在机械应力下探索细胞行为对于细胞力学和力学生物学的进步至关重要。我们介绍荧光微吸管抽吸（fMPA）技术，这是一种将可控的机械刺激与单细胞内信号通路的全面分析相结合的新型方法。该技术可推动活细胞力学生物学的深入研究。
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摘要
摘要
微移液管吸吮实验长期以来一直是研究活细胞力学特性的基石，可揭示细胞对机械应力的响应。本文详细介绍了一种荧光偶联微移液管吸吮（fMPA）实验的创新性改进方法。fMPA实验能够在施加精确机械力的同时，实时监测由离子通道介导的活细胞力传导过程。该先进系统包含一个精密制造的硼硅酸盐玻璃微移液管，连接至一个精细调控的水浴储液器和气动吸吮系统，可实现精确控制的压力施加，调节精度高达±1 mmHg。其中一项重要改进是整合了落射荧光成像技术，可在吸吮过程中同步观察并量化细胞形态变化及细胞内钙离子通量。fMPA实验通过将落射荧光成像与微移液管吸吮技术协同结合，在机械环境复杂的条件下为细胞力感知研究设立了新标准。该多维度方法可适用于多种实验配置，为单细胞力感知机制提供关键性见解。
引言
细胞行为研究领域的不断深入揭示了机械刺激（如张力、流体剪切应力、压缩力和基质刚度）在调控细胞黏附、迁移和分化等动态细胞活动中的关键作用。这些力学-生物学特性对于阐明细胞如何与其生理环境相互作用并作出响应至关重要，影响着多种生物学过程1,2。
在过去十年中，基于微移液管的吸吮实验已成为研究细胞对机械刺激多种响应的多功能工具。该技术可在单细胞水平上提供关于活细胞内在力学特性的宝贵信息，包括细胞弹性模量、刚度和皮层张力 张力。这些检测方法能够测量多种力学参数，例如细胞膜 张力、细胞膜所受的压力以及皮层张力（总结于 表1）。对牵引力的研究加深了我们对其如何影响细胞功能和过程的理解，特别是在膜动力学领域，包括膜的断裂、伸长和出芽3,4.
| 力学参数 | 描述 | <.... |
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方案
本方案遵循悉尼大学人类研究伦理委员会的指南，并已获得该委员会的批准。本研究已从供者处获得知情同意。
1. 人红细胞的分离
注意：第1.1步应由经过培训的采血技术人员使用已获机构审查委员会批准的方案进行操作。
- 使用19 G蝶形针从肘正中静脉抽取5 mL血液。
- 将采集的血液转移至含有1:200依诺肝素的15 mL离心管中，以防止凝血。
- 将5 µL依诺肝素抗凝血液加入1 mL碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液（C缓冲液，pH = 8.5–9；材料表）中进行稀释。
- 将稀释后的血液样本在900 × g 条件下离心1分钟，使红细胞沉淀。小心倾去上清液，避免扰动沉淀物。
- 用1 mL C缓冲液（材料表）对红细胞沉淀物进行两次洗涤，每次均在900 × g 条件下离心1分钟。
- 随后，在相同离心条件下，用1 mL Tyrode's缓冲液洗涤红细胞沉淀物2次，最后将沉淀物重悬于1 mL Tyrode's缓冲液中，得到洗涤后的红细胞储备悬液。
2. 钙离子指示剂负载
- 根据自动....
