棘阿米巴 spp. 运动性的定量分析

摘要

本实验方案描述了如何对Acanthamoeba spp.的运动性进行可视化、追踪和定量分析。

摘要

Acanthamoeba 角膜炎是一种严重的感染性眼病，治疗困难，可能导致失明。尽管这种病原体分布广泛，且在接触水后可能污染隐形眼镜，但其自然行为仍不明确。了解 Acanthamoeba 的运动模式有助于揭示其如何在隐形眼镜上定植并污染患者角膜。幸运的是，Acanthamoeba spp. 在4倍明场显微镜下即可被观察到。此前已有技术用于量化 Acanthamoeba 的运动性，例如结合细胞病变效应或在电场暴露不足条件下的研究。本文介绍一种可长期（数小时至数天）追踪并量化 Acanthamoeba spp. 运动性的方法，该方案适用于多种阿米巴菌株、不同表面以及不同营养状态的阿米巴。该实验流程可用于获取多种核心运动参数，如移动距离、速度、限制性及方向性，这些参数对于监测感染、增殖或行为变化的不同阶段至关重要。

引言

Acanthamoeba 研究近年来显著增加，主要原因在于 Acanthamoeba 角膜炎（AK）的发病率不断上升，这是一种由 Acanthamoeba 附着于角膜后引发的寄生虫感染¹。尽管 AK 疫情暴发可归因于不当的隐形眼镜护理或低效的隐形眼镜护理液^2,3,4,5，但目前市场上尚无任何产品被强制要求证明其对 Acanthamoeba 具有消毒功效。然而，科学界及标准制定机构正在积极努力，以评估用于量化隐形眼镜护理产品消毒效果所必需的实验方案^6,7。此外，由于 Acanthamoeba 在细胞结构和功能方面与人类巨噬细胞具有相似性，除其自身致病性外，还被认为在携带和传播其他人类病原体方面具有重要作用⁸。

近年来已有研究描述了能够定量分析Acanthamoeba运动能力的技术——该原虫通常不易受布朗运动影响^9,10，可用于评估其致细胞病变效应或在电场暴露不足条件下的行为^9,11，以及利用Acanthamoeba作为可追踪的病毒载体在巨型病毒研究中推进运动性分析的进展^12,13。在过去20年中，随着新型软件（如本研究所用成像软件）、新算法及深度学习技术的发展，细胞与颗粒追踪技术也持续取得显著进步¹⁴。然而，针对台式实验研究、临床应用及工业标准而言，该领域仍属相对新兴且不断发展的方向，目前关于可视化并追踪该阿米巴原虫的方法学报道仍十分有限，尤其是用于量化其在黏附隐形眼镜后、或在隐形眼镜消毒过程中及之后行为变化的研究尤为缺乏。其他致力于长期视觉监测的领域为此类研究提供了支持^15,16,17。由于Acanthamoeba本身具有诸多挑战性特征——包括对质粒普遍具有抗性（而质粒可赋予荧光标记）、阿米巴能够摄取并破坏常规细胞染料，以及其独特的外层蛋白质结构导致抗体标记困难——使得其他细胞常用的、可在明场成像以外条件下实现可视化的技术在该生物体中无法应用。因此，对这种阿米巴运动能力的定量分析已显著推动了该领域的发展。通过本研究所述方法，我们已确认阿米巴在无营养条件下仍可保持运动能力至少12小时¹⁸，且经消毒处理后运动能力暂时丧失的阿米巴，只要未被完全裂解，便可在消毒结束后恢复其运动性¹⁹。

本方案详细介绍了如何在显微镜下直观追踪并定量分析变形虫的运动能力。主要步骤包括：在明场条件下以适当的焦距和图像采集时间间隔记录变形虫的运动；利用图像处理软件将图像转换为二值图像；然后使用图像软件的追踪插件设定实验参数，逐个追踪每只变形虫，以获取速度、移动距离和限制性等所需测量参数。在此基础上，可进一步定量分析单个变形虫或变形虫群体的趋化性，以确定其运动方向性。该方法的关键贡献在于能够可视化并量化变形虫在不同营养支持状态、表面黏附性、消毒剂刺激或与其他环境变化（如与哺乳动物细胞共培养）条件下的行为表现。

