本方案描述了一种实用策略，可在使用染料和冷冻切片进行病毒示踪前，加快立体定位注射坐标的验证步骤。
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本文内容
摘要
摘要
对特定脑区进行立体定位注射是基础神经科学研究中的一项基本实验技术。研究人员通常根据小鼠脑图谱或已发表的文献来确定立体定位注射参数，但这些图谱或文献所使用的可能是不同品系或年龄的小鼠，以及不同的立体定位设备，因此需要对立体定位坐标参数进行进一步验证。钙成像、化学遗传学和光遗传学操作的效果依赖于报告基因在目标区域内的精确表达，而这种表达往往需要数周时间才能完成。因此，如果未预先验证目标脑区的坐标，将耗费大量时间。通过使用适当的染料代替病毒，并结合冷冻切片技术，研究人员可在染料注射后立即观察注射位点，从而在实际注射位置与理论位置存在偏差时，及时调整坐标参数。这种调整可显著提高后续实验中病毒在目标脑区内的表达准确性。
引言
几乎所有现代神经调节工具，包括体内钙成像、光遗传学和化学遗传学工具，都需要使用立体定位坐标来靶向目标脑区1,2,3，这是神经操控的基础。小鼠脑区的立体定位坐标是相对于颅骨上的骨性标志——前囟（bregma）和后囟（lambda）来定义的，由此构成了所谓的颅骨来源立体定位坐标系统。前囟或后囟均可作为三维坐标的零点。三个轴分别为前后轴（AP）、内外侧轴（ML）和背腹轴（DV），对应于立体定位仪器数字显示器上的 y、x 和 z 轴。对于已知的脑区，特定区域的立体定位坐标参数可从小鼠脑图谱4（如Paxinos和Franklin的小鼠脑立体定位坐标图谱）和/或已发表的文献中获得5,6。然而，由于不同研究者所使用的立体定位设备以及小鼠的年龄和种群存在差异，仍需进行进一步验证。
结构是功能的基础。神经环路构成了大脑多种功能的基础，例如认知活动、情绪、记忆、感觉和运动功能1。标记神经环路的结构并操控其活动，对于理解特定神经环路的功能至关重要。在过去的几十年中，神经示踪剂经历了多代....
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方案
所有动物实验均按照《动物研究体内实验报告指南》（ARRIVE）和美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》进行。本研究经上海交通大学医学院仁济医院动物护理与使用委员会批准。本研究使用8周龄C57BL/6J雄性小鼠。动物购自商业来源（见材料表），饲养于标准笼具中（22 °C ± 2 °C，12 h/12 h明暗循环，自由摄食和饮水）。
1. 目标脑区的选择
注意：此操作为无菌过程。确保所有外科器械均已灭菌。在接触外科器械前，用酒精喷洒手套。避免用手套触碰器械尖端或手术区域。在开始操作前，通过检查小鼠是否失去翻正反射以及对皮肤刺激无反应，确认其已充分麻醉。在钻孔和注射前，密切监测呼吸频率（每分钟60-220次，平均为每分钟100-150次）和呼吸幅度（应保持稳定，既不过浅也不过深）。任何呼吸频率或幅度的显著变化均应记录。
- 使用29 G针头通过腹腔注射1.25%三溴乙醇（250 mg/kg）对小鼠进行麻醉。当翻正反射消失后，剃除颅骨表面的毛发。使用鼻夹固定上门齿，并用耳杆稳定头部，将小鼠固定于立体定位仪（见材料表）中。
- 涂抹眼用软膏以防止角膜干燥。用安尔碘（消毒液；见材料表）擦拭头皮三次进行消毒。使用29 G胰岛素针头皮下注射0.2 mL 1%利多....
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结果
本研究通过所述方法在30分钟内成功确定了注射位点。首先，将含有溴酚蓝的SDS-PAGE上样缓冲液注射至C57/BL小鼠的LDTgV区域。图1A展示了染料溶液注射的示意图，图1B显示了蓝色染料在LDTgV中的分布情况。
为评估该方案的普适性，还将溴酚蓝注入到内侧前额叶皮层的前边缘皮层（mPFC prelimbic cortex）、内侧前额叶皮层的下边缘皮层（mPFC infralimbic cortex）以及基底内侧杏仁核（BMA）。如图1C-E和图2A所示，蓝色染料分布在内侧前额叶皮层的前边缘皮层、内侧前额叶皮层的下边缘皮层以及BMA中。
此外，将携带荧光蛋白 mCherry 的腺相关病毒注射至 LDTgV（注射位点通过染料.......
