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方法文章

荧光微管吸吮法检测红细胞机械感知

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DOI：

10.3791/66265

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2024年1月12日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering, The University of Sydney, 2Charles Perkins Centre, The University of Sydney, 3Heart Research Institute, 4The University of Sydney Nano Institute (Sydney Nano), The University of Sydney

本文内容

摘要

在机械应力下探索细胞行为对于细胞力学和力学生物学的进步至关重要。我们介绍荧光微吸管抽吸（fMPA）技术，这是一种将可控的机械刺激与单细胞内信号通路的全面分析相结合的新型方法。该技术可推动活细胞力学生物学的深入研究。

摘要

微移液管吸吮实验长期以来一直是研究活细胞力学特性的基石，可揭示细胞对机械应力的响应。本文详细介绍了一种荧光偶联微移液管吸吮（fMPA）实验的创新性改进方法。fMPA实验能够在施加精确机械力的同时，实时监测由离子通道介导的活细胞力传导过程。该先进系统包含一个精密制造的硼硅酸盐玻璃微移液管，连接至一个精细调控的水浴储液器和气动吸吮系统，可实现精确控制的压力施加，调节精度高达±1 mmHg。其中一项重要改进是整合了落射荧光成像技术，可在吸吮过程中同步观察并量化细胞形态变化及细胞内钙离子通量。fMPA实验通过将落射荧光成像与微移液管吸吮技术协同结合，在机械环境复杂的条件下为细胞力感知研究设立了新标准。该多维度方法可适用于多种实验配置，为单细胞力感知机制提供关键性见解。

引言

细胞行为研究领域的不断深入揭示了机械刺激（如张力、流体剪切应力、压缩力和基质刚度）在调控细胞黏附、迁移和分化等动态细胞活动中的关键作用。这些力学-生物学特性对于阐明细胞如何与其生理环境相互作用并作出响应至关重要，影响着多种生物学过程1,2。

在过去十年中，基于微移液管的吸吮实验已成为研究细胞对机械刺激多种响应的多功能工具。该技术可在单细胞水平上提供关于活细胞内在力学特性的宝贵信息，包括细胞弹性模量、刚度和皮层张力 张力。这些检测方法能够测量多种力学参数，例如细胞膜 张力、细胞膜所受的压力以及皮层张力（总结于 表1）。对牵引力的研究加深了我们对其如何影响细胞功能和过程的理解，特别是在膜动力学领域，包括膜的断裂、伸长和出芽3,4.

力学参数描述经典研究方法
细胞刚度测量细胞的机械刚性和弹性。对细胞膜施加负压并分析其变形响应20,21。
黏附强度评估细胞与表面黏附的牢固程度。施加可控吸力使黏附细胞从基底上脱离2,22。
膜张力评估细胞膜内部的张力或应力。测量细胞膜在施加压力下的变形情况23,24。
黏弹性特性表征细胞黏性与弹性行为的综合特征。分析细胞在微管吸吮作用下随时间变化的变形响应23,25。
可变形性确定细胞形状改变的难易程度。在可控吸力下评估细胞变形的程度20,24。
表面张力测量细胞表面的张力。评估形成微管膜突起所需的压力26。
细胞-材料相互作用研究细胞与材料或基底之间的相互作用。对接触不同材料的细胞进行吸吮，并观察其相互作用2,24。
细胞-细胞相互作用考察相邻细胞之间的相互作用。吸吮一组细胞并分析其细胞间作用力27。

表1：微吸管抽吸实验测定的力学参数。

基于微移液管的吸吮技术已广泛用于研究红细胞（RBCs），以评估其变形能力及多种力学特性，这对于理解红细胞在循环系统中的功能至关重要。红细胞表现出显著的适应性，在通过复杂的毛细血管网络和内皮细胞间裂隙时，能够保持其力学上的可变性5,6。在此过程中，红细胞必须穿过窄至0.5–1.0 µm的通道，承受包括张力和压缩在内的多种机械力作用7,8,9。它们对血液循环中血流产生的剪切应力也具有高度敏感性10。这些过程可促进涉及钙离子内流的调控机制的激活，而钙信号是细胞响应机械刺激的关键信号事件，其作用已有充分研究证实11,12。由钙介导的机械感知所涉及的复杂机制仍是当前研究的重要课题。