方案

1. Acanthamoeba 的制备

注意：本方案已验证适用于ATCC 50655、30872、50702、30010、30461、50370、50703、30137、PRA-115和PRA-411。该病原体属于生物安全等级2级（BSL2），应在BSL2级生物安全柜及相应实验室环境中操作。

1. 通过在T75培养瓶中加入30 mL AC6培养基，并无菌接种一个菌块或样品冻存管中的内容物，制备主培养物²⁰。将培养瓶置于26–30 °C培养3–5天，直至培养瓶底部50%至80%被细胞覆盖。
2. 在需要使用细胞的前一天进行传代，以获得均一的滋养体群体。
   1. 根据菌株需求，轻轻振荡并快速敲击主培养瓶2次，使贴壁的滋养体脱落。
   2. 在T75培养瓶中加入30 mL AC6培养基，再加入2 mL主培养物进行传代。将培养瓶置于26–30 °C培养18–24小时。
3. 收获前，在显微镜下以4倍物镜观察滋养体群体，确保滋养体贴壁良好且形态均一。
4. 快速敲击培养瓶2次，使贴壁滋养体脱落，将内容物倒入50 mL锥形离心管中。
5. 将离心管在平衡的离心机中以500 × g 离心5分钟，沉淀阿米巴细胞。倾去或用移液器吸除上清培养基并弃去。用2–10 mL ¼ Ringer's溶液重悬沉淀。
6. 涡旋混匀样品。取10 µL样品加入一次性血细胞计数板，计数Acanthamoeba的CFU/mL。
7. 根据血细胞计数板的计数结果，用¼ Ringer's溶液将阿米巴沉淀稀释至浓度为7.5 × 10³ 个细胞/mL。
8. 将阿米巴接种于不同表面，表面材质可为玻璃、塑料或非营养琼脂，孔板形状可根据实验需求选择，如下所述：
   1. 96孔板：每孔接种200 µL Acanthamoeba 悬液，并盖上盖子。
   2. 48孔板：每孔接种1 mL Acanthamoeba 悬液，并盖上盖子。
   3. 流动池：通过无菌铝制流动池的无菌接口缓慢加入4 mL Acanthamoeba 悬液，避免反应室内产生气泡。加样后关闭接口夹。
9. 成像前，需让阿米巴在表面贴附至少30分钟，再开始显微记录。

2. 观察与记录 Acanthamoeba

1. 在明场下以 4 倍物镜放大观察变形虫。背景应呈浅灰色，变形虫应为黑色。调节光线和焦距，使变形虫呈现为实心深色圆圈而非半透明状（即略微离焦状态，图 1）。
   注意：出于多种原因，4 倍物镜是追踪分析的最佳放大倍数：在追踪过程中离开或进入视野的变形虫不应纳入数据分析，因此较低放大倍数可在一定时间内使最多数量的变形虫被包含在分析中。为将变形虫转换为二值图像以进行追踪分析，其在明场下应呈现为实心黑色圆圈。较低放大倍数更容易实现这一效果，因为较高放大倍数容易显现出变形虫的半透明特性和内部结构。通常情况下，较低放大倍数可在单个视野中捕获更多的变形虫，从而支持更稳健的数据分析。
2. 在成像软件中设置录制程序，以固定时间间隔拍摄图像以追踪变形虫。为实现准确追踪，图像之间的最长时间间隔为 30 秒；兼顾文件大小与追踪细节的推荐时间间隔为 12 秒或 24 秒。
3. 可对变形虫进行持续数天的追踪记录，但需注意此类录制所产生的文件体积，以及处理极大文件时的固有困难。为避免此问题，可分时段、按一定间隔记录变形虫活动。例如，每 12 小时记录 1 小时，持续 5 天。
4. 若显微镜和软件支持，可利用培养板孔位或流动池中多个位置的 XY 坐标，在单次实验中同时记录多个孔或多个区域。如有需要，可将同一孔或流动池中的多个区域图像拼接，以在 4 倍物镜下获得更大的视野。
   注意：可记录位置数量的唯一限制因素是显微镜载物台在图像采集时间间隔内（如每 12 秒、24 秒等）从一个位置移动到另一个位置的速度。然而，此功能并非必需，即使仅从单一位置生成的追踪视频，仍可获得足够数量的轨迹用于稳健的统计分析。本研究使用了 Nikon Eclipse Ti-U 显微镜，并利用其自动可移动载物台同时在多个孔中采集图像。但任何具备可编程录制功能的显微镜均可使用。显微镜必须能够连接计算机，并能将图像记录至软件或硬盘中。

