生命极端的适应:极端微生物 Sulfolobus acidocaldarius 的实验进化

摘要

在这里，我们提出了一种实验进化方案，用于利用低成本、节能的台式热混合器作为培养箱在嗜热菌中适应。该技术通过对 Sulfolobus acidocaldarius 的温度适应表征来证明，Sulfolobus acidocaldarius 是一种最佳生长温度为 75 °C 的古细菌。

摘要

古细菌 Sulfolobus acidocaldarius 已成为一种很有前途的嗜热模式系统。研究嗜热菌如何适应温度变化是一项关键要求，不仅对于理解基本的进化过程，而且对于开发 S. acidocaldarius 作为生物工程的底盘。使用嗜热菌进行实验进化的一个主要障碍是传统培养箱用于高温生长的设备维护和能源使用费用。为了应对这一挑战，提出了一种利用低成本和节能的台式热混合器在 S. acidocaldarius 中进行实验进化的综合实验方案。该方案涉及体积相对较小的分批培养技术 （1.5 mL），能够追踪多个独立谱系的适应。通过使用额外的热混合器，这种方法很容易扩展。这种方法通过减少与实验研究相关的初始投资和持续成本，增加了 S. acidocaldarius 作为模型系统的可及性。此外，该技术可转移到其他微生物系统，以探索对不同环境条件的适应。

引言

地球上的早期生命可能起源于极端环境，例如热液喷口，其特点是极高的温度和酸度¹。微生物继续栖息在极端环境中，包括温泉和火山 solfatara。描述在这些极端条件下发生的进化动力学可能会阐明在这些条件下生存的特殊生理过程。这可能具有广泛的影响，从我们对生物多样性起源的理解到开发具有生物技术应用的新型高温酶。

尽管极端环境中的微生物进化动力学至关重要，但对它的理解仍然有限。相比之下，通过应用一种称为实验进化的技术，获得了关于嗜温环境中进化的重要知识体系。实验进化包括在实验室条件下观察进化变化 2,3,4,5。通常，这涉及确定的变化环境（例如，温度、盐度、引入毒素或竞争对手的生物体）^7,8,9。当与全基因组测序相结合时，实验进化使我们能够测试进化过程的关键方面，包括平行性、可重复性和适应的基因组基础。然而，迄今为止，大部分实验进化都是用嗜温微生物（包括细菌、真菌和病毒 2,3,4,5，^但大部分不包括古细菌）进行的。一种适用于嗜热微生物的实验进化方法将使我们能够更好地了解它们是如何进化的，并有助于更全面地理解进化。这具有潜在的广泛影响，从破译地球上嗜热生命的起源到涉及高温生物过程中使用的"极端酶"的生物技术应用¹⁰和天体生物学研究¹¹。

古细菌 Sulfolobus acidocaldarius 是开发嗜热菌实验进化技术的理想模式生物。S. acidocaldarius 以好氧方式繁殖，最佳生长温度为 75 °C（范围 55 °C 至 85 °C）和高酸度（pH 2-3）4,6,12,13,14。值得注意的是，尽管生长条件极端，酸性链球菌仍保持着与嗜温菌相当的种群密度和突变率 7,15,16,17,18。此外，它拥有一个相对较小的、注释良好的基因组（菌株 DSM639:2.2 Mb，36.7% GC，2,347 个基因）¹²;S. acidocaldarius 还受益于强大的基因组工程工具，允许通过靶向基因敲除直接评估进化过程¹⁹。一个值得注意的例子是 S. acidocaldarius 的转基因菌株的可用性，例如 MW001¹⁹ 和 SK-1²⁰ 的尿嘧啶营养缺陷型菌株，它们可以作为选择标记。

用嗜热菌（如 S. acidocaldarius）进行实验进化存在重大挑战。这些研究需要在高温下延长孵育时间，这对液体和固体培养技术都造成了相当大的蒸发。在高温下长时间操作也会损坏液体培养基中实验进化中常用的传统振荡培养箱。探索多个温度需要大量的财务投资来购买和维护多个孵化器。此外，所需的高能耗引发了重大的环境和财务问题。

这项工作介绍了一种方法来解决使用嗜热菌（如 S. acidocaldarius）进行实验进化时遇到的挑战。以 Baes 等人开发的用于研究热休克响应的技术^14,21 为基础，这里开发的方法利用台式热混合器进行一致可靠的高温孵育。其可扩展性允许同时评估多个温度处理，从而降低购买额外孵化设备的成本。这提高了实验效率，能够对影响嗜热菌进化动力学的因素进行稳健的统计分析和广泛研究²²。此外，与传统孵化器相比，这种方法显着减少了财务初始投资和能源消耗，提供了一种更可持续和环保的替代方案。

我们的方法为实验研究以极端温度为特征的环境中的进化动力学奠定了基础，这可能在地球生命多样化的早期阶段发挥了关键作用。嗜热生物具有独特的特性，但它们的极端生长条件和特殊要求往往限制了它们作为模型系统的可访问性。克服这些障碍不仅扩大了研究进化动力学的研究机会，而且还增强了嗜热菌作为科学研究中模型系统的更广泛用途。

