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生命极端环境下的适应：利用嗜极古菌Sulfolobus acidocaldarius进行的实验进化

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DOI：

10.3791/66271

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2024年6月14日

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1Division of Evolution, Infection and Genomics, School of Biological Sciences, The University of Manchester, 2Division of Pharmacy and Optometry, School of Health Sciences, The University of Manchester, 3Department of Earth and Environmental Sciences, School of Natural Sciences, The University of Manchester

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用低成本、节能型台式恒温混匀仪作为培养设备，针对嗜热微生物进行实验进化的适应性演化实验方案。该技术通过表征一种最适生长温度为75 °C的古菌——Sulfolobus acidocaldarius的温度适应性加以示范。

摘要

嗜酸热硫化叶菌（Sulfolobus acidocaldarius）已成为一种极具潜力的嗜热模式系统。研究嗜热微生物如何适应温度变化，不仅对于理解基本的进化过程至关重要，而且对于将S. acidocaldarius开发为生物工程的底盘系统也具有重要意义。然而，开展嗜热微生物实验进化的重大障碍之一，是传统高温培养箱在设备维护和能源消耗方面的高昂成本。为应对这一挑战，本文提出了一套完整的在S. acidocaldarius中进行实验进化的实验方案，该方案采用低成本且节能的台式恒温混匀仪。该方案采用分批培养技术，使用相对较小的培养体积（1.5 mL），可同时追踪多个独立谱系的适应过程。通过增加恒温混匀仪的数量，该方法可轻松实现规模扩展。这种方法通过降低实验研究的初始投入和持续运行成本，显著提高了S. acidocaldarius作为模式系统的可及性。此外，该技术还可推广应用于其他微生物系统，用于研究其对多种环境条件的适应机制。

引言

地球上的早期生命可能起源于极端环境，例如热液喷口，这类环境具有极高的温度和酸性特征1。微生物至今仍栖息于各种极端环境中，包括温泉和火山硫磺喷气孔。阐明在这些极端条件下发生的进化动态，有助于揭示使生物得以在其中生存的特化生理过程。这可能带来广泛的影响，从深化我们对生物多样性起源的理解，到推动具有生物技术应用价值的耐高温酶的开发。

尽管微生物在极端环境中的进化动态研究具有重要意义，但目前对此的理解仍然有限。相比之下，通过应用一种称为实验进化的技术，人们已在中温环境进化方面积累了大量知识。实验进化包括在实验室条件下观察进化变化2,3,4,5，通常涉及对环境的明确定义性改变（例如温度、盐度、引入毒素或竞争生物）7,8,9。当与全基因组测序相结合时，实验进化使我们能够检验进化过程中的关键方面，包括平行性、可重复性以及适应的基因组基础。然而迄今为止，绝大多数实验进化研究均以中温微生物（包括细菌、真菌和病毒2,3,4,5）为对象，而古菌则在很大程度上被排除在外。建立适用于嗜热微生物的实验进化方法，将有助于我们更深入地理解其进化机制，并推动对进化过程更全面的认识。这一进展可能产生广泛的影响，从揭示地球嗜热生命的起源，到涉及高温生物工艺中使用的“极端酶”（extremozymes）的生物技术应用10，以及天体生物学研究11。

古菌Sulfolobus acidocaldarius是开发嗜热微生物实验进化技术的理想模式生物。S. acidocaldarius为好氧生长，最适生长温度为75 °C（生长范围为55 °C至85 °C），且适应高酸性环境（pH 2–3）4,6,12,13,14。值得注意的是，尽管其生长条件极端，S. acidocaldarius的种群密度和突变率仍与中温微生物相当7,15,16,17,18。此外，该菌具有相对较小且注释完善的基因组（菌株DSM639：2.2 Mb，GC含量36.7%，共2,347个基因）12；S. acidocaldarius还具备强大的基因组编辑工具，可通过靶向基因敲除直接评估进化过程19。一个典型的例子是已有多种遗传修饰的S. acidocaldarius菌株可供使用，例如尿嘧啶营养缺陷型菌株MW00119和SK-120，这些菌株可作为可筛选的遗传标记。

对嗜热微生物（如S. acidocaldarius）进行实验进化研究存在显著挑战。此类研究需要在高温下长时间孵育，这会导致液体和固体培养技术均出现明显的蒸发问题。长时间在高温下运行还会损坏常用于液体培养基中实验进化的传统摇床培养箱。若需探索多种温度条件，则必须投入大量资金来购置和维护多台培养箱。此外，高能耗也带来了严重的环境和经济负担。

本研究介绍了一种用于解决嗜热微生物（如S. acidocaldarius）实验进化过程中所遇挑战的方法。该方法在Baes等人开发的用于研究热激反应的技术基础上进一步优化14,21，采用台式恒温混匀仪实现稳定且可靠的高温培养。其可扩展性支持同时评估多种温度处理条件，显著降低了额外培养设备的采购成本。该方法提高了实验效率，有助于对影响嗜热微生物进化动态的因素进行稳健的统计分析和深入研究22。此外，与传统培养箱相比，该方法大幅降低了初期资金投入和能源消耗，提供了一种更具可持续性和环境友好的替代方案。

我们的方法为在极端温度环境中实验性地研究进化动力学奠定了基础，这类环境可能在地球生命早期多样化阶段发挥了关键作用。嗜热生物具有独特的特性，但其极端的生长条件和特殊需求常常限制了它们作为模式系统的可及性。克服这些障碍不仅拓展了研究进化动力学的科研机会，也增强了嗜热生物作为科学研究中模式系统的广泛应用价值。

方案

1. 准备S. acidocaldarius 生长培养基（BBM+）

注意：为了培养 S. acidocaldarius，本实验方案采用基础布罗克培养基（BBM+)23首先将下述无机母液混合，配制BBM。−，可预先配制。BBM+ 然后通过将有机物储备液加入BBM中，按需制备−。也列出了储备液的配制方案 表1所有培养基和储备溶液均应在双蒸水中配制2O (ddH₂O)2O