3. 变形虫大小分析

1. 在成像软件中打开显微镜文件，将弹出Bio-formats导入选项。在对话框中，确保以下设置正确：堆栈查看；查看方式：选择-超堆栈；内存管理：勾选 使用虚拟堆栈；颜色模式：默认。
2. 确保未激活其他任何下拉菜单或复选框。单击 好的.
3. 打开生物格式系列选项。选择所需的系列。如果每次仅记录一个位置，则此处可能只显示一个选项。点击 好的.
4. 选择 图像 > 重复 通过仅选择一个C通道和一个Z通道，对每次操作的单个孔进行复制。
5. 从此时起，仅对复制的图像进行操作和分析，而非原始图像。选择 图像 > 类型 > 8位选择 过程 > 减去背景.
6. 将滚珠设为10.0。检查 浅色背景检查 滑动抛物面.
7. 选择 过程 > 增强对比度将滋养体的饱和像素设置为0.1%，将细胞群和聚集体的饱和像素设置为0.3%。
8. 选择 图像 > 调节 > 阈值（默认） > B&W. 将打开二进制处理窗口。选择 默认，并检查 黑色背景（二值掩膜）.
9. 选择较高的阈值，使大部分背景斑点不可见，但每只变形虫的部分区域仍可见。
10. 如果成像软件反转了图像，背景为白色，而变形虫为黑色，则执行以下操作 编辑 > 倒置 将其固定在黑色背景和白色变形虫上。
11. 选择 过程> 二元的 > 关闭，以防细胞因失焦或细胞运动导致外膜出现轻微空隙。
12. 选择 过程 > 二元的 > 填补孔洞使用绘图工具去除非阿米巴类杂质 编辑 > 填充如果此时背景为白色而变形虫为黑色，则选择 编辑 > 倒置此时，图像应表示二值图像 图2.
13. 为记录每个变形虫的大小，选择 分析 > 分析颗粒设置大小：10-无穷，圆形度：0-1，显示：无。勾选 仅显示结果并进行总结.
14. 保存出现的 CSV 文件。选择 文件 > 另存为 > Tiff 并根据所需规格编辑名称。

4. 用于追踪的显微镜文件制备（运动性分析）

1. 在成像软件中打开显微镜文件，将弹出Bio-Formats导入选项。
2. 在对话框中，确保以下设置正确：堆栈查看；查看方式：选择-超堆栈。为便于内存管理，请勾选 使用虚拟堆栈. 点击 好的.
3. Bio-Formats 系列选项将打开。选择所需的系列。如果每次仅记录一个位置，则此处可能只有一个选项。点击 好的.
4. 选择 图像 > 重复从此时起，仅对视频的副本部分进行操作，而非原始文件。
   注意：复制正在追踪的视频片段。为此，需要知道与实验所需分钟数相对应的帧数。例如，如果要追踪第1分钟的视频^st 小时，每24秒拍摄一次图像，共应有150帧^st 小时。因此，1^st 第1小时对应帧数1-150，第2^nd 小时将为151-300，依此类推。
5. 选择 图像 > 类型 > 8位选择 过程 > 减去背景将滚珠设为10.0。
6. 检查 浅色背景检查 滑动抛物面. 选择 过程 > 增强对比度 并将其设定为0.1%。
7. 检查 所有 x# 切片 （例如，所有150个切片）。取消勾选 标准化. 选择 图像 > 调节 > 阈值（默认） > B&W.
8. 二进制处理程序将打开。选择 默认. 检查 黑色背景 （二值掩膜）
9. 阈值化处理需较为激进，使大部分背景斑点不可见，但阿米巴虫的部分区域仍可见。在此步骤中，若背景为白色而阿米巴虫为黑色，则选择 编辑 > 倒置背景应为黑色，而变形虫应为白色。
10. 选择 过程 > 二元的 > 关闭选择 过程 > 二元的 > 填补孔洞选择 文件 > 另存为 > Tiff 并根据所需规格编辑名称。文件现在已准备好进行追踪。