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结果
为了建立微管吸吮实验，我们首先构建了一个定制的细胞腔室，该腔室由两个通过手柄连接的金属方块（铜/铝）组成。将两片切去三分之一的玻璃盖玻片（40 mm × 7 mm × 0.17 mm）固定在一起，形成一个可容纳200 µL悬浮于Tyrode缓冲液中的红细胞（RBC）的腔室。将红细胞引入腔室后，将特制的硼硅酸盐微管固定在持针器上，并使用显微操作仪小心地将其置入腔室内。随后，将微管逐渐靠近以捕获目标红细胞。
在细胞吸吮实验中，采用气动高速压力钳来精确调节负压吸吮压力。随后进行荧光成像，以研究在不同负压吸吮压力下钙离子动员的情况。
通过使用fMPA研究红细胞（RBC）对不同负压抽吸力的响应，我们的研究结果表明，施加的负压与被抽吸红细胞中的钙离子内流之间存在明显的正比关系。为确定钙离子强度的变化，将单个被抽吸细胞的最大荧光强度（Fmax）减去背景强度（Fb），再除以静息状态下的荧光强度（F0）减去背景强度（F.......
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讨论
微吸管吸吮实验是一种精细的方法，通过施加显著的压力调节、精确的空间控制以及可靠的时序分辨，深入探究细胞生物力学的复杂特性。本研究特别强调使用荧光微吸管吸吮技术（fMPA）作为揭示红细胞（RBCs）在不同刺激下所展现的细微力学敏感反应的关键工具。通过同时利用明场和荧光信号，实现了对细胞现象的多维度观察，推进了对细胞内钙离子实时流入的监测与检测。该方法为理解红细胞复杂的力学感知反应提供了综合性的洞察。
重要的是，fMPA 技术的应用不仅限于红细胞，还可用于其他具有较高机械敏感性的细胞类型，如血小板和神经元9。此外，由于 fMPA 在实验操作过程中对细胞完整性影响极小，能够有效保持细胞的天然状态，因此特别适用于原代细胞的研究1。进一步地，fMPA 方法通过可调节的微吸管几何构型提供了良好的实验灵活性，可针对特定的科学问题设计多样化的实验方案，并有效探索多种力学条件。
此外，随着光学通路的改进，多荧光成像的同步使用得以增强，fMPA 系统能.......
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披露
作者声明，他们对本研究无任何竞争利益需要报告。
致谢
我们感谢 Nurul Aisha Zainal Abidin 和 Laura Moldovan 在额外的供体招募、血液采集和采血支持方面提供的帮助。我们感谢 Tomas Anderson 和 Arian Nasser 在设备和试剂组织方面的工作。本研究由澳大利亚研究理事会（ARC）发现项目（DP200101970-L.A.J.）资助；澳大利亚国家健康与医学研究理事会（NHMRC） Ideas 基金（APP2003904-L.A.J.）；NHMRC 设备基金-L.A.J.；新南威尔士州心血管能力建设计划（早期至中期职业研究人员基金-L.A.J.）；新南威尔士州 CVRN-VCCRI 研究创新基金；全球与研究合作办公室（悉尼-格拉斯哥合作奖-L.A.J.）提供支持。L.A.J. 是澳大利亚国家心脏基金会未来领袖研究员二级（105863）以及 Snow 医学研究基金会研究员（2022SF176）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| µ经理 | Micro-Manager | 版本 2.0.0 | |
| 1 mL 注射器 | Terumo | 210320D | 与 Microfil 合作 |
| 200 µL型移液管 | Eppendorf | 3123000055 | 红细胞制备 |
| 22 x 40 mm 盖玻片 | 克尼特尔玻璃 | MS0014 | 细胞室组装 |
| 50 mL 注射器 | Terumo | 220617E | 连接至水塔 |
| 氯化钙（CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | 特赖德氏 缓冲液配制 - 12 mM NaHCO₃3，10 mM HEPES、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl 和 5.5 mM D-葡萄糖，补充 1 mM CaCl2最终 pH = 7.2 |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000280 | 红细胞制备 |
| Clexane | Sigma-Aldrich | 1235820 | 为防止采集的血液凝固。10,000 U/mL |
| DAQami | 严谨 | ||
| 荧光光源 | CoolLED | pE-300 | 微流控移液管吸吮硬件系统 |
