
在制作用于染料注射的颅窗时，将牙科钻固定在立体定位仪机械臂上，而不是用手持操作，可通过微调旋钮更精确地控制钻孔深度，从而降低损伤脑组织的可能性。
综上所述，本研究提供了一种有前景的方法，可在病毒示踪前初步验证精确的立体定位坐标，从而使后续的神经元标记和示踪过程更加可靠。
披露
作者声明无竞争利益。
致谢
国家自然科学基金（项目编号 82101249，授予孙XY）；中国博士后科学基金（项目编号 2022M722125，授予孙XY）；上海市扬帆计划（项目编号 21YF1425100，授予陈SH）；上海市卫生健康委员会临床研究专项项目（项目编号 202340088，授予周J）。国家自然科学基金（项目编号 82101262，授予张X；项目编号 82101287，授予陈SH）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.0 µL，神经外科注射器，型号 7001 KH，32 G，尖端类型 3 | Hamilton | 65458-01 | |
| 200 μL 移液器吸头 | biosharp | BS-200-T | |
| 20 mL 注射器 | Kindly group | ||
| 3% H₂O₂ 溶液 | Lircon 公司 | ||
| 6 孔板 | 生友生物技术 | 20006 | |
| Anerdian | 力康高科技 | 31001002 | |
| 防滚动载片架 | Leica | 14047742497 | |
| BD 胰岛素注射器 | Becton, Dickinson 和公司 | 328421 | |
| 弯齿解剖镊 | 金钟 | JD1050 | |
| Cellsens Dimension 软件 | Olympus | ||
| 棉签 | 费雪科学 | 23-400-122 | |
| Dapi-Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| 钻孔器 | 龙翔 | ||
| 细毛刷 | 华宏 | ||
| 精细剪刀 | 金钟 | y00030 | |
| 荧光显微镜 | Olympus | BX63 | |
| 冷冻切片机 | Leica | CM1950 | |
| 直齿止血钳 | 金钟 | J31010 | |
| 输注针 0.7 mm | Kindly group | ||
| 盐酸利多卡因注射液 | 瀚晖制药有限公司 | 71230803 | |
| 放大镜 | M&G 晨光文具 | ||
| 雄性 C57/BL 小鼠 | 上海市计划生育科学研究所－BK 实验室– | ||
| 小鼠冠状脑切片模具 | RWD 生命科学 | 68713 | |
| 微量离心管 | biosharp | BS-02-P | |
| 切片机刀片 | Leica | 819 | |
| 眼科软膏 | 齐森制药有限公司 | G23HDM9M4S5 | |
| 多聚甲醛 | Biosharp | BL539A | |
| 蠕动泵 | 哈佛仪器 | 70-4507 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Servicebio | G4202 | |
| Piette 2-200 μL | thermofisher | 4642080 | |
| 含溴酚蓝的 SDS-PAGE 样品上样缓冲液 | 碧云天 | P0015A | |
| 剃毛刀片 | BFYING | 91560618 | |
| 载玻片 | 捷特科学 | 188105 | |
| 立体定位仪 | RWD 生命科学 | 68807 | |
| 直齿解剖镊 | 金钟 | JD1060 | |
| 注射器固定架 | RWD 生命科学 | 68206 | |
| 组织剪刀 | 金钟 | J21040 | |
| Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂 | Sakura | 4583 | |
| 三溴乙醇 | 艾贝生物科技 | M2910 |
参考文献
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