5. 通过追踪分析运动性

1. 在需要用于追踪的 tiff 文件所对应的成像软件中，前往 插件 > 追踪 > Trackmate。此时将打开 Trackmate 的版本界面。
2. 选择 下一步。在检测器下拉菜单中选择 LoG 检测器。设置估计的斑点直径为：35.0 微米，阈值为 1.0。取消勾选 使用中值滤波 和 进行亚像素定位。
3. 在第一、中间和末尾切片处点击 预览。确保所有阿米巴虫均被紫色圆圈标记，且背景缺陷或伪影未被包含在内。
4. 提示时选择 下一步。系统将开始处理，此步骤可能需要几分钟时间。屏幕顶部的检测进度条将显示处理完成的比例。
5. 提示时选择 下一步。在初始阈值设定中，不选择任何选项，直接再次选择 下一步。选择视图时，选择 超堆栈显示器。然后选择 下一步。
6. 设置斑点过滤器，并在不选择任何选项的情况下选择 下一步。选择一个追踪器；为此，请选择 LAP 追踪器（而非简单 LAP 追踪器）。选择 下一步。
7. 在帧间连接设置中，将最大距离设为 40 µm。在轨迹段间隙闭合选项中，勾选 允许间隙闭合。将此最大距离设为 100 µm，最大帧间隙设为 4。不要为轨迹段分裂或轨迹段合并选择任何选项。
8. 选择 下一步。追踪过程可能需要较长时间执行。完成后，窗口底部应显示：“追踪完成，耗时 x 秒”。此时选择 下一步。
9. 追踪完成后再次选择 下一步。设置轨迹过滤器：在左下角点击 + 号以添加轨迹中斑点数量的过滤条件。将过滤器设置为“高于”，至少覆盖 93% 的帧数（例如，150 帧至少需要 140 个斑点）。
   注意：某些版本的软件可能需要选择相反的等效设置，例如“低于 7%”，可通过左右拖动滑线达到所需数值。
10. 选择 下一步。将出现显示选项。在保存 Trackmate XML 文件或 Tracks CSV 文件之前，请确保每一帧中的轨迹未发生形变，且阿米巴虫的运动方式无异常。
11. 如果需要删除某条轨迹，请点击 TrackScheme。TrackScheme 将显示所有帧中阿米巴虫的全部轨迹及其接触点。
    注意：可能需要删除轨迹的原因包括：在记录过程中阿米巴虫移出/进入视野、轨迹形状与阿米巴虫实际路径不符，或根据实验参数判断该轨迹或阿米巴虫属于数据中的异常值等。
12. 点击阿米巴虫以在屏幕上将其斑点高亮为绿色，在 TrackScheme 中该斑点周围将出现绿色方框。这将指示出需要移除的轨迹或斑点。
13. 右键点击需要移除的轨迹，选择 整条轨迹，然后按下 删除 按钮。
14. 在审查完所有轨迹后，通过点击追踪软件弹窗左下角的 保存 按钮保存追踪文件。使用视频名称保存 XML 文件。点击 恢复 返回追踪软件弹窗。
15. 点击 轨迹，并在左侧选择 轨迹。点击 导出为 CSV 并保存 CSV 文件。
16. 如果电子表格无法识别生成的 CSV 文件，请执行以下步骤：
    1. 在记事本中打开已保存的 CSV 文件。点击 Ctrl + A 和 Ctrl + C 复制全部内容。
    2. 打开电子表格，点击 Ctrl + V 将内容粘贴进去。所有数据将位于一个单元格中。
    3. 保持选中包含数据的单元格，前往 数据 > 分列。选择 分隔符号 > 下一步。选择 逗号 > 下一步 > 完成。将此文件另存为新的 CSV 文件。
17. 追踪生成的 CSV 文件将包含多个可用于分析的参数（图 3）。将所需的参数复制并粘贴到一个新的 CSV 文件中（图 4）以进行分析。此处使用的参数描述如下：
    1. 总移动距离：阿米巴虫移动的总距离，单位为 µm。
    2. 最大移动距离：阿米巴虫路径上距离起点的最远距离——该点不一定是终点
       
       其中 dij 表示轨迹上任意斑点 i 到任意斑点 j 的距离。
    3. 限制比：限制比表示阿米巴虫远离起点的效率：它是沿直线远离起点（接近 1）还是相对停留在起点附近（接近 0）。
       