  1. 生长培养基用无机贮存液的制备
    1. 制备微量元素储备液。
      1. 通过加入9 g/L的十水合四硼酸钠（Na₂B₄O₇·10H₂O）、0.13 g/L的七水合硫酸锰（MnSO₄·7H₂O）、0.22 g/L的七水合硫酸锌（ZnSO₄·7H₂O）、0.08 g/L的二水合氯化铜（CuCl₂·2H₂O）、0.06 g/L的四水合氯化钴（CoCl₂·4H₂O）、0.06 g/L的六水合氯化铁（FeCl₃·6H₂O）以及0.01 g/L的钼酸钠（Na₂MoO₄·2H₂O），配制微量元素储备液。2B4O7·10H2O) 至 ddH₂O2O，随后加入1:1 H2SO4 逐滴加入直至溶解。
      2. 依次加入0.44 g/L七水合硫酸锌（ZnSO₄·7H₂O）、0.69 g/L四水合氯化锰（MnCl₂·4H₂O）、0.08 g/L碘化钾（KI）、0.05 g/L硼酸（H₃BO₃）、0.05 g/L四水合钼酸钠（Na₂MoO₄·4H₂O）、0.01 g/L五水合硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）和0.01 g/L六水合氯化钴（CoCl₂·6H₂O）。4·7H2O)，0.1 g/L 的二水合氯化铜（CuCl2·2H2O)，0.06 g/L 的二水合钼酸钠（Na2MoO4·2H2O)，0.06 g/L 的硫酸钒(IV)二水合物（VOSO4.2H2O)，0.02 g/L 的七水合硫酸钴(II)（CoSO4·7H2O) 和 3.6 g/L 的四水合氯化锰(II)（MnCl2·4H2O）。将溶液高压灭菌，并在 4 °C 下保存。
    2. 通过将20 g/L的六水合三氯化铁（FeCl₃·6H₂O）溶于0.1 M盐酸中，配制铁储备液（1000倍浓缩液）。3·6H2O）在 ddH₂O 中2O. 通过0.22 µm滤膜过滤溶液以灭菌，并于4 °C保存。
    3. 通过将70 g/L氯化钙（CaCl₂）溶解于水中来配制Brock溶液I（1000倍浓缩液）。2·2H2O) 溶于双蒸水（ddH2O）。高压灭菌后于 4 °C 保存。
      警告：溶解氯化钙时需小心2·2H2水中的 O 反应是放热过程。请谨慎操作此步骤，佩戴符合 EN407 标准的防热伤害手套，以防受伤。容器不得完全密闭，以免压力积聚。
    4. 通过将130 g/L硫酸铵((NH₄)₂SO₄)与Brock Solution I混合，配制Brock Solution II/III。4)2SO4)，25 g/L 七水硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）4·7H2O)，28 g/L 磷酸二氢钾（KH₂PO₄）2PO4），以及50 mL先前配制的微量元素储备液。使用1:1的H2SO4，将储备液的pH值调节至2-3。对溶液进行高压灭菌，并于室温（RT）保存。
  2. 生长培养基用有机母液的制备
    1. 配制 D-葡萄糖储存液（100 倍）：将 300 g/L（30% w/v）的 D-葡萄糖溶解于 ddH₂O 中2O，并通过0.22 µm滤器过滤除菌。4 °C保存。
      注意：可根据实验需求使用其他碳源替代D-葡萄糖（例如D-木糖）。
    2. 制备酪蛋白胨储存液（100倍）：将酪蛋白胨溶解于ddH₂O中，配制成100 g/L的溶液。2O. 高压灭菌以灭菌，并将储备液在室温下保存。
    3. 通过将 2 g/L 尿嘧啶溶解于 ddH₂O 中，制备尿嘧啶储存液（100 倍浓缩液）。2O，并通过0.22 µm滤器过滤除菌；于−20 °C保存。
  3. BBM 的制备+ 1×工作浓度的培养基
    1. 首先，准备 988 mL 无菌 ddH₂O2通过高压灭菌。
    2. 配制1升BBM− 通过将1 mL Brock储存液I、10 mL Brock储存液II/III和1 mL Fe储存液加入988 mL无菌ddH₂O中2O 已预先灭菌。用1:1 H调节培养基pH至2-3范围2SO4.
      注意：BBM− 可预先制备，并在室温下保存长达1个月。
    3. 最后，为了制备1 L BBM+，将10 mL D-葡萄糖储备液、10 mL 酪蛋白蛋白胨储备液和10 mL 尿嘧啶储备液与985 mL BBM混合−. 充分混匀，并用1:1 HCl调节培养基pH至2-32SO4.
      注意：BBM+ 应根据需要新鲜配制。
  4. BBM 的制备+ 固体培养基
    1. 配制 1 M 的 MgCl 储存液2 和 CaCl2；这些将有助于BBM固体培养基的凝固。对于1 M MgCl₂2，将 9.5 g 加至 100 mL ddH₂O 中2O. 对于1 M CaCl₂2，向100 mL ddH₂O中加入11 g2O. 高压灭菌以消毒。
      警告：溶解 CaCl2·2H2水中的 O 是一个放热过程。进行此步骤时需小心操作。佩戴符合 EN407 标准的防热伤害手套，以防受伤。容器不得完全密闭，以免压力积聚。
    2. 将3%（w/v）的结冷胶（例如，30 g/L）溶于ddH₂O中2O并高压灭菌以消毒。
      注意：此处使用结冷胶（例如 Gelrite）作为凝固剂，因为标准的细菌学琼脂无法在 75 °C 下凝固。
    3. 分别配制 BBM+ 用于固体培养基，需与步骤1.4.1中制备的无菌结冷胶按1:1比例混合。
      1. 首先，配制 1 L BBM− 如步骤1.3.2所述。将887 mL BBM混合− 1 mL 铁储备液、各 20 mL 的D-葡萄糖储备液、酪蛋白胨储备液和尿嘧啶储备液。
      2. 加入 40 mL 1 M MgCl2 和12 mL的1 M CaCl2. 充分混匀，并用1:1 HCl调节培养基pH至2-32SO4.
        注意：此处添加的母液体积故意大于制备液体BBM时的体积+ 在步骤1.3中，这是为了在后续步骤中与熔融的结冷胶按1:1比例混合时进行校正。
    4. 预热 BBM+ 将固体培养基加热至约 75 °C，并与熔融的结冷胶按 1:1 比例混合于 ddH₂O 中2O. 充分混匀后，倒入耐热塑料（如聚丙烯）、玻璃培养皿或六孔板中，用于细胞生长。f S. acidocaldarius混合后立即使用该琼脂，因其会迅速凝固。
      注意：一些常用于微生物学的聚苯乙烯90 mm培养皿在高温下长时间孵育时会发生变形。
      注意：处理高温液体时应采取适当的安全防护措施；佩戴符合EN407标准的防热伤害手套，以防受伤。