在此背景下，功能性微吸管分析法（fMPA）是一种有效的方法，可用于揭示在精确控制的机械力作用下钙离子动员的程度，同时实现机械调控（利用微吸管吸吮系统）和钙信号强度的可视化（使用荧光指示剂）。该方法特别模拟了红细胞在通过狭窄血管时的生理情境。值得注意的是，我们开发的fMPA系统能够产生分辨率为1 mmHg的压力。所采用的高速相机可实现100 ms的时间分辨率和亚微米级的空间分辨率。这些配置确保了对活细胞施加精确的机械力，并同时捕捉由此产生的细胞信号响应。此外，由于该装置具有集成化工程设计的特点，微吸管吸吮实验可方便地与其他设备或技术联用，从而进一步探究细胞力学的复杂机制。这种多功能性是该方法的另一项优势。

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方案

本方案遵循悉尼大学人类研究伦理委员会的指南，并已获得该委员会的批准。本研究已从供者处获得知情同意。

1. 人红细胞的分离

注意：第1.1步应由经过培训的采血技术人员使用已获机构审查委员会批准的方案进行操作。

  1. 使用19 G蝶形针从肘正中静脉抽取5 mL血液。
  2. 将采集的血液转移至含有1:200依诺肝素的15 mL离心管中，以防止凝血。
  3. 将5 µL依诺肝素抗凝血液加入1 mL碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液（C缓冲液，pH = 8.5–9；材料表）中进行稀释。
  4. 将稀释后的血液样本在900 × g 条件下离心1分钟，使红细胞沉淀。小心倾去上清液，避免扰动沉淀物。
  5. 用1 mL C缓冲液（材料表）对红细胞沉淀物进行两次洗涤，每次均在900 × g 条件下离心1分钟。
  6. 随后，在相同离心条件下，用1 mL Tyrode's缓冲液洗涤红细胞沉淀物2次，最后将沉淀物重悬于1 mL Tyrode's缓冲液中，得到洗涤后的红细胞储备悬液。

2. 钙离子指示剂负载

  1. 根据自动细胞计数仪（材料表）测得的细胞浓度，用 Tyrode's 缓冲液将洗涤后的红细胞悬液浓度调整至 10 × 106 个细胞/mL。
  2. 加入 16.67 µM 的钙敏感性荧光染料 Cal-520 AM，在旋转管式混合器上振荡孵育 1 小时，以标记红细胞内的钙离子。
  3. 将红细胞用含 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）的 Tyrode's 缓冲液按 1:50 比例稀释。此时细胞已准备好用于实验。

3. 微量移液器的制备

  1. 将硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 1 mm × 内径 0.6 mm）安装到 P-1000 微量移液器拉制仪上，使用预设的拉制程序，在拉制位置生成两个尖端封闭的相应微量移液器。本实验设置采用以下拉制程序参数：加热 516，拉力 150，速度 75，时间 250，和 压力 500。
    注意：拉制程序中设定的加热和拉制参数可根据实验设计需求进行调整12。检查点 （见 补充表 S1）。
  2. 将拉制后获得的一个闭口微量移液器安装至微量移液器切割器上，打开其封闭尖端。将加热温度调节至约 50–60 °C。
  3. 使用 10 倍目镜定位微量移液器。通过调节旋钮，将微量移液器移近硼硅酸盐玻璃珠。
  4. 在将微量移液器尽可能靠近硼硅酸盐玻璃珠之前，将目镜更换为 30 倍，注意避免弯折移液器尖端。
  5. 踩下加热踏板，利用热量软化硼硅酸盐玻璃珠。轻柔地将未处理的闭口微量移液器尖端插入软化的玻璃珠中，直至达到所需的终点，即目标开口直径。
  6. 松开脚踏开关，使玻璃珠冷却。确保微量移液器尖端始终保留在玻璃珠内部。
    注意：进一步插入尖端会导致更大的开口直径。
  7. 轻柔地抽出微量移液器，使闭口微量移液器获得清晰的直线切口。确认毛细管最终直径为 1 µm。
    ​注意：检查点 （见 补充表 S1）

4. 细胞室的制备

  1. 使用金刚石笔将一块标准的 40 mm × 22 mm × 0.17 mm 玻璃盖玻片均分为三条等宽的条带。
  2. 用真空脂将其中一条切割后的玻璃盖玻片粘附于自制腔室支架的底部。
    注意：该腔室支架由两个通过弯曲手柄连接的金属（铜/铝）方块组成。两个金属块之间的距离必须小于 40 mm，以便切割后的盖玻片能够粘附在支架上，形成平行腔室。
  3. 用真空脂将第二条切割后的玻璃盖玻片粘附于自制腔室支架的顶部。
    注意：CHECKPOINT （参见 补充表 S1）
  4. 使用 200 µL 移液枪将 200 µL 标记的红细胞悬液注入两片盖玻片之间（图 1）。