方案

1. S. acidocaldarius 生长培养基 （BBM⁺） 的制备

注:为了培养 S. acidocaldarius，该方案使用 Basal Brock 培养基 （BBM⁺）²³。这是通过首先混合下面概述的无机储备液来制备 BBM− 来制备的，BBM⁻ 可以提前制备。然后根据需要通过将有机储备溶液添加到 BBM ^- 中来制备 BBM⁺。储备溶液配方也见表 1。所有培养基和储备液均应在双蒸 H₂O （ddH₂O） 中制备。

1. 生长培养基无机储备液的制备
   1. 制备痕量元素储备液。
      1. 向 ddH₂O 中加入 9 g/L 十水合四硼酸钠 （Na₂B₄O₇·10H₂O），然后滴加 1:1 H₂SO₄ 直至溶解，以制备微量元素储备液。
      2. 依次加入 0.44 g/L 七水硫酸锌 （ZnSO₄·7H₂O）、0.1 g/L 二水氯化铜 （CuCl₂·2H₂O）、0.06 g/L 二水合钼酸钠 （Na₂MoO₄·2H₂O）、0.06 g/L 硫酸钒 （IV） 二水合物 （VOSO 4.2H₂O）、0.02 g/L 硫酸钴 （II） 七水合物 （CoSO₄·7H ₂O）， 和 3.6 g/L 氯化锰 （II） 四水合物 （MnCl₂·4H₂O）。高压灭菌溶液并储存在 4 °C。
   2. 通过将 20 g/L 六水合铁 （FeCl₃·6H₂O） 溶解在 ddH₂O 中来制备 Fe 储备溶液 （1000x）。通过过滤 0.22 μm 过滤器对溶液进行消毒并储存在 4 °C。
   3. 通过将 70 g/L 氯化钙 （CaCl₂·2H₂O） 溶解在双蒸水 （ddH₂O） 中来制备布洛克溶液 I （1000x）。高压灭菌并储存在 4 °C。
      注意:将 CaCl₂·2H₂O 溶解在水中是一个放热过程。请谨慎执行此步骤。佩戴 EN407 级热危害手套以防止受伤。不要紧紧关闭容器，因为压力可能会增加。
   4. 通过混合 130 g/L 硫酸铵 （（NH₄）₂SO₄）、25 g/L 硫酸镁七水合物 （MgSO₄·7H₂O）、28 g/L 磷酸二氢钾 （KH₂PO₄） 和 50 mL 先前制备的微量元素储备液来制备布洛克溶液 II/III。使用 1:1 H₂SO₄，将储备溶液的 pH 值调节至 2-3。高压灭菌溶液并将其储存在室温 （RT） 下。
2. 生长培养基有机储备液的制备
   1. 通过将 300 g/L （30% w/v） 的 D-葡萄糖溶解在 ddH₂O 中来制备 D-葡萄糖储备溶液 （100x），并过滤灭菌（通过 0.22 μm 过滤器）。储存在 4 °C。
      注意:根据实验要求，可以使用其他碳源代替 D-葡萄糖（例如，D-木糖）。
   2. 通过将蛋白胨以 100 g/L 的浓度溶解在 ddH₂O. 高压灭菌器中，从酪蛋白原液 （100x） 制备蛋白胨，以灭菌并在室温下储存储备溶液。
   3. 通过将 2 g/L 尿嘧啶溶解在 ddH₂O 中并过滤灭菌（通过 0.22 μm 过滤器）来制备尿嘧啶原液 （100x）;储存在 -20 °C。
3. 制备 1x 工作浓度的 BBM ⁺ 生长培养基
   1. 首先，通过高压灭菌制备 988 mL 无菌 ddH₂O。
   2. 通过将 1 mL Brock 储备溶液 I、10 mL Brock 储备溶液 II/III 和 1 mL Fe 储备溶液添加到先前高压灭菌的 988 mL 无菌 ddH₂O 中制备 1 L BBM ⁻ 。用 1:1 H₂SO₄ 将培养基 pH 值调节至 2-3 的范围。
      注意:BBM⁻ 可以提前制备并在 RT 中储存长达 1 个月。
   3. 最后，为了产生 1 L BBM ⁺ ，将 D-葡萄糖储备液、酪蛋白蛋白素储备液中的蛋白胨和尿嘧啶储备液各 10 mL 与 985 mL BBM ⁻ 混合。充分混合，用 1:1 H₂SO₄ 将培养基 pH 值调节至 2-3。
      注意:BBM⁺ 应根据需要新鲜制作。
4. BBM⁺ 固体培养基的制备
   1. 制备 1 M MgCl₂ 和 CaCl₂ 储备溶液;这些将有助于 BBM 固体介质的固化。对于 1 M MgCl₂，向 100 mL ddH₂O 中加入 9.5 g。对于 1 M CaCl₂，加入 11 g 至 100 mL ddH₂O. 高压灭菌器进行灭菌。
      注意:将 CaCl₂·2H₂O 溶解在水中是一个放热过程。请谨慎执行此步骤。佩戴 EN407 级热危害手套以防止受伤。不要紧紧关闭容器，因为压力可能会增加。
   2. 将 3% （w/v） 结冷胶（例如，30 g/L）在 ddH₂O 中混合，然后高压灭菌。
      注意:这里使用结冷胶（例如，Gelrite）作为胶凝剂，因为标准细菌琼脂不能在 75 °C 下凝固。
   3. 另外，为固体培养基制备 BBM ⁺ ，将其与步骤 1.4.1 中制备的无菌结冷胶以 1:1 的比例混合。
      1. 首先，按照步骤 1.3.2 准备 1 L BBM ⁻ 。将 887 mL BBM⁻ 与 1 mL Fe 储备液和 20 mL D-葡萄糖储备液、酪蛋白蛋白素储备液蛋白胨和尿嘧啶储备液各混合。
      2. 加入 40 mL 的 1 M MgCl₂ 和 12 mL 的 1 M CaCl₂。充分混合，用 1:1 H₂SO₄ 将培养基 pH 值调节至 2-3。
         注:此处添加的储备液体积故意大于步骤 1.3 中制备液体 BBM⁺ 的体积。这是为了说明在以下步骤中与熔融结冷胶以 1:1 的比例混合。
   4. 将固体培养基的 BBM⁺ 预热至约 75 °C，并以 1:1 的比例与 ddH₂O 中的熔融结冷胶混合。充分混合并倒入热稳定塑料（例如聚丙烯）、玻璃培养皿或六孔板中，以促进S. acidocaldarius 的生长。混合后立即使用琼脂，因为它会迅速凝固。
      注意:一些通常用于微生物学的聚苯乙烯 90 mm 培养皿如果在高温下长时间孵育，会变形。
      注意: 处理热液体时，请采取适当的安全预防措施;佩戴 EN407 级热危害手套以防止受伤。