2. 从冻存菌种复苏 S. acidocaldarius

  1. 制备通气型培养管以确保充分通气和氧气供应。
    1. 提前准备好带孔的 2 mL 微型离心管 硫化叶菌 生长。小心加热钝头金属丝（>0.7 mm的金属丝（如拉直的回形针），用本生灯火焰加热，在管盖上穿刺出一个直径约1 mm的小孔。
    2. 将打孔的试管放入可高压灭菌的容器中（例如，空的移液器吸头盒），进行高压灭菌以达到灭菌效果。
      警告：佩戴符合 EN407 标准的防热手套，以防手部因接触加热金属而受到热损伤。加热金属丝时间应仅持续很短（1–2 秒），以防止过热。仅可使用高熔点金属（如钢）。
  2. 接种启动培养物 S. acidocaldarius.
    1. 将预热的 BBM 加入已灭菌的带孔 2 mL 管中，每管加 1.5 mL+ （如第1部分所述配制，于75 °C预孵育至少15分钟）。
    2. 接种BBM+用刮勺从甘油储备液（25% v/v 甘油，-80 °C 保存）中取约 50–60 mg 样本，装入已填满的试管中。此处， S. acidocaldarius 使用菌株DSM639。另取一试管加入1.5 mL BBM+作为阴性对照。
  3. 为防止刺孔的2 mL管盖产生气溶胶逸出，污染培养环境（及其他样品），并减少管内培养物蒸发的差异，应在管盖顶部放置一层可耐受高温（65–85 °C）的透气膜，以阻隔微生物的逸出或侵入。
    注意：使用透气膜密封管口可显著减少蒸发。在 75 °C 下持续 48 小时，密封管的平均体积损失为 8.63%（范围：3.29–16.45%） n = 24 次技术重复，重复两次），相比之下为 25.05%（范围：11.92–62.91%） n 24 次技术重复，重复两次）用于未密封的试管。
  4. 将接种后的试管置于恒温混匀仪中，在75 °C、400转/分钟（RPM）持续振荡条件下孵育48–72小时，或直至OD600 nm 当通过分光光度计测得的值达到 0.3 - 0.8 时。
    注意：2 mL 管的穿孔管盖及振荡可提供适当的通气，以实现最佳生长。应盖好恒温混匀仪的管盖，以确保温度恒定并减少蒸发。
  5. 孵育期结束后，为复苏的培养物提供第二次生长期（预适应阶段）。
    1. 通过在5000 × g下离心试管，使菌体沉淀 x g 室温孵育2分钟。然后弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1.5 mL新鲜预热的BBM中+.
      注意：本实验使用以下材料 S. acidocaldarius 野生型菌株DSM639，但这些培养与实验进化方法可应用于任何 硫化叶菌 菌株及其他潜在的嗜热微生物。

3. 确定 S. acidocaldarius 的种群密度、倍增时间及指数生长期

  1. 确定所选筛选条件下菌群密度及进入指数生长期的时间。针对每种待测环境条件，按照步骤 2.1–2.5 制备三份起始培养物。
  2. 用BBM稀释三种培养物+ 至 OD600 nm 0.01。每种培养物至少制备20 mL。这三个培养物代表技术重复。
  3. 进行OD的重复生长曲线测定600 nm 随着时间的推移通过破坏性取样。
    1. 从2.1步骤中准备24个带孔的2 mL离心管，将其分为三组，每组八个，并将这些技术重复标记为1、2和3（例如，八个标记为重复1的管子等）。
    2. 从步骤3.2中的三种稀释培养物中，各取1.5 mL分别加入七支已准备好的试管中。另取一支试管加入1.5 mL BBM+作为阴性对照。
  4. 将全部24个管置于恒温混匀仪中，75 °C、400 RPM条件下孵育。用透气膜密封。在预定时间点（如0、4、8、12、24、36、48 h），从三个重复组中各取出一个管，测定OD值600 nm 使用分光光度计检测后，弃去离心管。取下离心管后，更换透气膜。
  5. 同时，确定OD之间的关系600 nm 以及种群密度。进行连续稀释（1 × 10-1 至 1 × 10-6) 在 BBM 中+ 在至少三个时间点（理想情况下为起始、中期和结束）取样。将每个稀释度的 100 µL 接种至固体 BBM 培养基上+ 培养基（按步骤1.4制备）。
    注意：为了获得稳定的菌落生长和准确的计数结果，最好将稀释后的培养液直接用移液器点样到固体培养基表面，避免进行机械涂布（例如使用L型涂布棒或玻璃珠）。机械涂布似乎会对菌落形成产生不利影响。
  6. 将平板置于静止培养箱中，在 75 °C 下孵育至菌落出现（5–7 天）。
    1. 在此期间，应保持培养箱湿润，以避免平板过度干燥，否则菌落将无法形成。
    2. 将培养皿放入一个内衬湿润纱布的密闭聚丙烯盒中，并在盒盖上至少刺三个孔以确保通气。
    3. 在培养箱中放置盛水的容器以增加湿度。每天补充容器中的水。
  7. 当所有 OD600 nm 在收集完测量数据后，通过将逻辑斯蒂曲线拟合到OD值与时间之间的关系，确定细胞倍增时间以及进入指数生长期所需的时间。600 nm 以及时间，例如使用 R 中 growthcurver 包的 SummarizeGrowth 函数。
  8. 当固体培养基上出现可见菌落时，计数菌落形成单位（CFUs），应选择产生50-100个菌落的稀释度进行计数，以获得最佳准确性。
  9. 使用以下公式计算培养基中的细胞密度：CFU/mL = 菌落数 /（涂布体积 × 稀释倍数）。
  10. 进行对数-对数线性回归分析，以确定 log10(CFU) 与 log10(OD) 之间的关系600 nm）。因此，根据回归模型的斜率和截距计算给定 OD 值对应的预测 CFU/mL：预测 CFU = 10[斜率 × log10(OD600nm) + 截距].
  11. （可选）也可在摇床培养箱中执行步骤 3.1–3.10，以确定在恒温混匀仪中是否获得可比的生长效果。