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讨论
本文介绍了一种稳定且快速简便的策略，可在病毒示踪前验证立体定位脑注射的准确性5,6，但报告基因在脑区内的表达对于脑区标记仍具有不可替代的关键作用。我们所使用的蓝色染料可实现对注射位点的即时可视化。
该方案中有几个关键步骤有助于提高注射位点的准确性。首先，在步骤1.5中确保脑组织在立体定位仪中的左右水平；此步骤要求操作者熟悉颅骨解剖结构，确保耳杆放置在正确位置，耳杆和立体定位仪框架上的刻度也可作为参考依据。其次，在步骤1.6和步骤2.3中准确定位零点——前囟（bregma）。有时步骤1.6与步骤2.3中所确定的坐标出现显著偏差，是由于零点定位存在较大差异所致，这可能导致微量注射针无法穿透颅窗。在此情况下，必须重新定位零点，必要时需制作新的颅窗。尽管如此，仍必须在步骤2.3中重新确立零点并重新确定坐标，不可直接通过先前制作的颅窗插入微量注射器。
与使用小鼠脑切片模具切割未冷冻脑组织相比，该方法能提供更准确的结果，因.......
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
国家自然科学基金（项目编号 82101249，授予孙XY）；中国博士后科学基金（项目编号 2022M722125，授予孙XY）；上海市扬帆计划（项目编号 21YF1425100，授予陈SH）；上海市卫生健康委员会临床研究专项项目（项目编号 202340088，授予周J）。国家自然科学基金（项目编号 82101262，授予张X；项目编号 82101287，授予陈SH）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.0 µL，神经外科注射器，型号 7001 KH，32 G，尖端类型 3 | Hamilton | 65458-01 | |
| 200 μL 移液器吸头 | biosharp | BS-200-T | |
| 20 mL 注射器 | Kindly group | ||
| 3% H₂O₂ 溶液 | Lircon 公司 | ||
| 6 孔板 | 生友生物技术 | 20006 | |
| Anerdian | 力康高科技 | 31001002 | |
| 防滚动载片架 | Leica | 14047742497 | |
| BD 胰岛素注射器 | Becton, Dickinson 和公司 | 328421 | |
| 弯齿解剖镊 | 金钟 | JD1050 | |
| Cellsens Dimension 软件 | Olympus | ||
| 棉签 | 费雪科学 | 23-400-122 | |
| Dapi-Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| 钻孔器 | 龙翔 | ||
| 细毛刷 | 华宏 | ||
| 精细剪刀 | 金钟 | y00030 | |
| 荧光显微镜 | Olympus | BX63 | |
| 冷冻切片机 | Leica | CM1950 | |
| 直齿止血钳 | 金钟 | J31010 | |
| 输注针 0.7 mm | Kindly group | ||
| 盐酸利多卡因注射液 | 瀚晖制药有限公司 | 71230803 | |
| 放大镜 | M&G 晨光文具 | ||
| 雄性 C57/BL 小鼠 | 上海市计划生育科学研究所－BK 实验室– | ||
| 小鼠冠状脑切片模具 | RWD 生命科学 | 68713 | |
| 微量离心管 | biosharp | BS-02-P | |
| 切片机刀片 | Leica | 819 | |
| 眼科软膏 | 齐森制药有限公司 | G23HDM9M4S5 | |
| 多聚甲醛 | Biosharp | BL539A | |
| 蠕动泵 | 哈佛仪器 | 70-4507 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Servicebio | G4202 | |
| Piette 2-200 μL | thermofisher | 4642080 | |
| 含溴酚蓝的 SDS-PAGE 样品上样缓冲液 | 碧云天 | P0015A | |
| 剃毛刀片 | BFYING | 91560618 | |
| 载玻片 | 捷特科学 | 188105 | |
| 立体定位仪 | RWD 生命科学 | 68807 | |
| 直齿解剖镊 | 金钟 | JD1060 | |
| 注射器固定架 | RWD 生命科学 | 68206 | |
| 组织剪刀 | 金钟 | J21040 | |
| Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂 | Sakura | 4583 | |
| 三溴乙醇 | 艾贝生物科技 | M2910 |
参考文献
- Liu, D., et al. Brain-derived neurotrophic factor-mediated projection-specific regulation of depressive-like and nociceptive behaviors in the mesolimbic reward circuitry. Pain. 159 (1), 175(2018).
- Gan, Z., et al.
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重印与许可