2. 从冷冻原液培养物中恢复 S. acidocaldarius

1. 准备通风的生长管，以确保足够的通气和氧气可用性。
   1. 提前准备穿孔的 2 mL 微量离心管用于 Sulfolobus 生长。使用本生灯火焰小心加热钝丝（>0.7 毫米，例如拉直的回形针），并刺穿管盖，形成一个约 1 毫米的小孔。
   2. 将穿孔管放入可高压灭菌的容器（例如，空的移液器吸头盒）中并高压灭菌。
      注意:佩戴 EN407 级热危害手套，以防止受热金属对手造成热损伤。仅将电线加热一小段时间 （1-2 秒） 以防止过热。只能使用熔点高的金属（钢）。
2. 接种 S. acidocaldarius 的发酵剂培养物。
   1. 用 1.5 mL 预热的 BBM⁺（如第 1 部分所述，在 75 °C 下预孵育至少 15 分钟）填充高压灭菌的穿孔 2 mL 试管。
   2. 用甘油原液（25% v/v 甘油，储存在 -80 °C）中刮擦（相当于 50 - 60 mg）接种充满 BBM ⁺ 的试管。这里使用 酸性链球菌 菌株 DSM639。用 1.5 mL BBM+ 填充另一支试管作为阴性对照。
3. 为防止任何气溶胶从穿孔的 2 mL 管盖中逸出并污染生长环境（和任何其他样品）并减少管内培养物蒸发的可变性，请在盖子顶部放置一层透气膜，该膜可以承受高温 （65-85 °C） 并阻止微生物逃逸/渗透。
   注:使用透气膜密封管道可显著减少蒸发。在 75 °C 下 48 小时内，密封管的平均体积损失为 8.63%（范围:3.29-16.45%， n = 24 个技术重复，重复两次），而未密封管的平均体积损失为 25.05%（范围:11.92-62.91%， n = 24 个技术重复，重复两次）。
4. 将接种管在 75 °C 的热混合器中以每分钟 400 转 （RPM） 的恒定摇动孵育 48-72 小时或直到达到 0.3 - 0.8 的 OD_600nm （通过分光光度计测量）。
   注:2 mL 试管的穿孔盖和摇动允许适当的通气以实现最佳生长。热混合器的盖子应就位，以确保保持一致的温度并减少蒸发。
5. 孵育期后，给复活的培养物第二个生长期（预处理）。
   1. 通过在室温下以 5000 x g 旋转试管 2 分钟来沉淀培养物。然后，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于新鲜的 1.5 mL 温热 BBM⁺ 中。
      注意:该实验使用 S. acidocaldarius 野生型菌株 DSM639，但这些生长和实验进化方法可以应用于任何 Sulfolobus 菌株和潜在的其他嗜热菌。