    4. 轨迹平均速度：阿米巴虫在总移动距离上的平均速度，单位为微米每秒。
       
    5. 轨迹位移：阿米巴虫起点与终点之间的距离，单位为微米。
       注意：所有成像软件分析参数及其定义均可在此处查阅：https://imagej.net/plugins/trackmate/analyzers/。请记住，每个保存的文件均为当时分析轨迹的汇总。为获得可靠的数据分析结果，需根据数据特点适当地整合多个重复实验、不同时间点等的结果（图 5 和 图 6）。

结果

要成功使用此方法，需考虑几个关键的总体要点：首先是变形虫与显微镜的物理设置，其次是成像软件的正确使用，第三是以有意义的方式导出和分析成像数据。

在开始显微成像记录之前，必须确保阿米巴虫在显微镜载物台上正确聚焦（图1）。此时不应将焦平面调整至能观察阿米巴虫最清晰细节的最佳Z平面，而应使其略微失焦，使其呈现为实心黑色圆点，而非在精细观察时的半透明状态。以这种方式观察可使成像软件和追踪软件在将图像文件转换为二值图像时，更容易识别每一个单独的阿米巴虫（图2）。了解成像软件的目标——即每个阿米巴虫应显示为边界清晰的白色圆圈——有助于读者在明场下拍摄原始图像时找到合适的焦平面。当每个圆圈边界清晰后，追踪软件便能够准确追踪每个阿米巴虫的运动，并获取各自的运动参数。

在按照上述协议中关于成像软件和追踪软件的逐步说明操作，并参考相关视频以协助完成成像软件使用的关键初始步骤后，现在可以导出成像软件的数据以进行定量和数据分析。追踪软件的原始输出将类似于图3所示内容。此时，重要的是要检查导出轨迹中的斑点数量是否符合预期要求（例如，若设定每条轨迹中需包含93%的帧数，而视频总共有100帧，则每条导出的轨迹应包含不少于93个斑点）。如果斑点数量不符合要求，则可能需要返回追踪软件的操作步骤，确认所需参数是否已正确设置。

从原始导出数据开始构建数据分析表（图4）。需要牢记的是，每条轨迹代表一个重复实验中的单个变形虫。因此，如图4、图5和图6所示，必须对每组帧或每个时间点的所有轨迹进行平均（图4），并且该过程需针对整个序列中的每一组帧或每一个时间点重复进行（例如，若总共采集了3小时的视频，且数据点按小时划分，则每个重复实验将包含三个帧集/小时用于分析，图5）。最后，将每个重复实验中各帧集的平均数据进一步整合到同一空间中，以便对多个重复实验的数据进行综合分析，从而确定每个时间点的真实平均值和标准差（图6）。

每个重复组的平均值将用于数据分析，所有重复组的合并平均值及标准差或标准误将用于图表展示（如图7中的示例所示）。如果按照本文所述的方式分析数据，即对多个样本在多个时间点进行追踪，则最合适的方法是采用双因素重复测量方差分析（two-way repeat measure ANOVA），并结合事后Tukey检验。该方法可帮助我们确定每个时间点不同样本之间的差异，同时也能评估每个样本随时间变化的差异。

图 1：变形虫在明场显微镜下呈现不透明的深色形态。4倍放大倍数下变形虫的代表性放大图像，略微失焦以呈现为实心深色圆圈。比例尺 = 500 µm。请点击此处查看此图的高清大图。

图 2：变形虫在明场显微镜下成像，经二值化处理并进行追踪。变形虫在4倍放大倍数下的明场图像（左），经处理后去除伪影并转换为二值图像（中），以及追踪后显示部分轨迹的结果（右）。上排：通过拼接4张图像获得的整个孔的图像，比例尺 = 1000 µm。下排：拼接前单张图像的大小，比例尺 = 500 µm。 请点击此处查看此图的高清版本。