4. 实验进化的独立谱系建立

  1. 第1天：为获得单菌落，首先完成上述第2部分的所有步骤以制备起始培养物。
  2. 第3天：测定OD600 nm 培养物的密度，以确保其处于对数生长期且达到足够的浓度（OD600 nm 0.3–0.8（分光光度计测定）
  3. 制备系列稀释液 S. acidocaldarius DSM639 培养物，浓度为 1 × 10-1-1 × 10-6 并从每份 1 × 10 的样品中取 100 µL 涂布-5 和 1 × 10-6 稀释至含固体BBM的6孔板各孔中+ 培养基（第1节和 表1) 进行多次重复实验。将培养板置于恒温培养箱中，于75 °C静置培养5–7天，直至出现单菌落。
  4. 第8至10天（孵育后5至7天）：
    1. 从单个菌落建立进化谱系的数量。对于每个谱系，使用接种环从平板上随机挑取一个菌落，将其重悬于已穿孔的2 mL离心管中，管内含1.5 mL预热的BBM+ 培养基。正确标记试管。
    2. 重复此步骤以获得所需数量的细胞系；此处建立了七个细胞系，并标记为SA1-7。另取一支试管加入1.5 mL BBM+作为阴性对照。
    3. 用透气膜密封管口，置于恒温混匀仪中，在 75 °C、400 rpm 条件下孵育 48–72 小时，直至培养物变浑浊（相当于 OD600 nm 0.3–0.8（分光光度计测定）
  5. 第10至12天（接种后7至9天）：
    1. 在台式离心机中，以 5,000 x g 室温下孵育1分钟。弃去上清液，用200 µL液体BBM重悬沉淀。+.
    2. 将200 µL细胞悬液与200 µL 50%甘油（25% v/v甘油）混合，制备七个独立谱系的甘油保存菌种，并于-80 °C保存。这些菌种作为进化实验的祖先群体。

5. 进行温度演化实验

注意：实验方案主要步骤的概念示意图如下所示 图1.

  1. 使用第4节中产生的七个祖先种群进行进化实验。
    1. 在无菌、带穿孔的 2 mL 管中进行所有实验进化测定，管口用透气膜密封（如上文第 2 节所述）。
    2. 除了这些种群外，还需单独保留穿孔的2 mL离心管，内含1.5 mL BBM+ 作为阴性对照，不进行培养，以监测（交叉）污染，并设定指示无菌生长的OD阈值。
  2. 建立温度处理：使用恒温混匀仪可设置多种温度处理条件。此处采用以下温度处理：恒定75 °C、恒定65 °C，以及从75 °C逐步降至65 °C（每4天降低1 °C）的梯度降温处理（“降温处理”）。
    注意：这些处理可根据特定实验需求进行调整。每种温度处理都需要使用单独的恒温混匀仪。
  3. 第1天：按照第2节所述步骤，从甘油保存液（步骤4.5中制备）中复苏祖先种群。
  4. 第3天：
    1. 将这些培养物稀释至 OD600 nm 0.01（通过分光光度计测定）至总体积至少为6 mL的预热BBM+从七个稀释的祖先种群培养物中各取1.5 mL，分别加入三个预先打孔的2 mL离心管中，每个温度处理组（按步骤5.2建立）各用一管。
      注意：此分装步骤可确保每个祖先种群中存在的任何遗传变异在进化实验开始时均存在于所有温度处理组中。这些培养物将作为传代0代（Tx0），用于启动温度进化实验。
    2. 用透气膜密封试管，将每组七个祖先种群分别放入不同的恒温混匀仪中。将每个恒温混匀仪设置为所需温度和400 rpm，以启动进化实验。
  5. 第5天：
    1. 48小时后，通过接种1.5 mL预热的BBM进行转接1（Tx1）+ 在已打孔的2 mL离心管中加入培养基，并分别加入来自各Tx0培养物的15 µL菌液（1:100稀释）。为提高效率，可使用可调间距多通道移液器同步完成单个实验中的多个转移操作，以减少培养物离开恒温混匀仪的时间。
    2. 与之前相同，将试管密封后，放回各自热混仪中的随机位置。可通过手动或使用 iMetaLab 96 孔随机化器完成随机化。
  6. 测量OD600 nm 在基于孔板的分光光度计中测定 Tx0（96 孔板中每孔 200 µL；BBM 体积相同）+ 用作空白对照）以追踪独立谱系的生长情况。
    注意：OD600 nm 转移到新鲜培养基后应立即测量，以防止污染。光密度也可通过其他方法测定，例如使用常规分光光度计。采用基于微孔板的分光光度计可实现对多个培养样品的同步测量，从而简化操作流程。
  7. 在第7、9、11天等时间点重复步骤5.5和5.6，分别对应Tx2、Tx3、Tx4等处理。对于75 °C和65 °C的处理组，保持温度恒定。对于降温处理组，每第二次转移时降低温度1 °C（即在Tx2、Tx4、Tx6等时间点降温）。
  8. 每10代后制备群体的甘油菌种（步骤3.2.3）th 转移（例如，Tx10、Tx20等），并在管上标记祖先群体编号（例如，SA1代表第1个祖先群体）st 独立群体）和转移编号（例如，Tx10 表示第 10 次转移）th 转移）。之后可利用这些甘油菌种复苏菌群，以研究菌群随时间的变化情况，或在必要时重新启动实验（例如，因污染或意外事件导致培养物丢失时）。
  9. 让实验继续进行，直至达到预定的传代次数或预定的世代数。在最后一次传代时，制备所有后代菌株的甘油保存液 谱系。
    注意：本实验持续进行至温度下降处理达到 65 °C，该时间点为 Tx22。这相当于约 150 代（根据 4.6 中 100 倍稀释因子计算：log）2（100）= 每次传代6.64代。进化实验的时长可根据实验需求进行调整。

6. 进化后实验生长测定：祖先谱系与进化谱系的比较

注意：生长/适合度测定实验方案的概念图如下所示 图2.