3. 确定 S. acidocaldarius 的种群密度、倍增时间和指数生长阶段

1. 确定所选选择条件的种群密度和指数增长阶段的时间。对于要测试的每种环境条件，按照步骤 2.1-2.5 准备三种发酵剂培养物。
2. 在 BBM ⁺ 中将三种培养物稀释至 OD_{600 nm} 为 0.01。从每种培养物中至少制备 20 mL。这三种培养物代表技术重复。
3. 使用破坏性采样执行 OD_600nm 随时间变化的重复生长曲线。
   1. 从步骤 2.1 中准备 24 个穿孔的 2 mL 试管，将它们分成三组，每组 8 个，并标记这些技术重复 1、2 和 3（例如，标记为重复 1 的 8 个试管等）。
   2. 从步骤 3.2 中三种稀释的培养物中，将 1.5 mL 移液到七个准备好的试管中。用 1.5 mL 的 BBM + 填充剩余的试管作为阴性对照。
4. 将所有 24 个试管在 75 °C 和 400 RPM 的热混合器中孵育。用透气膜密封。以固定的时间间隔（如 0、4、8、12、24、36、48 小时），从三个重复中的每一个中取出一根试管，并使用分光光度计测量 OD_600nm ，然后丢弃试管。拆下管子后更换透气膜。
5. 同时，确定 OD_600nm 与种群密度之间的关系。在 BBM⁺ 培养基中连续稀释（1 x ^10-1 至 1 x ^10-6）至少三个时间点（理想情况下，开始、中间和结束）。将 100 μL 的每种稀释液接种在固体 BBM ⁺ 培养基上（如步骤 1.4 中制备）。
   注:为了实现一致的菌落生长和准确的计数，最好将稀释的培养物移液到固体培养基上，而不进行机械铺展，例如使用 L 形铺展器或玻璃珠。机械扩散似乎对菌落形成产生不利影响。
6. 将板在 75 °C 的静态培养箱中孵育，直到出现菌落（5-7 天）。
   1. 在此期间，保持培养箱潮湿，以避免培养板过度干燥，否则不会形成菌落。
   2. 通过将板放入衬有湿布的密闭聚丙烯盒中来实现这一点。刺穿盒子的盖子至少 3 次，以便通气。
   3. 在培养箱中放入水桶以增加湿度。每天重新装满桶。
7. 收集完所有 OD_600nm 测量值后，通过将 logistic 曲线拟合到 OD_600nm 和时间之间的关系来确定倍增时间和达到指数生长阶段的时间，例如，使用 R 中 growthcurver 包中的 SummarizeGrowth。
8. 在固体培养基上形成可见的菌落后，对菌落形成单位 （CFU） 进行计数，旨在从稀释因子开始计数，产生 50-100 个菌落以获得最佳准确性。
9. 使用以下公式计算培养基中的细胞密度:CFU/mL = 菌落数/（铺板体积×稀释因子）。
10. 执行对数-对数线性回归以确定 log10 （CFU） 和 log10 （OD_600nm） 之间的关系。因此，根据回归模型的斜率和截距计算给定 OD 的预测 CFU/mL:预测的 CFU = 10 ^{[斜率× log10（OD 600nm） + 截距]。}
11. （可选）此外，在振荡培养箱中执行步骤 3.1-3.10，以确定在热混合器中是否实现了类似的生长。

4. 开始独立谱系进行实验进化

1. 第 1 天:要生成单个菌落，首先执行上述第 2 部分的所有步骤以生成起始培养物。
2. 第 3 天:测量培养物的 OD_600nm ，以确保其在指数期达到足够的密度（分光光度计的 OD_600nm 0.3-0.8）。
3. 从 1 x ^10-1-1 x ^10-6 中创建酸性链球菌 DSM639 培养物的连续稀释液，并从每个 1 x ^10-5 和 1 x ^10-6 稀释液中将 100 μL 分散到含有固体 BBM ⁺ 培养基（第 1 部分和表 1）的 6 孔板的孔中，分几次重复。如步骤 3.5 所示，在 75 °C 的静态培养箱中孵育板 5-7 天，以出现单个菌落。
4. 第 8-10 天（孵育后 5-7 天）:
   1. 确定来自单个菌落的进化谱系的数量。对于每个谱系，使用接种环从板中随机选择一个菌落。将菌落重悬于装有 1.5 mL 预热 BBM⁺ 培养基的穿刺 2 mL 试管中。适当标记试管。
   2. 对所需数量的谱系重复此操作;在这里，建立了 7 个谱系并标记了 SA1-7。用 1.5 mL BBM+ 填充另一支试管作为阴性对照。
   3. 用透气膜密封管的顶部，并在 75 °C、400 rpm 的热混合器中孵育 48-72 小时，直到培养物变得浑浊（相当于分光光度计的 OD_600nm 0.3-0.8）。
5. 第 10-12 天（接种后 7-9 天）:
   1. 在台式离心机中，在 RT 下以 5,000 x g 的速度旋转克隆培养物 1 分钟。弃去上清液，用 200 μL 液体 BBM⁺ 重悬沉淀。
   2. 将 200 μL 细胞悬液与 200 μL 50% 甘油（25% v/v 甘油）混合，以制备七个独立谱系的甘油储备液，并储存在 -80 °C。 这些是进化实验的祖先种群。