血流观察室示意图；腔室支架中盖玻片下的红细胞。
图1：细胞腔室示意图。 使用凡士林将两片尺寸为 40 mm × 22 mm × 0.17 mm 的玻璃盖玻片固定在腔室支架上。在两片切割后的玻璃盖玻片之间，加入约 200 µL 悬浮于Tyrode缓冲液中的细胞溶液。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 微吸管吸吮装置组装

  1. 将细胞腔室安装到显微镜平台上的支架载物台上。调整位置，使细胞腔室正好位于物镜正上方（图2B）。
  2. 将微移液管支架降至与其连接的储水槽液面以下。
  3. 向制备好的微移液管中注入去离子水或Tyrode缓冲液，并使用连接34 G针头的注射器小心去除所有气泡（见材料表）。
  4. 将微移液管支架末端拧松约一半，使液体从微移液管支架中滴出数秒钟。
    注意：检查点 （见 补充表S1）
  5. 将微移液管插入支架尖端，拧紧支架螺钉以确保微移液管固定牢固。
  6. 将微移液管插入细胞腔室，在显微镜下定位微移液管和红细胞。使用显微操作器调整其位置。
  7. 进一步降低微移液管尖端，确保其尖端与目标红细胞处于同一水平面。
    注意：检查点 （见 补充表S1）
  8. 通过调节储水槽的高度，将微移液管尖端的液压调至零。随后略微抬高储水槽，使尖端产生轻微的正压。

6. 进行荧光偶联的微吸管抽吸实验

  1. 打开488 nm荧光激发光源。此阶段不要开启荧光快门，以避免光漂白图 2C开启荧光相机和透射光相机。
    注意：两台相机均使用相应的软件进行操作（参见 材料表).
  2. 设置所需的 曝光时间 (100 ms 对于本研究中的两台相机），感兴趣区域（ROI）， binning 大小（本研究中无），在软件中对两台相机进行设置。打开 多维度采集面板 设置 采集帧数，本研究为 2,000，以及保存目录。
    注意：采集帧数取决于所需记录的吸液事件次数。对于1次吸液事件，采集次数范围应设置在100–500之间，约对应10–50秒。
  3. 使用显微操作器在视野下找到微量移液器。
  4. 打开气动压力夹，包括控制箱和夹紧系统（图2A）。确保 控制箱 在 EXTRNL 模式通过缓慢旋转旋钮来补偿系统内的任何偏置压力。
  5. 打开控制气动夹具的独立软件。该软件配备一个电气控制面板，用于控制夹具系统的离散模拟输入。压力通过20 mV/mmHg的转换系数进行调控。
  6. 将系统内的压力归零。小心地将微移液管移至红细胞附近。调节储水罐的位置，直至微移液管尖端出现轻微的正压。
  7. 在相机操作软件中开始采集。打开 荧光快门.
  8. 通过在控制面板中输入计算出的电压值，以达到所需压力，从而吸取红细胞。
    注意：吸取红细胞时的压力通常在 Δ 范围内p = -5 至 -40 mmHg 微移液管尖端内应能观察到明显的舌状延伸图 2D).
  9. 保持压力至预设时间；然后释放压力。
  10. 移动微量移液器以吸取下一个细胞，并重复实验。

7. 荧光强度分析

  1. 将保存的荧光图像载入分析软件中。
  2. 使用显示调节选项卡调整强度阈值。可通过手动输入数值或使用滑块，确保荧光图像在分析软件中呈现清晰的细胞对比度（参见补充文件1-补充图S1）。
  3. 滚动至软件底部的时间轴，定位指定的吸液事件。
  4. 点击添加新表面，定义分析感兴趣区域（ROI）。
    注意：软件提供一个引导式的五步流程，用于调整并完成分割（参见补充文件1-补充图S2和补充图S3）。
    注意：应尽可能缩小ROI范围，以节省计算资源。
  5. 使用背景减除滑块，并通过滑块调节分割阈值，以获得最佳的分割效果。
    注意：这意味着除吸液事件外，背景应被尽可能准确地分割（参见补充文件1-补充图S4和补充图S5）。
  6. 添加面积滤波器以排除背景噪声（参见补充文件1-补充图S6）。
    注意：此步骤在后期处理阶段完成。
  7. 选择统计选项卡 | 详细选项卡 | 平均值选项卡，滚动查找并选择强度均值（参见补充文件1-补充图S7）。
  8. 将随时间变化的荧光信号轨迹导出为.csv文件。
  9. 打开导出的csv文件，从所有测量值中减去背景信号Fb。
  10. 使用公式（1）计算钙强度变化ΔFmax：
    用于教学的静态平衡公式 ΔFmax 方程。     (1)
    其中ΔFmax为最大钙强度变化，Fb为背景强度，F0为静息强度。