  1. 准备带穿孔的 2 mL 离心管，每管加入 1.5 mL BBM+。准备足够数量的离心管，用于培养所有后代 谱系以及每个祖先菌株。
  2. 使用步骤 2.2–2.5 中所述方法复苏祖先群体，以及在进化实验最后一次传代后于步骤 5.9 中保存的每个后代 群体，但培养温度应设置为各群体在进化实验最后两次传代中所经历的温度，即：75 °C 恒温处理组在 75 °C 培养，65 °C 恒温及降温处理组在 65 °C 培养。为获得可比较的群体密度，75 °C 培养时间为 72 小时，65 °C 培养时间为 120 小时。
  3. 使用基于微孔板的分光光度计测定培养物的 OD600nm。
  4. 在两种温度（即 75 °C 和 65 °C）下，对每个后代 群体及每个祖先菌株进行三重复的生长测定实验。准备带穿孔的 2 mL 离心管，每管加入 1.5 mL BBM+。为每个进化谱系和每个祖先菌株准备六根离心管。用谱系名称（SA1-7 或祖先）、培养温度（75 °C 或 65 °C）和重复编号（1、2 或 3）标记各管。
    注意：若可用的恒温混匀仪少于六台，可在多个实验批次中分多日完成重复实验。在此情况下，每个实验批次中均需包含所有谱系和祖先菌株的测定，以便在统计分析中估计并校正批次效应。
  5. 用每个后代 谱系和祖先菌株的培养物各取 15 µL，接种至六根已准备好的离心管中的新鲜培养基中。
  6. 将三台恒温混匀仪设定为 75 °C，另三台设定为 65 °C，并为每台仪器指定一个重复编号。将离心管放入对应温度和重复编号的恒温混匀仪中。在每台恒温混匀仪内，确保谱系和祖先菌株随机放置，以控制仪器内部环境异质性的影响。
  7. 用透气膜密封每组 24 根离心管。在指定温度下培养 48 小时。
  8. 从每份培养物中转移 200 µL 至 96 孔板中。使用分光光度计测定 OD600nm。
    注意：可使用可调间距多通道移液器，以方便在微量离心管与 96 孔板之间进行转移操作。
  9. 使用统计软件（例如 R）绘制图表并分析数据。

7. 进化谱系的全基因组测序及突变鉴定

  1. 复苏后代 第5.9步中保存于预热BBM中的品系+ 在75 °C下培养48–72小时，方法是将每个冷冻群体中的冰屑接种至BBM中+ 如第2节中步骤2.2–2.5所述，准备1–10 mL培养液体积以获得足量的基因组DNA。所需确切体积取决于后续步骤7.2或7.3中选择的测序方案。
    注意：建议同时对用于启动祖先群体的菌株进行测序，以准确判断在后代中检测到的任何突变是否确实为新发突变。 谱系是在进化实验过程中出现的，而非在此之前。
  2. （选项1）提取基因组DNA并制备Illumina测序文库用于Illumina测序。
    1. 使用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒提取并纯化基因组DNA。
    2. 使用测序服务提供商推荐的商业试剂盒，确保提取的基因组DNA满足其对数量和质量的要求。
    3. 使用商业试剂盒，按照制造商提供的方案进行基因组DNA文库制备。推荐采用250 bp的双端测序方案。提取的基因组DNA在提交至测序服务提供商前，于-20 °C保存。
  3. （选项2）或者，将样本送至商业服务机构，由其提供包括DNA提取、基因组DNA质量检测、Illumina文库构建和Illumina测序在内的组合服务。
  4. 分析测序基因组以鉴定突变。
    1. 接收 FASTQ 文件，若测序服务提供商尚未完成，则使用 Trimmomatic 进行接头序列修剪，滑动窗口质量阈值设为 Q15。
    2. 使用经过修剪的FASTQ文件，运行breseq流程（版本0.38.1）以检测突变，将基因组DNA测序读段与所选菌株的参考序列进行比较。对于 S. acidocaldarius DSM639，这是RefSeq编号NC_007181。

8. （可选）评估恒温混匀仪与培养箱的能耗

  1. 为了比较使用培养箱与使用恒温混匀仪进行培养时的能量消耗，使用电能监测插座测量每台设备在24小时内的能耗。
  2. 使用两个插座同时测量两台设备的能耗；或者在连续几天内分别测量。
  3. 将培养箱或恒温混匀仪从电源插座上断开，将电能监测插座插入电源插座，并根据制造商的说明进行初始化设置，包括安装监测与控制软件。
  4. 将培养箱或恒温混匀仪插入电能监测插座，并使其运行至少2小时（理想情况下为24小时或更长时间），以获得典型能耗的准确估算。记录每台设备的能耗数据。

结果

生长曲线测定
S. acidocaldarius DSM639 的生长曲线如图3A所示。比较使用恒温混匀仪与传统培养箱进行培养时，发现其生长情况相似。通过将逻辑斯蒂曲线拟合至每条重复的生长曲线，并计算平均值和标准误，估算了平均生长速率参数。在恒温混匀仪和培养箱中达到对数中期的时间分别为 27.2 h ± 1.1 h 和 31.1 h ± 1.9 h。在 75 °C 条件下，恒温混匀仪和培养箱的初始倍增时间估计值分别为 4.29 h ± 0.28 h 和 4.19 h ± 0.44 h，与先前发表的数值一致24。log10(OD600nm) 与 log10(CFU) 之间的关系可通过线性模型良好描述（校正后 R2 = 0.82，F(1,22) = 104，p < 0.00001，斜率 = 1.73 ± 0.17，截距 = 9.73 ± 0.14）。因此，OD600nm 与 CFU 之间的关系由以下公式给出：CFU = 10(1.73 × log10(OD600nm) + 9.73)。OD600nm 为 0.3 时，相当于约 6.7 × 108 CFU/mL（图3B）。