5. 进行温度变化实验

注意: 图 1 给出了概述实验方案主要方面的概念图。

1. 使用第 4 节中生成的七个祖先种群进行进化实验。
   1. 在用渗透膜密封的无菌、穿孔的 2 mL 试管中进行所有实验进化测定（如上所述，第 2 节）。
   2. 除了这些群体外，保持单独的穿孔 2 mL 试管，其中 1.5 mL BBM⁺ 作为阴性对照，无培养物，以监测（交叉）污染并设置表明培养物没有生长的 OD 阈值。
2. 建立温度处理:使用热混合器可以建立多个温度处理。在这里，使用以下温度处理:恒定 75 °C、恒定 65 °C，并通过每 4 天降低 1 °C 从75-65 °C逐渐下降（"温度下降处理"）。
   注意:这些处理可以根据特定的实验要求进行定制。每次温度处理都需要一个单独的热混合器。
3. 第 1 天:按照第 2 节中概述的步骤，从他们的甘油储备液（在步骤 4.5 中准备）中恢复祖先种群。
4. 第 3 天:
   1. 将这些培养物稀释至 OD_{600 nm} 的 0.01（通过分光光度计测量）至总体积至少 6 mL 的预热 BBM⁺。将 7 种稀释的祖先群体培养物中的每一种 1.5 mL 分装到三个单独的穿刺 2 mL 管中，步骤 5.2 中建立的每种温度处理一个管。
      注意:该等分步骤确保在进化实验开始时，每个祖先种群中存在的任何遗传变异都存在于所有温度处理中。这些培养物将充当转移 0 （Tx0） 以开始温度演变实验。
   2. 用透气膜密封试管，并将每组 7 个祖先种群放入单独的热混合器中。将每个热混合器设置为所需的温度和 400 rpm 以开始进化实验。
5. 第 5 天:
   1. 48 小时后，通过将 1.5 mL 加热的 BBM ⁺ 培养基接种在穿刺的 2 mL 试管中，用来自每种 Tx0 培养物的 15 μL 培养物（1:100 稀释）进行转移 1 （Tx1）。为了提高速度，使用可变宽度多通道移液器执行此步骤，以同时完成单个实验的多次转移，从而减少培养物从热混合器中排出的时间。
   2. 和以前一样，密封试管，然后再将它们放回随机位置放入各自的热混合器中。手动或通过 iMetaLab 96 孔随机化器进行随机化。
6. 在基于板的分光光度计（96 孔板中为 200 μL;使用相同体积的 BBM ⁺ 作为空白）中测量 Tx0 的_{OD 600nm}，以跟踪独立谱系的生长。
   注意:在转移到新鲜培养基后，应测量 OD_600nm ，以防止污染。光密度也可以通过其他方式测量，例如使用标准分光光度计。使用基于板的分光光度计可以同时测量多种培养物，从而简化过程。
7. 在第 7、9、11 天等重复步骤 5.5 和 5.6，对应于 Tx2、Tx3、Tx4 等。在 75 °C 和 65 °C 处理中保持温度恒定。对于温度下降处理，每秒转移将温度降低 1 °C（即，在 Tx2、Tx4、Tx6 等上）。
8. 在每 10^次 转移（即 Tx10、Tx20 等）后准备种群的甘油储备液（步骤 3.2.3），用祖先种群标识符（例如，SA1 表示^{第 1 个} 独立种群）和转移编号（例如，Tx10 表示第 10^次 转移）。稍后使用这些甘油储备液来恢复种群，以研究种群如何随时间变化，或在需要时重新开始实验（例如，由于污染或意外事件导致培养物丢失）。
9. 让实验进行预定的转移次数，或者直到经过预定的世代数。在最后一次转移时，准备所有后代谱系的甘油储备液。
   注:在这里，实验一直进行到温度下降处理达到 65 °C，这发生在 Tx22 上。这相当于大约 150 代（根据 4.6 中 100 的稀释因子计算:log₂（100） = 每次转移 6.64 代）。进化实验的长度可根据实验要求进行调整。

6. 进化后实验生长测定:祖先与进化谱系

注意: 图 2 给出了概述生长/适应度测定方案的概念图。

1. 用 1.5 mL BBM⁺ 准备穿孔的 2 mL 试管。准备足够的试管来生长所有后代谱系以及每个祖先菌株。
2. 使用步骤 2.2-2.5 中概述的方法在进化实验的最终转移后，恢复祖先种群和储存在步骤 5.9 中的每个后代种群，但在每个种群经历的温度下孵育进化实验的最后两次转移，即 75 °C 用于 75 °C 恒定处理，65 °C 用于 65 °C 恒定和温度下降实验。为了获得可比的群体密度，进行 75 °C 孵育 72 小时和 65 °C 孵育 120 小时。
3. 通过基于板的分光光度计测量生长的培养物的 OD_600nm 。
4. 在两个温度（即 75 °C 和 65 °C）下对每个后代群体和每个祖先菌株进行生长测定，重复三次。用 1.5 mL BBM⁺ 制备穿孔的 2 mL 离心管。为每个进化的谱系和每个祖先菌株准备六个试管。用谱系名称（SA1-7 或祖先）、生长温度（75 °C 或 65 °C）和重复 ID（1、2 或 3）标记管。
   注:如果可用的热混合器少于 6 个，则可以在多个实验块中重复生长测定。在这种情况下，测量每个实验块中的每个谱系和祖先非常重要，这样就可以估计和统计解释块效应。
5. 用来自每个后代谱系和祖先菌株的 15 μL 培养物接种六个准备好的试管中的新鲜培养基。
6. 将三个热混合器设置为 75 °C，将三个热混合器设置为 65 °C，将每个热混合器指定为重复 ID。将试管放入与温度和重复 ID 相对应的热混合器中。在每个 thermomixer 中，确保谱系和祖先随机放置以控制异质性。
7. 用渗透膜密封每组 24 根试管。孵育 48 小时。
8. 将每种培养物中的 200 μL 转移到 96 孔板中。使用分光光度计测量 OD_600nm 。
   注:可变宽度多通道移液器可用于促进微量离心管和 96 孔板之间的转移。
9. 使用统计软件（例如 R）绘制和分析数据。