| 玻璃毛细管 | Narishige | G-1 | 微移液管的制备 |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G8270 | 特赖德氏 缓冲液配制 - 12 mM NaHCO₃3，10 mM HEPES、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl 和 5.5 mM D-葡萄糖，并添加 1 mM CaCl2最终 pH = 7.2 |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | 特赖德氏 缓冲液配制 - 12 mM NaHCO₃3，10 mM HEPES、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl 和 5.5 mM D-葡萄糖，并添加 1 mM CaCl2最终 pH = 7.2 |
| 高速GigE相机 | 曼塔 | G-040B | 微流控移液管吸吮硬件系统 |
| 高速压力钳制 | 科学仪器 | HSPC-2-SB | 与压力泵协同工作 |
| 高速压力钳制载物台 | 科学仪器 | HSPC-2-SB | 与压力泵协同工作 |
| Imaris | Oxford Instruments | ||
| 倒置显微镜 | 奥林巴斯 | Olympus IX83 | 微流控移液管吸吮硬件系统 |
| 微丝 | World Precision Instruments | MF34G-5 | 34 G（67 mm 长） 去除切割后微移液管中的气泡，并检测移液管尖端的开口情况 |
| 微移液管拉制仪 | Sutter仪器 | P1000 | 微移液管的制备 |
| Milli Q EQ 7000 超纯水净化系统 | 默克密理博 | ZEQ7000T0C | 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液 &以及 Tyrode 缓冲液的配制 |
| 移液管微加工仪 | Narishige | MF-900 | 微移液管的制备 |
| 氯化钾（KCl） | Sigma-Aldrich | P9541 | 特赖德氏 缓冲液配制 - 12 mM NaHCO₃3，10 mM HEPES、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl 和 5.5 mM D-葡萄糖，补充 1 mM CaCl2最终 pH = 7.2 |
| 压力泵 | 科学仪器 | PV-PUMP | 在实验过程中施加可控压力 |
| Prime 95B 相机 | Photometrics | Prime 95B sCMOS | 荧光成像 |
| 旋转轮远程单元 | Sensapex | uM-RM3 | 微移液管位置调节控制面板 |
| Scepter 3.0 手持式细胞计数器 | 默克密理博 | PHCC340KIT | 自动细胞计数器 |
| 碳酸氢钠 (NaHCO₃)3) | Sigma-Aldrich | S5761 | 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液配制——2.65 g NaHCO₃3 含 2.1 g Na2CO3 在250 mL的Mili Q水中 - 最终pH = 8-9。 |
| 碳酸钠（Na2二氧化碳3) | Sigma-Aldrich | S2127 | 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液配制 - 2.65 g NaHCO₃3 含 2.1 g Na2CO3 在250 mL的Mili Q水中 - 最终pH = 8-9。 |
| 氯化钠 (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | 特赖德氏 缓冲液配制 - 12 mM NaHCO₃3，10 mM HEPES、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl 和 5.5 mM D-葡萄糖，补充 1 mM CaCl2最终 pH = 7.2 |
| 磷酸二氢钠 一水合物（NaH2PO4 • H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | 特赖奥德 缓冲液配制 - 12 mM NaHCO₃3，10 mM HEPES、0.137 M NaCl、2.7 mM KCl 和 5.5 mM D-葡萄糖，补充 1 mM CaCl2最终 pH = 7.2 |
| 触摸屏控制单元 | Sensapex | 微米级张力传感细胞 | 微移液管位置调节控制面板 |
| X 干镜物镜 | 奥林巴斯 | 奥林巴斯 60x/0.70 LUCPlanFL | 微流控移液管吸吮硬件系统 |
参考文献
- González-Bermúdez, B., Guinea, G. V., Plaza, G. R. Advances in micropipette aspiration: applications in cell biomechanics, models, and extended studies. Biophysical Journal. 116 (4), 587-594 (2019).
- Mierke, C. T.
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重印与许可