图 3：成像与追踪软件的即时数据分析输出包含多种类型的数据。 追踪结果的代表性输出如图 2所示，该图为单个视频。注意轨迹编号（红色箭头）存在跳号现象，表明追踪软件已正确剔除不符合参数设定的轨迹。在此示例中，共识别出 5385 条轨迹，但仅有 71 条符合设定参数。鉴于参数设定较为严格，该比例属正常范围。此轨迹数量也与本实验方案所用的阿米巴数量相符（例如，若在 96 孔板中每孔接种 200 µL 浓度为 7.5 × 10³ CFU/mL 的样品，则每孔预计约有 1,500 个阿米巴，在 4 拼接视野中可见的数量也大致相当。由于阿米巴会进出视野，从而产生新的轨迹，因此轨迹总数通常远多于阿米巴个体数量）。这一轨迹数量在图 2中再次得到体现，图中可见的轨迹数量远少于斑点总数。请始终检查轨迹中的斑点数量（红色框），以确保仅包含符合要求的轨迹长度。例如，本例中我们纳入了超过 93% 的帧，该片段共包含 127 帧，因此所有轨迹的斑点数量均应高于 118。以黄色高亮显示的是本实验方案中提及的各项测量参数。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：根据初始数据输出结果重新整理的数据。 导出后所需数据的组织方式。（A）从追踪软件导出的数据（图 3）中选取的相关测量值被复制并粘贴到一个新的电子表格中。（B）在新电子表格中对所需测量值进行整理后，应计算每条轨迹的平均值。因此，在此代表性示例中，该单个视频中每条可用轨迹的总距离、最大距离、限制性、平均速度和位移均已分别计算为单一数值。请注意，此处共有 71 条轨迹符合第 1 至 127 帧的参数要求。由于每个视频或帧集合的分析结果可能不同，因此适合分析的轨迹数量也会有所不同，如 图 5 所示。请点击此处查看此图的放大版本。

图 5：用于整套图像序列或视频分析的连续帧设置。 此图为将连续视频添加至数据分析的代表性示例。假设第 1–127 帧构成视频的第一小时（此处 1 小时为每 28 秒采集一帧图像），第 128–254 帧为视频的第二小时，第 255–381 帧为视频的第三小时。将所有小时导出的数据（如图 3所示导出）合并至一个工作表中，以便统一处理。如图 4所示，将对每个帧集/h 所有可用轨迹的数据进行平均。 图 5中的所有数据均来自一个重复实验或一个样本。若有 3 个重复实验，则应有 3 个布局完全相同的独立电子表格标签页，这些标签页的数据将被整合至一个新的标签页中，如图 6所示。请点击此处查看此图的放大版本。

图6：每个帧集合中所有变形虫的综合数据，用于表示单个重复实验。（A）需要将 图5 中每个帧集合的所有平均值汇总到一个中心位置，以便完成最终的数据分析。在此代表性图像中，显示了前三个帧集合（或小时）的总距离平均值。此过程必须针对每个正在运行的样本/条件/重复实验重复进行。然后，需对每个帧集合中各样本的平均值再次取平均（黄色框）。该值即为最终数据点，据此可计算标准差和标准误。每个样本在各帧集合中的单个平均值（此处，总距离样本1对应B3、B4和B5中的数值；总距离样本2对应C3、C4和C5中的数值，依此类推）将用于进行统计分析。此过程需对所有必需的测量参数重复进行（最大距离、限制性、平均速度、位移等）。（B）为量化结果生成图示，可使用黄色框中的数值作为最终图表的数据点。请点击此处查看此图的放大版本。

图 7：ATCC 30461 和 ATCC 50370 的原始运动性数据。 原始数据（此处表示为每小时的均值 ± 标准误）为先前研究中收集但未发表的数据^18,19。该运动性定量结果表明，这两种变形虫在玻璃表面的 ¼ Ringer 溶液中，前 6 小时的运动性（以该小时内移动的微米总距离衡量）相似。每个时间点包含三个独立的重复实验，每个重复由 20–200 条变形虫轨迹组成。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

能够追踪并量化棘阿米巴（Acanthamoeba）等阿米巴原虫的运动能力，对于研究这类不受低速布朗运动影响的贴壁性微生物具有重要意义^9,10, 可提供大量有关阿米巴行为的信息，并显著促进对阿米巴角膜炎（AK）预防方法的理解。该实验方案已在近期发表的文献中详细描述，相关数据也已通过其他类似的数据分析得到验证或整合^18,19。需要指出的是，采用本方法测得的阿米巴运动速度与其它研究团队已发表的结果相近。本方案的一个显著优势在于其适用于几乎所有对光透明的表面或阿米巴处理条件；但需注意的是，尽管该方案未来可能经过修改后适用于其他生物体，但截至目前仅针对棘阿米巴（Acanthamoeba）进行了优化。上述方案在实验室中始终表现良好，但以下提供了为适应其他需求或解决困难情况而调整方法的若干建议。