7. 进化谱系的全基因组测序和突变鉴定

1. 如第 2 节第 2.2-2.5 节所述，将每个冷冻种群的冰块接种到 BBM ⁺ 中，在 75 °C 下 48-72 小时，在预热的 BBM ⁺ 中恢复步骤 5.9 中储存的后代谱系。制备 1-10 mL 的培养物体积，以获得足量的基因组 DNA。所需的确切体积取决于在步骤 7.2 或 7.3（如下）中选择的测序选项。
   注意:最好对用于启动祖先种群的菌株进行测序。这是为了正确确定在后代谱系中检测到的任何突变是否是在进化实验期间出现的，而不是之前出现的。
2. （选项 1）提取基因组 DNA 并准备用于 Illumina 测序的 Illumina 测序文库。
   1. 使用市售的细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取和纯化基因组 DNA。
   2. 使用测序提供商推荐的商业试剂盒，确保提取的基因组 DNA 满足测序提供商的数量和质量要求。
   3. 根据制造商的方案，使用商业试剂盒进行基因组 DNA 文库制备。建议使用 250 bp 双端方案。将提取的基因组 DNA 储存在 -20 °C 下，直到准备好将样品提交给测序提供商。
3. （选项 2）或者，将样本发送给商业提供商，该提供商将 DNA 提取、基因组 DNA 质量检查、Illumina 文库制备和 Illumina 测序作为组合服务进行。
4. 分析测序的基因组以识别突变。
   1. 接收 FASTQ 文件，如果测序提供商尚未执行，则使用 Trimmomatic 执行适配器修剪，滑动窗口质量截止值为 Q15。
   2. 使用修剪的 FASTQ 文件，运行 breseq 管道（版本 0.38.1）以检测突变，将基因组 DNA 读数与所选菌株的参考序列进行比较。对于 S. acidocaldarius DSM639，这是 RefSeq ID NC_007181。

8.（可选）热混合器与培养箱能耗的评估

1. 为了比较使用培养箱与热混合器生长的能耗，请使用能源监测插头测量每个设备在 24 小时内的能耗。
2. 使用两个插头同时测量两个设备的能耗。或者，连续几天测量能耗。
3. 断开培养箱或恒温混合器与电源插座的连接。将电能监控插头插入插座，并根据制造商的说明进行初始化，包括安装监测和控制软件。
4. 将培养箱或恒温混合器插入能量监测插头，并让它运行至少 2 小时（但最好是 24 小时或更长时间），以准确估计典型能耗。记录每个设备的能耗。

结果

生长曲线测量
S. acidocaldarius DSM639 的生长曲线如图 3A 所示。将 thermomixer 的培养与传统培养箱中的培养进行比较时，发现生长相似。通过将 logistic 曲线拟合到每条复制的生长曲线并计算平均值和标准误差来估计平均生长速率参数。在热混合器和培养箱上达到指数中期的时间分别为 27.2 小时± 1.1 小时和 31.1 小时± 1.9 小时。在 75 °C 下，热混合器和培养箱的估计初始倍增时间分别为 4.29 小时± 0.28 小时和 4.19 小时± 0.44 小时，这与以前公布的值一致²⁴。log₁₀ （OD_600nm） 和 log₁₀ （CFU） 之间的关系通过线性模型 （调整后的 R² = 0.82，F（1,22） = 104，p < 0.00001，斜率 = 1.73 ± 0.17，截距 = 9.73 ± 0.14）。 因此，OD_600nm 和 CFU 之间的关系由公式 CFU = 10^{（1.73 × log10（OD600nm） + 9.73）} 给出。因此，OD_600nm 为 0.3 对应于大约 6.7 × 10⁸ CFU/mL（图 3B）。

温度演变实验
使用源自 S. acidocaldarius DSM639 的 7 个独立谱系开始三种温度条件，恒定 75 °C、恒定 65 °C 和温度下降 （75-65 °C，每两次转移降低 1 °C）。在实验的 45 天（75 °C 下大约 150 代）每次转移后进行 OD_600nm 测量，如图 4 所示。跨天进行的 OD_600nm 测量本质上是有噪声的，因为它们可能会受到生长期、温度等细微差异的影响。然而，跨天进行的测量仍然有助于评估种群生存能力，并指示健康状况是否随着时间的推移而改善。在实验结束时，OD_{600nm 中 OD 600nm} 的谱系从初始范围的 0.125-0.3 增加到 0.248-0.471 的范围。这表明这种治疗改善了健康状况。相比之下，来自恒定 65 °C 处理的谱系显示 OD_600nm 下降，从初始范围的 0.018-0.087 下降到最终时间点的 0.008-0.04。这表明种群无法适应 65 °C 的恒定温度，尽管可以恢复活生物体的事实表明，种群并没有通过连续稀释而被冲走，这表明存在一定程度的适应。最后，温度下降处理中的种群从初始 OD_600nm 范围的 0.099-0.279 增加到 Tx6 的 0.3-0.39 （对应于该处理中的 288 h 和 73 °C），随后在最后时间点稳步下降至 0.003-0.024 的范围。

生长/适应度测定
在进化实验之后，对每个后代群体进行适应性分析。在所有七个独立谱系生长 48 小时后测定_{OD 600nm} ，然后针对每个测定温度在 R 中拟合线性模型，其中"选择环境"作为主要效应，"复制/热混合器"作为阻断效应。祖先菌株的生长被用作治疗对比的参考水平。数据如图 5 所示。