温度演变实验
使用源自 S. acidocaldarius DSM639 的七个独立谱系，设置了三种温度条件：恒定75 °C、恒定65 °C，以及温度梯度下降（从75 °C降至65 °C，每两次传代降低1 °C）。在为期45天（约在75 °C下经历了150代）的实验过程中，每次传代后均测定OD600nm，结果如图4所示。由于生长周期、温度等因素可能存在微小差异，跨天数的OD600nm测定值本身具有一定的波动性。然而，这些跨天数据仍可用于评估种群的存活性，并反映适应性是否随时间提高。在恒定75 °C条件下，各谱系的OD600nm值从初始范围0.125–0.3上升至实验结束时的0.248–0.471，表明该处理下种群适应性有所提升。相比之下，在恒定65 °C条件下，谱系的OD600nm值从初始范围0.018–0.087下降至最终时间点的0.008–0.04，表明种群未能充分适应这一恒定低温环境；但能够回收到存活个体的事实说明，种群未在连续稀释过程中被完全清除，提示存在一定程度的适应能力。最后，在温度梯度下降处理中，种群的OD600nm值从初始范围0.099–0.279上升至Tx6时（对应288小时，73 °C）的0.3–0.39，随后逐渐下降，至实验结束时降至0.003–0.024的范围。

生长/适合度测定
在进化实验结束后，对每个衍生群体进行适合度测定。所有七个独立谱系在培养 48 小时后测定 OD600nm，随后在 R 中对每种测定温度拟合线性模型，其中“选择环境”作为主效应，“重复/恒温混匀仪”作为区组效应。以祖先菌株的生长情况作为处理对比的参照基准。数据如图 5所示。

在75 °C下进行检测时，来自恒定75 °C（t检验：t210=3.64，p=0.0003）和恒定65 °C（t检验：t210=2.8，p=0.005）处理的谱系相对于祖先菌株，其适应性平均显著提高；但温度下降处理的谱系则无显著提高（t检验：t210=−0.87，p=0.38）。在65 °C下检测时，所有处理组的谱系其适应性平均均有所提高（恒定75 °C谱系：t检验：t210=4.68，p<0.0001；恒定65 °C谱系：t检验：t210=4.24，p<0.0001；温度下降谱系：t检验：t210=3.15，p=0.002）。然而，在两个检测温度下，不同谱系间的适应性存在显著差异（图5）。部分谱系与祖先菌株相比适应性无明显变化，甚至有所下降；这一现象在温度下降处理的谱系中尤为明显。

值得注意的是，在进化实验过程中，OD600nm 与 CFU/mL 之间的关系可能已发生变化。可通过测定进化谱系的生长参数（按照步骤 3.1–3.10）来评估这一变化。

全基因组测序结果
采用 breseq（版本 0.38.1）25 对在恒定 75 °C 条件下获得的七个谱系进行全基因组分析，参考基因组为 S. acidocaldarius DSM639（RefSeq 登录号 NC_007181.1）。分析揭示了所有后代谱系基因组中存在多种类型的突变，包括插入、缺失以及单核苷酸多态性（SNP）（表 2）。多个插入突变和非同义突变位于蛋白质编码基因以及基因间区域，后者可能因启动子区域的移码突变而影响基因表达。部分突变在多个后代谱系中一致出现，涉及细胞壁生物合成、转录、代谢、细胞转运和催化活性等多种功能相关的基因（表 2）。其中，在七个谱系中的五个谱系中均发现一段长达 54,667 个碱基对的大片段缺失；该缺失通过各群体的覆盖度缺失图谱得以确认（频率范围为 93.2% 至 100%）。该缺失区域共导致 53 个基因的丢失；这些基因在适应过程中的作用将在后续研究中进一步探究。此外，在本研究使用的 DSM639 菌株与已发表的参考序列之间也发现了一些差异（见补充表 1）。

摇床培养箱与恒温混匀仪的能量消耗对比
摇床培养箱与恒温混匀仪在一系列常见培养温度下的能耗，通过市售的智能能耗监测插座进行了比较，以及 75 °C 此处使用的温度。在 75 °C，该恒温混匀仪消耗的功率约为1/40th 传统摇床培养箱的能量图6），表明热混仪可能是一种减少与实验进化相关的碳足迹的手段。

嗜酸热硫化叶菌进化实验示意图；培养步骤、温度变化、甘油菌种保存。
图 1：展示在三种温度处理条件下进化实验方案的流程图。 请点击此处查看此图的放大版本。

温度适应实验示意图；OD600测定，恒温混匀仪设置，微生物生长。
图2：生长/适合度测定实验流程图。 请点击此处查看该图的放大版本。

细菌生长曲线图，OD（600 nm）随时间变化及CFU比较，孵育箱法与恒温混匀器法对比。
图3关键生长参数的测定及培养装置的比较 S. acidocaldarius DSM639 三个重复培养物在以下条件下培养： 75 °C 在7个独立的试管中。采用破坏性取样法进行测量（A) OD600nm （均值 ± 标准误） n=3 次技术重复；部分误差线小于绘图符号）；曲线表示拟合的逻辑斯谛生长模型以及（B菌落形成单位（CFUs）；线条代表拟合的对数-对数线性回归模型。 请点击此处以查看此图的放大版本。

细菌培养物的生长分析图；不同温度下的光密度与时间关系。
图 4：进化实验过程中获得的光密度（OD600nm）代表性结果。在约150代的进化实验中，三种温度处理条件（恒定65 °C、恒定75 °C、从75 °C降至65 °C）下独立谱系的光密度测量结果。曲线表示每个独立谱系随时间变化的Loess平滑拟合。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示不同谱系和温度下 600 nm 处光密度的生长实验结果图
图 5：生长实验的代表性结果。对源自 S. acidocaldarius DSM639 的独立谱系在温度进化实验（恒定 65 °C、恒定 75 °C、从 75 °C 降至 65 °C）后进行的生长实验，与祖先菌株进行比较。对所有谱系均在 65 °C 和 75 °C 下检测其生长情况。彩色数据点表示技术重复的均值 ± 标准误差（灰色显示，祖先菌株 n = 12，每个进化谱系 n = 3）。灰色条形表示祖先适应度的均值 ± 标准误差。请点击此处查看该图的放大版本。

