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方法文章

改良恐惧条件化以诱导小鼠飞行行为

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DOI：

10.3791/66266

⸱

2023年12月15日

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Kanazawa Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

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摘要

为了研究在恐惧情境下的逃跑行为，我们引入了一种改良的恐惧条件化方案。该方案可确保小鼠在恐惧条件化过程中呈现提示信号时持续表现出逃跑行为。

摘要

在威胁情境中恰当地表现出防御行为对生存至关重要。主流理论认为，当威胁迫近或实际存在时，个体会表现出主动防御行为（如跳跃或快速逃窜）；而当威胁可被预测但迫近程度较低时，则表现为被动防御行为（如僵直不动）。在经典恐惧条件反射实验中，受试者通常表现出以僵直为主的条件性防御反应，大多数情况下几乎不出现主动防御行为。本文介绍一种改良的小鼠恐惧条件反射实验方法，可用于观察僵直与逃跑行为之间的相互转换。该方法在两天内进行五次条件刺激（CS；持续音调，8 kHz，95 dB SPL（声压级））与非条件刺激（US；足底电击，0.9 mA，1.0 s）的重复配对。这种改良的恐惧条件反射程序需要较多的训练次数和训练天数，但无需高强度电击即可适度诱发逃跑行为。使用相同的环境背景进行条件化训练及显著的条件刺激呈现，对于诱发逃跑行为至关重要。该改良方法是一种可靠的小鼠主动防御行为观测手段，有助于深入阐明在恐惧情境下此类行为的精细机制与特征。

引言

在威胁情况下选择适当的防御行为对所有动物的生存至关重要。防御行为会根据威胁的临近程度逐渐从一种转变为另一种，例如在僵直和逃跑行为之间的转换1,2,3。这些行为的失调常在多种精神障碍中被观察到4。创伤后应激障碍（PTSD）就是其中一种以过度防御行为为特征的疾病，例如对无威胁性刺激产生恐慌反应4。

啮齿类动物的经典恐惧条件反射通常被用作创伤后应激障碍（PTSD）的模型5,6,7，但在此模型中，啮齿类动物并不表现出逃跑（类似惊恐）的行为8。因此，这种常被称为“啮齿类动物PTSD模型”的经典恐惧条件反射模型，在模拟人类PTSD方面缺乏表观效度，尤其难以捕捉逃跑或惊恐样症状，而这些症状迄今尚未得到充分研究。

最近，多种改良的恐惧条件化方案已成功证明，啮齿类动物在这些实验过程中会表现出逃跑行为。例如，将条件刺激（CS）与非条件刺激（US）在一天内重复配对七次，可使雌性大鼠表现出类似于逃跑行为的急冲动作9。在采用序列复合刺激（SCS；由音调后接噪音组成）的两日恐惧条件化实验中，小鼠在SCS呈现的噪音阶段即开始出现逃跑行为10,11,12。SCS方法的详细描述见于一份实验方案报告13。使用SCS进行为期三天的恐惧条件化同样可诱导大鼠产生逃跑行为14。然而，这些新方案仍存在一些局限性。例如，序列性线索呈现方式无法排除距离估计对防御行为的影响。在大鼠CS-US七次配对实验中，大多数逃跑反应出现在雌性而非雄性个体中。

基于上述考虑，我们提出一种改良的小鼠恐惧条件化方案，用于研究在恐惧情境下的逃跑行为。雄性小鼠在我们的改良恐惧条件化过程中始终表现出逃跑行为。在本方案中，采用显著的音调作为条件刺激（CS），而非空间条件刺激（SCS）。此外，每天至少进行五次CS与非条件刺激（US）的配对，持续至少两天，并通过条件化环境增强恐惧反应。该方案为研究逃跑行为提供了另一种选择，可根据研究目的与以往的方案相互补充。

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方案

本实验方案遵循日本生理学会的指导原则，并获得了金泽医科大学动物护理委员会的批准（2021-32）。所有实验操作均符合ARRIVE指南的要求。研究使用成年雄性C57BL/6J小鼠（3-6月龄），且此前已确认这些小鼠表现出本文所述的逃跑行为15。

1. 动物准备

  1. 将小鼠分组饲养（每笼3-4只，在23-27 °C条件下维持，12小时光照/12小时黑暗循环，自由获取食物和水），直至实验开始。
  2. 在进行改良的恐惧条件反射实验前，将每只小鼠单独饲养于聚甲基丙烯酸甲酯（plexiglass）笼中（14 cm × 21 cm × 12 cm），至少3天。