当在 75 °C 下进行测定时，来自恒定 75 °C（t 检验:t ₂₁₀=3.64，p=0.0003）和恒定 65 °C（t 检验:t ₂₁₀=2.8，p=0.005）处理的谱系的适应度平均显著增加，但温度下降处理（t 检验:t₂₁₀=−0.87，p =0.38）。平均而言，当在 65 °C 下进行测定时，来自所有处理的谱系均显示出适应性增加（恒定 75 °C 谱系;t 检验:t₂₁₀=4.68，p<0.0001，常数 65 °C 谱系;t 检验: t₂₁₀，=4.24，p<0.0001，温度下降谱系;t 检验:t₂₁₀=3.15，p=0.002）。然而，对于两种测定温度，谱系之间的适应性存在相当大的差异（图 5）。一些谱系与祖先品系没有太大差异或适应性下降;这对于温度下降处理的谱系尤为明显。

值得注意的是，OD_600nm 和 CFU/mL 之间的关系在进化实验期间可能已经发生了变化。这可以通过确定进化谱系的生长参数来评估（遵循步骤 3.1-3.10）。

全基因组测序结果
使用 breseq （版本 0.38.1）²⁵ 对来自恒定 75 °C 条件的 7 个谱系使用 S. acidocaldarius DSM639 （RefSeq 登录NC_007181.1） 的参考基因组进行全基因组分析。揭示了所有后代谱系基因组中的各种突变，涉及插入、缺失和单核苷酸多态性 （SNP）（表 2）。蛋白质编码基因以及基因间区域存在多次插入和非同义突变，这些突变可能由于基因启动子区域的移码而影响基因表达。一些突变在涉及细胞壁生物合成、转录、代谢、细胞转运和催化活性等各种功能的基因的多个后代谱系中是一致的（表 2）。在这些突变中，7 个谱系中的 5 个谱系中有 54,667 个碱基对的大量缺失;每个群体的缺失覆盖证据图（频率范围从 93.2% 到 100%）证实了这一点。缺失的区域相当于丢失了 53 个基因;这些基因在适应中的作用将在未来的研究中进行研究。使用的 DSM639 分离株与已发表的参考序列之间存在一些差异（如 补充表 1 所示）。

振荡培养箱与热混合器的能耗
将振荡培养箱的能耗与使用市售能源监控智能插头的热混合器在常见培养温度范围内和此处使用的 75 °C 温度进行了比较。在 75 °C 时，热混合器消耗的^{能量大约是} 传统振荡培养箱的 1/40（图 6），这表明热混合器是减少与实验进化相关的碳足迹的潜在手段。

图 1:说明三种温度处理的进化实验方案的流程图。请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:说明生长/适应性测定方案步骤的流程图。请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:S . acidocaldarius DSM639 关键生长参数的测定和孵化装置的比较。 在 75 °C 下在 7 个单独的试管中培养 3 个重复培养物。破坏性采样用于测量 （A） OD_600nm （± n=3 次技术重复的标准误差;一些误差线小于绘图符号）;曲线代表拟合的 logistic 生长模型和 （B） 菌落形成单位 （CFU）;线表示拟合的对数-对数线性回归模型）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4:在进化实验中获得的光密度 （OD_600nm） 的代表性结果。 在大约 150 代进行的三种温度处理（恒定 65 °C、恒定 75 °C、下降 75 °C-65 °C）下的进化实验中测量的独立谱系的光学密度。曲线描绘了每个独立谱系随时间推移的 Loess 平滑度。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5:生长测定的代表性结果。 与祖先菌株相比，经过温度进化实验 （恒定 65 °C，恒定 75 °C，下降 75 °C-65 °C） 后，对源自 S. acidocaldarius DSM639 的独立谱系进行生长测定。对于所有谱系，在 65 °C 和 75 °C 下测定生长。 彩色点表示技术重复的平均值±标准误差（以灰色显示，祖先 为 n = 12，每个进化谱系为 n = 3）。灰色条表示祖先适应度的均值±标准误差。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 6:传统培养箱与热混合器装置的能耗。 使用市售的能源监控智能插头记录 2 小时内的能耗。 请点击此处查看此图的较大版本。

表 1:生长 S. acidocaldarius 所需的培养基配方和储备溶液。 所有培养基和储备液都应使用双蒸 H₂O （ddH₂O） 制成，然后如图所示，通过高压灭菌或通过 0.22 μm 过滤器过滤灭菌。有关如何制备所有培养基和储备液的详细说明，请参阅实验步骤的第 1 节。 请点击此处下载此表格。

表 2:后代谱系全基因组测序的代表性结果 。 在恒定 75 °C 处理的 S. acidocaldarius DSM639 后代谱系中发现突变。突变表示相对于谱系的直接祖先的变化，相对于 S. acidocaldarius DSM639 的参考序列具有一些变化（RefSeq NC_007181;祖先中的突变显示在 补充表 1 中）。 n 表示在其中发现突变的谱系数。→ 基因在"前向阅读框"上;← "反向阅读框" 上的基因。†这些变化是相对于 S. acidocaldarius DSM639 分离物中存在的 （A）10→11 移码（补充表 1）。 请点击此处下载此表格。

补充表 1: S. acidocaldarius DSM639 分离株中存在的相对于参考序列的突变（RefSeq 登录NC_007181.1）。 → 基因位于"前向阅读框"上;← "反向阅读框" 上的基因。‡SACI_RS04020 在 NC_007181.1 中被注释为假基因，但此处观察到的 Δ1 bp 移码突变推测恢复了其功能，因为突变，它编码的蛋白质与 RGY 反向旋转酶基因具有 100% 同一性（RefSeq 登录WP_176586667.1）。 请点击此处下载此文件。