比较传统培养箱与恒温混匀仪在不同温度范围下能耗的图表，实验结果。
图6：传统培养箱与恒温混匀仪设备的能耗对比。 使用市售的智能电量监测插座记录2小时内的能耗。请点击此处查看该图的放大版本。

表1：培养所需培养基配方及储备液 S. acidocaldarius. 所有培养基和储备液均应使用重蒸水配制2O (ddH₂O)2O），然后通过高压灭菌或使用滤器过滤除菌 0.22 µm 过滤，如上所述。有关培养基和贮存液配制的详细说明，请参见方案第1节。 请点击此处下载该表格。

表2：后代谱系全基因组测序的代表性结果。 在持续75 °C处理条件下，从 S. acidocaldarius DSM639 衍生的后代谱系中发现的突变。这些突变是相对于该谱系的直接祖先而言的，而该祖先相对于 S. acidocaldarius DSM639 的参考序列（RefSeq NC_007181）已存在多个变异（祖先中的突变见补充表1）。n 表示发现某一突变的谱系数目。→ 表示位于“正向读码框”的基因；← 表示位于“反向读码框”的基因。†这些变异是相对于 S. acidocaldarius DSM639 分离株中存在的 (A)10→11 移码突变而言的（见补充表1）。请点击此处下载该表格。

补充表 1：与参考序列（RefSeq 编号 NC_007181.1）相比，在 S. acidocaldarius DSM639 菌株中发现的突变。 → 表示位于“正向读码框”的基因；← 表示位于“反向读码框”的基因。‡SACI_RS04020 在 NC_007181.1 中被注释为假基因，但本研究中观察到的 1 个碱基缺失（Δ1 bp）移码突变可能恢复其功能，因为该突变使其编码的蛋白质与 rgy 反向旋转酶基因（RefSeq 编号 WP_176586667.1）具有 100% 的一致性。请点击此处下载该文件。

讨论

本研究建立了一种适用于嗜热微生物的实验进化方案，此处针对嗜酸热古菌S. acidocaldarius进行了优化，但也可根据需要调整用于其他需高温生长的微生物。该方案基于最初为中温细菌设计的技术，但经过专门改进，以克服高温好氧培养过程中存在的技术难题2,4,5,24。该方法的建立将有助于探索在极端温度条件下发生的、此前尚未被表征的进化动态，这类条件可能类似于生命进化最早阶段所存在的环境1。

为了从进化实验中获得可靠的结果，必须遵守该实验方案中的若干关键要点。首先是确保各进化谱系之间的独立性，这可通过在实验开始前划线分离至单菌落来实现。这是必要的，以确保在不同谱系中发现的相同突变具有独立的起源。相反，如果使用大量液体培养物分装来启动各个谱系，则可能将共同的遗传变异分配到每个群体中。第二个关键因素是控制污染，可通过设置不含培养物的阴性对照并监测其是否出现生长来实现。与中温微生物实验不同，嗜极微生物的进化实验不太可能受到外部来源的污染，但仍可能发生谱系之间的交叉污染。维持通气与蒸发之间的平衡是另一个重要考虑因素。S.acidocaldarius 是一种专性需氧菌，其生长依赖氧气10,23。手动刺穿聚丙烯微量离心管并用透气膜密封21,25，是实现在不过度蒸发的同时维持通气的关键。这种改进的效果很可能归因于密封管内环境的均一性得以保持（数据未显示）。

根据进化实验所使用的特定环境条件，该方法的两个方面可能需要进行调整或故障排除：稀释倍数和传代间隔时间。在本方法中，每次传代均进行1:100稀释，平均需要 log2(100) = 6.64 次倍增才能恢复到相同的种群规模。这在适应潜力（Wahl 和 Gerrish26 计算了最优稀释倍数）与实验可操作性之间提供了良好平衡。理论上，较大的稀释倍数可使每天发生的世代数更多，因为需要更多的倍增次数才能恢复到相同的种群密度（例如，1:1000 稀释平均需要 log2(1000) = 9.97 次倍增）。然而，如果实际达到的倍增次数少于传代间隔所要求的次数，则种群将逐渐因稀释而被洗脱，除非出现可缩短倍增时间的有益突变。对于每48小时传代一次的情况，要求倍增时间必须小于8小时，这与之前报道的 S. acidocaldarius 在75 °C下异养生长的估计倍增时间（4–6小时）相符23,27。然而，在恒定65 °C和温度下降处理组中，OD600nm 随时间逐渐降低的现象表明，48小时可能不足以完成所需的倍增次数，延长传代周期将更为有利。

与传统的摇床培养箱相比，使用热混仪进行实验进化研究具有若干重要优势，尤其是在研究对温度的适应性时。热混仪是一种比摇床培养箱更具成本效益的替代方案，且占用空间更小。这些特点使得能够高效地并行评估多种温度处理条件。热混仪的能耗也低于摇床培养箱，因此在孵育管数较少的情况下（例如少于100个），使用热混仪有望降低实验对环境的影响。这种能耗差异在与嗜热微生物相关的温度条件下尤为显著，但也适用于一系列较为温和的温度范围（图6），这意味着热混仪也可被用于减少中温微生物实验进化研究的环境影响。综上所述，这些特性表明，在实验进化研究中使用热混仪有望提升该研究方法的可及性，特别是在资源有限的环境中，例如发展中国家的实验室以及中小学教育机构。

尽管该方法为嗜热菌的实验进化提供了可行路径，但与中温菌的实验进化相比仍存在一些局限性。首先，使用热混匀仪建立的独立重复谱系数量，远少于广泛用于中温菌的高通量微孔板方法4。目前，由于高温条件下的蒸发问题，微孔板在达到指数生长期所需的时间范围内尚无法使用。其次，由于市面上尚无可在高温（>45 °C）下运行的基于微孔板的分光光度计，导致关键生长曲线参数（如生长速率、倍增时间及滞后期）的估算变得困难。根据本文所述方法，目前对生长曲线的表征仍需依赖劳动密集型的破坏性取样，因而限制了通量。最后，针对嗜热菌适应菌株竞争适合度的高通量评估技术尚未充分发展。特别是，若能开发出可用于区分不同菌株的耐热荧光蛋白，将有望实现基于流式细胞术的高通量适合度检测28,29；近年来已出现具有不同光谱特性的耐热荧光蛋白，提示这一方向具有潜在的发展前景30,31,32。提高通量是嗜热菌实验进化技术进一步发展的必然方向，这将有助于更全面地描述进化过程。