2. 设置工具/设备

  1. 恐惧条件化实验箱（图1A）
    1. 使用一个恐惧条件化实验舱（25 cm × 25 cm × 25 cm），置于隔音箱（67 cm × 53 cm × 55 cm）内（参见材料表）。
    2. 需要两种不同的环境（A 和 B）。对于环境 A，通过在墙壁上粘贴带有黑色胶带（宽 3 cm，每板 4 条）的白色塑料纸板，形成黑白条纹；地面使用白色光滑塑料板。
    3. 每次实验前用 1% 庚醇擦拭墙壁和地面。
      注：不使用主动通风系统。实验结束后用酒精清洁可减弱庚醇气味。
    4. 对于环境 B，移除环境 A 中使用的墙壁板，使墙壁整体呈黑色；地面使用栅格地板。
      注：除清洁时残留的轻微酒精气味外，不添加任何特定气味。
    5. 使用安装在顶部的白色发光二极管（LED，240 lux）照明实验箱（参见材料表）。
  2. 电击装置
    1. 将一个随机电击发生器（参见材料表）连接至由不锈钢棒组成的栅格地面，用于施加足底电击。足底电击强度设定为 0.9 mA，依据的是恐惧条件化的常用方法10,11,12,13。
  3. 音频发生器
    1. 在天花板上安装一个扬声器（参见材料表），所有声学刺激均通过该设备放大。
    2. 使用数字方式调节并校准每个刺激的总体振幅，使在距离扬声器前方 5 cm 处，通过 ¼ 英寸麦克风测得的声压级（SPL，参考值：20 µPa）达到设定值。通过该扬声器呈现连续的纯音脉冲。
      注：在此改良的恐惧条件化实验中，精确校准扬声器对研究声音刺激对防御行为的细微影响至关重要。
  4. 传感器
    1. 将测试舱的地面置于一个传感器（参见材料表）上，用于检测振动。传感器信号以 8 kHz 的采样频率传输至声卡，用于记录行为引起的振动。
  5. 视频摄像机
    1. 在天花板上安装一个 CMOS 摄像头（参见材料表），用于追踪受试动物的运动并记录条件化箱内的声音。
  6. 触发系统
    1. 使用声音软件（参见材料表）在预定时间触发声音或足底电击。
      注：任何市售的刺激发生器均可满足此需求。

3. 行为学实验

  1. 安排为期四天的恐惧条件化实验流程：适应期（1天，5次试验）、条件化期（2天，每天5次试验）和测试/消退期（1天，5次或15次试验）。各次试验之间的间隔时间为60–75秒（图1B）。
    注意：建议每组包含十只或更多实验对象，以获得可靠的行为趋势。根据研究目的，需设置两组或三组。
    1. 在条件化阶段，如图1B所示，在条件刺激（CS）（持续纯音脉冲，8 kHz，20秒，95 dB SPL）结束之后立即给予非条件刺激（US）（1秒，0.9 mA）。每个条件化日给予5组CS-US配对刺激。
    2. 第5次足底电击结束后，将实验对象保留在环境中1分钟，然后放回其居住笼。每次行为测试结束后，使用70%酒精擦拭实验箱以进行清洁。
      注意：可根据研究目的调整CS和US的强度。已有文献报道，较强的CS强度会引发比弱强度更活跃的防御行为15。条件化天数也可适当延长。
  2. 按照以下时间表，在CS呈现期间诱导逃避行为。
    注意：本实验中使用的CS为95 dB SPL，US为0.9 mA。
    1. 第1天，在情境A中对实验对象进行5次仅CS的试验。
    2. 第2天和第3天，在情境B中对实验对象进行5次CS-US关联试验。
    3. 第4天，在情境B中进行回忆测试，给予实验对象5次仅CS的试验。若需检测记忆消退情况，则给予15次仅CS的试验。
      ​注意：为检测记忆稳定性，可将消退测试延长至2–3天。此外，将记忆测试推迟至一周后而非第4天进行，可进一步验证记忆的稳定性。