用于微操作的倒置显微镜装置；红细胞分析的明场与荧光示意图。
图 2：荧光耦合微吸管抽吸装置。（A）fMPA 硬件系统的整体示意图，包含结合了明场和荧光相机的倒置显微镜。图像左侧展示了自制的水压计和控制盒，可用于精确调节气动压力泵的压力。（B）显微镜载物台，显示实验用细胞腔室和配备单根微吸管的微操作仪系统。（C）fMPA 系统设置的示意图。通过两个二向色镜同时成像明场（黄色）和荧光信号（蓝色发射，绿色激发），将来自荧光光源（蓝色）的光路引导至目标，再传至相机进行成像（绿色）。（D）上排显示明场图像，下排显示荧光图像。左侧为红细胞处于静息状态时微吸管抽吸前的位置；中间一列表示红细胞受到 -40 mmHg 负压时的抽吸过程；右侧显示细胞在经历负压抽吸后的形态变化。比例尺 = 5 µm。缩写：fMPA = 荧光耦合微吸管抽吸；DM = 二向色镜；RBC = 红细胞。请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

为了建立微管吸吮实验，我们首先构建了一个定制的细胞腔室，该腔室由两个通过手柄连接的金属方块（铜/铝）组成。将两片切去三分之一的玻璃盖玻片（40 mm × 7 mm × 0.17 mm）固定在一起，形成一个可容纳200 µL悬浮于Tyrode缓冲液中的红细胞（RBC）的腔室。将红细胞引入腔室后，将特制的硼硅酸盐微管固定在持针器上，并使用显微操作仪小心地将其置入腔室内。随后，将微管逐渐靠近以捕获目标红细胞。

在细胞吸吮实验中，采用气动高速压力钳来精确调节负压吸吮压力。随后进行荧光成像，以研究在不同负压吸吮压力下钙离子动员的情况。

通过使用fMPA研究红细胞（RBC）对不同负压抽吸力的响应，我们的研究结果表明，施加的负压与被抽吸红细胞中的钙离子内流之间存在明显的正比关系。为确定钙离子强度的变化，将单个被抽吸细胞的最大荧光强度（Fmax）减去背景强度（Fb），再除以静息状态下的荧光强度（F0）减去背景强度（F...

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讨论

微吸管吸吮实验是一种精细的方法，通过施加显著的压力调节、精确的空间控制以及可靠的时序分辨，深入探究细胞生物力学的复杂特性。本研究特别强调使用荧光微吸管吸吮技术（fMPA）作为揭示红细胞（RBCs）在不同刺激下所展现的细微力学敏感反应的关键工具。通过同时利用明场和荧光信号，实现了对细胞现象的多维度观察，推进了对细胞内钙离子实时流入的监测与检测。该方法为理解红细胞复杂的力学感知反应提供了综合性的洞察。

重要的是，fMPA 技术的应用不仅限于红细胞，还可用于其他具有较高机械敏感性的细胞类型，如血小板和神经元9。此外，由于 fMPA 在实验操作过程中对细胞完整性影响极小，能够有效保持细胞的天然状态，因此特别适用于原代细胞的研究1。进一步地，fMPA 方法通过可调节的微吸管几何构型提供了良好的实验灵活性，可针对特定的科学问题设计多样化的实验方案，并有效探索多种力学条件。

此外，随着光学通路的改进，多荧光成像的同步使用得以增强，fMPA 系统能...