确定追踪参数：在上述方案中，已列出帧间连接、间隙闭合、最大帧间隙以及每条轨迹上的点数，这些参数在近期的文献中最为常用。然而，其他参数可能更适用于不同的研究需求。此外，可能还存在其他研究者希望使用但本文未采用的参数（例如轨迹筛选器中的最大轨迹距离）。有关每个参数及其描述的更多信息，可在此网站上获取（参见参考文献²¹）。在确定哪些参数和筛选条件对其他实验最为相关以及如何设置时，应考虑特定项目在统计学上的合理性；例如，是否希望保留阿米巴原虫移出视野后又返回视野所产生的数据？或者，是否希望保留那些几乎未发生移动但仍被识别为轨迹的阿米巴原虫的数据？此外，还应结合图像采集时的帧数以及帧间时间间隔，思考其合理范围。

改变团块大小：我们发现，基于当前标准实验室可用的技术和软件，无论使用何种软件或显微镜设置，准确追踪随时间变化的聚集物中变形虫数量都极为困难。如果需要追踪团块的大小，并尝试将该大小与其中生物体的数量相关联，可使用经过多次实验建立的标准曲线，通过数学方法预测聚集物的大小。例如，可通过在孔中接种不同数量的变形虫（如每孔8、16、32、125、250、500、1,000和2,000个细胞）来形成聚集物。对每个孔在24小时内不同时间点生成延时图像。对每个已知细胞数量的球状体进行二维面积分析，并建立变形虫数量与球状体大小随时间变化的标准曲线。该实验至少重复三次，以获得所生成曲线的适当标准差。

确定变形虫的运动方向性：尽管在某些研究中可能并不需要此步骤，但了解变形虫的方向性仍然具有重要意义，有助于分析处理或实验对细胞趋化性的影响。这些数据可用于生成可视化（图形）和定量分析结果。可通过“趋化性与迁移分析工具”（Chemotaxis and Migration Tool）实现该功能，该工具是成像软件的一个免费插件，可在网站上获取，同时提供应用指南、示例图像和视频（参见材料表）。

详细的运动动态：其他研究团队已采用远超本文讨论范围的先进统计分析方法，对扩散动态和扩散轨迹进行了研究^9,10,22。用户可根据自身需求考虑采用这些方法。

与任何成功的方法一样，本文所述方案经过多轮排错优化，以实现结果的一致性。虽然通过每秒采集一次图像（或显微镜所能达到的最快速度，可能短于一秒）可以获得高质量、可追踪的视频，但这会产生极为庞大的文件，难以处理。这种方法仅适用于持续几分钟的极短期视频录制。相反，我们发现每隔数秒采集一次图像，仍可根据该物种的运动速度有效追踪变形虫行为，并能够生成持续数小时甚至数天的可用视频。我们发现图像间最长的时间间隔为30秒，这是成像软件准确追踪变形虫所需的最长时间。用户选择时间间隔时，应综合考虑显微镜成像速度的限制、每个孔所需采集的图像数量，以及每次采集时同时记录的孔数。同样，本方案中提到的参数，如最大位移、允许的帧间断、所需的最少帧数等，均通过本实验室反复试验确定，旨在生成包含最完整变形虫轨迹的追踪数据，同时排除由不完整轨迹、视频中途进入或离开视野的变形虫，以及成像软件误判（例如两个变形虫在运动过程中相遇后分离）所导致的噪声。在长时间（数小时至数天）记录持续相互作用的微观生物体时，此类错误和不完整轨迹的数量较高是可预期的，因此必须舍弃大量错误轨迹。值得注意的是，根据本实验室的经验，方案中的“填补空洞”步骤对于减少成像软件在追踪变形虫过程中的误差至关重要。通过确保每个变形虫呈现为实心圆，而非有时出现的环状或C形，软件成功追踪每个变形虫的可能性将显著提高。