4. 防御行为的分析

注意：分析在条件刺激（CS）呈现期间的运动情况、僵直百分比以及跳跃次数。具体细节如下所述。如果可能，建议采用双盲方式进行分析。

  1. 通过使用视频中记录的音调起始时间，同步视频中事件的时间与刺激（条件刺激 CS 和非条件刺激 US）的时间。
  2. 利用自定义代码，根据帧间小鼠轮廓质心位置的变化，计算小鼠的平均运动量和总运动量。
    注意：由于运动速度依赖于视频的采样率，因此该测量使用任意单位。
  3. 为测量僵直（freezing）百分比，需使用随时间变化的换能器信号。
    1. 使用20–500 Hz的带通滤波器对换能器信号进行预处理。
    2. 对每个50 ms时间窗口内的换能器信号，计算其均方根振幅。
    3. 设定信号振幅阈值以检测静止期。静止持续时间定义为信号低于阈值且持续超过1秒的时间段。
    4. 通过观看视频手动测量僵直持续时间。
    5. 通过比较手动测量的僵直百分比与基于换能器信号计算出的百分比，调整用于判定僵直的信号振幅阈值。
  4. 从视频文件中手动统计跳跃次数。
    ​注意：统计快速冲刺（darts）次数也有助于评估逃逸反应。

5. 统计分析

  1. 将统计学显著性水平设定为 p < 0.05。
  2. 对于多个组别和多个因素之间的比较，采用多因素方差分析（multiway ANOVA），随后进行事后检验。若对条件化方案中的特定某天进行检验，则执行多重比较检验或置换检验。

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结果

采用改良的恐惧条件反射实验对雄性小鼠（C57BL/6J；3–6月龄）进行研究，实验流程如图1C所示。本实验旨在探究条件化环境对逃跑行为表达的影响。实验分为两组：第1组（n = 10）和第2组（n = 10）。实验中使用的条件刺激（CS）为95 dB SPL的声音，非条件刺激（US）为0.9 mA的电击。

在第1天，所有小鼠在A环境中接受5次仅条件刺激（CS）的暴露试验。随后，在第2天和第3天，所有小鼠在B环境中接受5次条件刺激-非条件刺激（CS-US）的联合训练。在第4天，第1组小鼠在B环境中进行5次仅条件刺激的回忆测试，而第2组则在A环境中进行测试。

第1组受试者在第3天和第4天的条件刺激（CS）呈现期间表现出明显的逃跑行为，例如跳跃或短距离快速移动（见图2A、B）。在条件刺激呈现期间，总运动次数和跳跃次数随着条件化过程的进展而增加（

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讨论

本文介绍的改良恐惧条件化方案是一种在恐惧情境下研究逃逸行为的稳定方法。通过采用该方案，我们发现小鼠在恐惧情境中的逃逸行为由显著刺激触发，并依赖于所处的情境。由于此前缺乏合适的观察逃逸行为的方案，逃逸行为的特征尚未得到充分研究。该方案将成为研究恐惧情境下主动防御行为的适宜方法之一。

近期，除了本方案外，还出现了若干其他实验方案。通过多天的SCS条件化训练，可在小鼠和大鼠呈现提示刺激期间稳定诱导出逃跑行为10,11,12,13,14。此外，单日内进行七次重复的CS-US关联训练可使雌性大鼠表现出冲刺行为（darting），即一种逃跑行为9。这些方案均具有可靠性，与本文介绍的方案一样，但包括本方案在内的各种方案均各有优...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

本工作部分由以下机构资助：KAKENHI 基金项目 JP22K15795（资助 T.F.）、JP22K09734（资助 N.K.）、JP21K07489（资助 R.Y.）、金泽医科大学（项目编号 C2022-3、D2021-4，资助 R.Y.）以及内藤基金会（资助 T.F.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
音频扬声器FostexFT17H
放大器SonyTA-F500
CMOS 相机Sanwa Supply Inc.CMS-V43BK
恐惧条件反射实验箱Panlab S.L.U.LE116
食物颗粒NosanLabo MR standard
LEDYamazenLT-B05N
麦克风ACOtype 4156N
随机电击器Panlab S.L.U.LE 100-26
声卡BehringerUMC202
声音处理软件Syntrillium SoftwareCool Edit 2000
换能器Panlab S.L.U.LE 111

参考文献

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勘误


Formal Correction: Erratum: Modified Fear Conditioning for Inducing Flight Behaviors in Mice
Posted by JoVE Editors on 5/17/2024. Citeable Link.

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