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披露

作者声明，他们对本研究无任何竞争利益需要报告。

致谢

我们感谢 Nurul Aisha Zainal Abidin 和 Laura Moldovan 在额外的供体招募、血液采集和采血支持方面提供的帮助。我们感谢 Tomas Anderson 和 Arian Nasser 在设备和试剂组织方面的工作。本研究由澳大利亚研究理事会（ARC）发现项目（DP200101970-L.A.J.）资助；澳大利亚国家健康与医学研究理事会（NHMRC） Ideas 基金（APP2003904-L.A.J.）；NHMRC 设备基金-L.A.J.；新南威尔士州心血管能力建设计划（早期至中期职业研究人员基金-L.A.J.）；新南威尔士州 CVRN-VCCRI 研究创新基金；全球与研究合作办公室（悉尼-格拉斯哥合作奖-L.A.J.）提供支持。L.A.J. 是澳大利亚国家心脏基金会未来领袖研究员二级（105863）以及 Snow 医学研究基金会研究员（2022SF176）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
µ经理Micro-Manager版本 2.0.0
1 mL 注射器 Terumo210320D与 Microfil 合作 
200 µL型移液管 Eppendorf 3123000055红细胞制备
22 x 40 mm 盖玻片克尼特尔玻璃 MS0014细胞室组装
50 mL 注射器 Terumo220617E连接至水塔
氯化钙（CaCl2)Sigma-AldrichC1016特赖德氏  缓冲液配制 - 12 mM NaHCO₃3，10 mM HEPES、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl 和 5.5 mM D-葡萄糖，补充 1 mM CaCl2最终 pH = 7.2
Centrifuge 5425Eppendorf 5405000280红细胞制备
ClexaneSigma-Aldrich1235820为防止采集的血液凝固。10,000 U/mL
DAQami严谨
荧光光源CoolLEDpE-300微流控移液管吸吮硬件系统
玻璃毛细管NarishigeG-1微移液管的制备
葡萄糖Sigma-AldrichG8270特赖德氏  缓冲液配制 - 12 mM NaHCO₃3，10 mM HEPES、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl 和 5.5 mM D-葡萄糖，并添加 1 mM CaCl2最终 pH = 7.2
HEPESThermo Fisher15630080特赖德氏  缓冲液配制 - 12 mM NaHCO₃3，10 mM HEPES、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl 和 5.5 mM D-葡萄糖，并添加 1 mM CaCl2最终 pH = 7.2
高速GigE相机曼塔G-040B微流控移液管吸吮硬件系统
高速压力钳制科学仪器HSPC-2-SB与压力泵协同工作
高速压力钳制载物台 科学仪器HSPC-2-SB与压力泵协同工作
ImarisOxford Instruments
倒置显微镜 奥林巴斯 Olympus IX83微流控移液管吸吮硬件系统
微丝 World Precision Instruments MF34G-534 G（67 mm 长）
去除切割后微移液管中的气泡，并检测移液管尖端的开口情况 
微移液管拉制仪 Sutter仪器P1000微移液管的制备 
Milli Q EQ 7000 超纯水净化系统默克密理博ZEQ7000T0C碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液 &以及 Tyrode 缓冲液的配制
移液管微加工仪 NarishigeMF-900微移液管的制备
氯化钾（KCl）Sigma-AldrichP9541特赖德氏  缓冲液配制 - 12 mM NaHCO₃3，10 mM HEPES、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl 和 5.5 mM D-葡萄糖，补充 1 mM CaCl2最终 pH = 7.2
压力泵 科学仪器PV-PUMP在实验过程中施加可控压力
Prime 95B 相机 PhotometricsPrime 95B sCMOS荧光成像
旋转轮远程单元 Sensapex uM-RM3微移液管位置调节控制面板 
Scepter 3.0 手持式细胞计数器默克密理博PHCC340KIT自动细胞计数器
碳酸氢钠 (NaHCO₃)3)Sigma-AldrichS5761碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液配制——2.65 g NaHCO₃3 含 2.1 g Na2CO3 在250 mL的Mili Q水中 - 最终pH = 8-9。
碳酸钠（Na2二氧化碳3)Sigma-AldrichS2127碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液配制 - 2.65 g NaHCO₃3 含 2.1 g Na2CO3 在250 mL的Mili Q水中 - 最终pH = 8-9。
氯化钠 (NaCl)Sigma-AldrichS7653特赖德氏  缓冲液配制 - 12 mM NaHCO₃3，10 mM HEPES、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl 和 5.5 mM D-葡萄糖，补充 1 mM CaCl2最终 pH = 7.2
磷酸二氢钠
一水合物（NaH2PO4 • H2O)		Sigma-AldrichS9638特赖奥德  缓冲液配制 - 12 mM NaHCO₃3，10 mM HEPES、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl 和 5.5 mM D-葡萄糖，补充 1 mM CaCl2最终 pH = 7.2
触摸屏控制单元 Sensapex 微米级张力传感细胞微移液管位置调节控制面板 
X 干镜物镜 奥林巴斯 奥林巴斯 60x/0.70 LUCPlanFL微流控移液管吸吮硬件系统

参考文献

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