此外，如前所述，用户可用于分析图像或视频的参数有很多。根据实验需求，我们始终发现分析总移动距离、最大距离、速度和位移这四个参数带来的益处最大。这些参数已在先前的出版物中进行了深入讨论（包括使用不同菌株和不同表面的情况），并配有图示解释^18,19。这四个参数使用户能够推断变形虫沿直线移动的能力及其所需时间，从而有助于理解其与隐形眼镜污染相关的行为特征。获取并分析这些参数是一项繁重的工作，如本文图示所示。在处理来自成像软件输出的大量且多样的电子表格时，我们通过创建具有自动计算所有必要分析结果功能的锁定式电子表格模板，来减少无意错误的发生。然而，对该方法可能的改进方向是编写一个能够处理、分类和分析此类数据的脚本程序。

综上所述，本文介绍了一种可在多种不同条件下简便且准确地测量Acanthamoeba大小和运动能力的方法。我们已证明该方法适用于多种不同的阿米巴菌株，并指出尽管获取运动性信息可能存在简单的参数，但该实验设置可根据任何特定需求进行高度定制。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
¼ Ringer’s 溶液	ThermoFisher Scientific	BR0052G	Oxoid Ringers 溶液片剂。按说明配制四分之一浓度而非全浓度 Ringers 溶液。
10 µL 移液器	Eppendorf Research	3123000039	2 µL–20 µL 单通道
10 µL 移液器吸头	Neptune Scientific, San Diego, CA, USA	BT10.N	10 µL 通用屏障吸头
48 孔板	Millipore Sigma,	CLS3548	Corning Costar 细胞培养处理多孔板：聚苯乙烯板，平底孔，无菌，带盖
50 mL 圆底离心管（每个样品 1 支，每传代 2 次的样品 1 支）	Fisher Scientific	Falcon 352098	Falcon 50 mL 高透明度圆底离心管，聚丙烯材质
96 孔板	Millipore Sigma, Burlington, MA, USA	CLS3596	Corning Costar 细胞培养处理多孔板：聚苯乙烯板，平底孔，无菌，带盖
Acanthamoeba	American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	ATCC 30461	本实验方案已验证适用于 ATCC 50655、30872、50702、30010、30461、50370、50703、30137、PRA-115 和 PRA-411
无菌培养基（AC6）	实验室自配	n/a	每升去离子蒸馏水中含 20 g 生物蛋白胨、5 g 葡萄糖、0.3 g KH2PO4、10 µg 维生素 B12 和 1 玻璃5 mg L-甲硫氨酸。用 1 M NaOH 调节 pH 至 6.6–6.95，121 °C 高压灭菌 20 分钟，室温保存不超过 3 个月。
离心机及相应转子	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	Sorvall ST 40R	任何可离心 50 mL 圆底离心管、500 × g 离心 5 分钟的等效离心机和转子均可接受
趋化性与迁移分析工具			基于 ImageJ 的免费软件，可从 https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html 获取
一次性血细胞计数板	Bulldog Bio, Portsmouth, NH, USA	DHC-N01	Neubauer 改良型双计数室一次性血细胞计数板，独立包装，无热原
ImageJ 软件（含 Trackmate 插件，本实验方案基于 Trackmate 版本 6.0.2）			美国国立卫生研究院开发的免费软件，可从 imagej.net 获取。Trackmate 插件可从 https://imagej.net/plugins/trackmate/ 下载
显微镜，建议配备自动移动载物台	Nikon, Tokyo, Japan		本研究使用 Nikon Eclipse Ti-U 显微镜，并利用自动移动载物台实现同时在多个孔中采集图像。
NIS-Elements 软件	Nikon
刻度移液管	Fisher Scientific, Hampton, NH, USA	BrandTech 26331	BrandTech accu-jet pro 移液控制器
刻度移液管吸头	VWR	5 mL: 76201-710 10 mL: 170356 25 mL: 89130-900 50 mL: 75816-088	VWR 刻度移液管，无热原
无菌铝制透射式流动池	Biosurface Technologies Corporation, Bozeman, MT, USA	FC 81-AL	阳极氧化铝单通道透射式流动池，适配 96 孔板尺寸，用于倒置显微镜
T75 培养瓶	VWR, Radnor, PA, USA	734-2316	VWR 组织培养瓶，182.5 cm²，表面处理，插口密封盖，无菌