披露

作者声明不存在任何利益冲突。

致谢

作者感谢弗莱堡大学的 SV Albers 教授、布鲁塞尔自由大学的 Eveline Peeters 教授以及布鲁塞尔自由大学的 Rani Baes 博士提供的建议和帮助 S. acidocaldarius DSM639 菌株。本工作由英国皇家学会研究资助（授予 DRG：RGS\R1\231308）和英国研究与创新署-自然环境研究委员会（UKRI-NERC）资助。 "探索前沿" 研究资助（授予 DRG 和 CGK：NE/X012662/1）以及科威特大学博士奖学金（授予 ZA）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 μm 注射器驱动膜过滤器StarLabE4780-1226用于过滤不能高压灭菌的培养基组分。
1 μL 接种环Greiner731161、731165 或 731101用于接种培养物。也可使用其他类型的接种环。
1000 μL 移液器吸头StarLabS1111-6811也可使用其他移液器吸头。
2 mL 微量离心管StarLabS1620-2700用于在恒温混匀仪中培养 S. acidocaldarius。
200 μL 移液器吸头StarLabS1111-0816也可使用其他移液器吸头。
50 mL 带锥形底的聚苯乙烯管Corning430828 或 430829可使用其他类型的管。请在 75 °C 下检测其性能。带插塞盖的管可能无法提供足够的通气；使用前请先测试。 
50 mL 注射器BD plastipak300865用于配合注射器驱动过滤器使用。
96 孔微孔板（未处理，平底）Nunc260860用于在分光光度计中测定 600 nm 处的光密度（OD）。
可调间距多通道移液器Pipet-LiteLA8-300XLS可选，但在微量离心管与 96 孔板之间转移液体时可节省时间。
硫酸铵 ((NH4)2SO4)Millipore168355用于配制 Brock 储液 I。
高压灭菌器PriorclaveB60-SMART 或 SV100-BASE也可使用其他类型的高压灭菌器。
Breathe-EASY 气体可渗透密封膜Sigma-AldrichZ763624-100EA裁剪至合适尺寸后用于穿孔的微量离心管。若使用其他气体可渗透膜，需确保其在 75 °C 下性能良好
二水氯化钙 (CaCl2·2H2O)Sigma-AldrichC3306用于配制 Brock 储液 I。
CELLSTAR 六孔板（悬浮/未处理）GreinerM9062其他厂家的六孔板也可能适用。需检测其在高温下的性能。
七水硫酸钴(II) (CoSO4·7H2O)Supelco1025560100用于配制微量元素储备液。
二水氯化铜(II) (CuCl2·2H2O)Sigma-Aldrich307483用于配制微量元素储备液。
无水 D-(+)-葡萄糖 (C6H12O6)Thermo Scientific Chemicals11462858也可使用其他戊糖和己糖（例如 D-木糖、D-阿拉伯糖）。葡萄糖并非 S. acidocaldarius 的优选碳源（SV Albers，个人交流）
双蒸水 (ddH2O)
琼脂替代物 GelriteDuchefa BiochemieG1101.1000Gelrite（结冷胶）因具有更高的熔点，可替代琼脂用于制备固体培养基。
玻璃 100 mm 培养皿BrandBR455742使用玻璃培养皿是因为大多数标准的 90 mm 聚苯乙烯培养皿在 75 °C 下会变形（取决于品牌）。也可使用六孔板，因其在高温下不会变形。
培养箱New BrunswickInnnova 42R也可使用其他类型的培养箱。购买或使用前请确认设备的工作温度，因为许多培养箱无法达到高于 65°C 的温度。
六水氯化铁(III) (FeCl3·6H2O)Supelco103943用于配制铁储备液
七水硫酸镁（Epsom 盐）(MgSO4·7H2O)Sigma-Aldrich230391用于配制 Brock 储液 I。
四水氯化锰(II) (MnCl2·4H2O)Sigma-AldrichSIALM5005-100G用于配制微量元素储备液。
迷你智能 Wi-Fi 插座，带能耗监测功能TapoTapo P110用于监测能耗 
N-Z-Amine A - 酪蛋白酶解水解物 Sigma-AldrichC0626-500GN-Z-Amine-A 用作氨基酸来源。
回形针（或其他坚固金属丝）无无用于穿刺 2 mL 微量离心管。
磷酸二氢钾（单磷酸钾）(KH2PO4)Sigma-AldrichP0662用于配制 Brock 储液 I。
Promega Wizard 基因组 DNA 纯化试剂盒PromegaA1120可选，用于实验室提取基因组 DNA
二水钼酸钠 (Na2MoO4·2H2O)Sigma-AldrichM1651-100G用于配制微量元素储备液。
十水四硼酸钠（硼砂）(Na2B4O7·10H2O)Sigma-AldrichS9640用于配制微量元素储备液。
分光光度计BMGSPECTROstar OMEGA用于测定 600 nm 处的光密度（OD）。其他可读取 600 nm OD 值的分光光度计也可使用。
硫酸（按 1:1 比例用水稀释）(H2SO4)Thermo Scientific Chemicals11337588用于将 Brock 储液 II/III 的 pH 调整至最终 pH 2–3。
恒温混匀仪DLabHM100-Pro也可使用其他类型的恒温混匀仪；关键是要能维持 65–75 °C 的温度和 400 RPM 的转速
尿嘧啶 (C4H4N2O2)Sigma-AldrichU0750pyrE 基因的缺失是 S. acidocaldarius 中常见的遗传标记。缺失菌株必须补充尿嘧啶才能生长。对于 DSM639 野生型菌株，补充尿嘧啶并非严格必需，但此处仍包含此步骤，因为后续实验可能涉及缺失菌株。
二水硫酸钒氧 (VOSO4·2H2O)Sigma-Aldrich204862用于配制微量元素储备液。
七水硫酸锌 (ZnSO4·7H2O)Sigma-Aldrich221376用于配制微量元素储备液。

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生命极端环境下的适应：利用嗜极古菌Sulfolobus acidocaldarius进行的实验进化
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