讨论

这项工作开发了一种嗜热菌的实验进化方案，这里为古细菌 S. acidocaldarius 量身定制，但适用于其他具有高温生长要求的微生物。该协议建立在最初为嗜温细菌设计的技术之上，但经过专门修改以克服与高温需氧生长相关的技术挑战 2,4,5,24。这种方法的创建将能够探索在极端温度条件下发生的以前未表征的进化动力学，类似于生命进化最早阶段可能存在的条件¹。

为了从进化实验中获得可靠的结果，必须遵守该方案的几个关键方面。首先是谱系之间的独立性，这是通过在开始实验之前裸奔到单个菌落来实现的。这对于确保在不同谱系中发现的任何常见突变具有独立的起源至关重要。相反，如果分装散装液体培养物以启动谱系，则常见的遗传变异可能会分布到每个群体。第二个关键考虑因素是控制污染，这是通过保持无培养物的阴性对照和监测生长来实现的。与嗜温菌实验不同，极端微生物进化实验不太可能受到外部来源的污染，但谱系之间的交叉污染仍可能发生。保持曝气和蒸发之间的平衡是另一个关键考虑因素。S.acidocaldarius 是一种专性需氧菌，因此需要氧气才能生长^10,23。手动刺穿聚丙烯微量离心管并用透气膜^21,25 密封，是保持通气而不过度蒸发的关键。这种减少可能归因于密封管内保持了均匀的环境（数据未显示）。

该方法的两个方面可能需要根据用于进化实验的特定环境条件进行调整或故障排除:稀释因子和转移间隔时间。在这种方法中，每次转移都进行 1:100 稀释，需要平均 log₂（100） = 6.64 倍增才能恢复到相同的群体大小。这在适应潜力（最佳稀释因子由 Wahl 和 Gerrish²⁶ 计算）和实验可追踪性之间提供了良好的平衡。原则上，强稀释因子将使每天发生更多的世代，因为它需要更多的倍增才能恢复到相同的种群密度（例如，1:1000 需要 log₂（1000） = 9.97 倍平均）。然而，如果实现的倍增次数少于转移之间所需的倍增次数，则种群将通过稀释逐渐被洗掉，除非发生减少倍增时间的有益突变。每 48 小时转移一次种群，要求倍增时间小于 8 小时，这与估计的倍增时间和先前公布的 75 °C （4-6 h） 下酸性链球菌异养生长值一致^23,27。然而，对于恒定的 65 °C 和温度下降处理，OD_600nm 随着时间的推移逐渐降低，这表明这可能不是足够长的时间来实现所需的倍增次数，更长的转移期将是有益的。

与传统的振荡培养箱相比，使用热混合器进行实验进化的几个重要优势，特别是在研究对温度的适应时。热混合器是振荡培养箱的一种经济高效的替代方案，具有减少空间占用的额外优势。这些特性能够同时有效地评估多个温度处理。与振荡培养箱相比，热混合器的能耗更低，因此当孵育少量试管（例如，少于 100 支）时，使用它们可能会减少对环境的影响。这种能耗差异在与嗜温菌相关的温度下尤为明显，但也适用于更适中的温度范围（图 6），这意味着也可以采用嗜温器来减少嗜温菌实验进化对环境的影响。总的来说，这些属性表明，在实验进化中使用热混合器有可能提高这种研究方法的可及性，特别是在资源受限的环境中，例如发展中国家的实验室以及中小学教育。

尽管为嗜温实验进化提供了前进的道路，但目前的方法相对于嗜温实验进化存在一些局限性。首先，相对于涉及微量滴定板的高通量方法，使用热混合器可以建立的重复独立谱系的数量很少，而微量滴定板在嗜温细胞中广泛使用⁴。目前，高温下的蒸发排除了在达到指数增长所需的时间窗口内使用微量滴定板的可能性。其次，估计关键的生长曲线参数（如生长速率、倍增时间和滞后时间）具有挑战性，因为目前无法购买可在高温 （>45 °C） 下工作的板式分光光度计。使用此处概述的方法，目前的生长曲线表征需要劳动密集型的破坏性采样，因此限制了通量。最后，用于评估适应性分离株竞争适应性的高通量技术尚未针对嗜热菌彻底开发。特别是，开发可用于区分菌株的热稳定荧光蛋白将使基于流式细胞术的高通量适应性测定成为可能^28,29;具有不同光谱的热稳定荧光蛋白的最新发展使其成为潜在的未来发展 30,31,32。通量的增加是进一步开发嗜热菌实验进化技术的合乎逻辑的下一步，因为它将使进化过程能够得到更完整的描述。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 μm 针式膜过滤器	StarLab	E4780-1226	用于对无法高压灭菌的培养基成分进行过滤消毒。
1 μL 接种环	Greiner	731161、731165 或 731101	用于接种培养物。可以使用其他 Loop。
1000 μL 移液器吸头	StarLab	S1111-6811	可以使用其他移液器吸头。
2 mL 微量离心管	StarLab	S1620-2700	用于在热混合器中培养 S. acidocaldarius。
200 亩;L 移液器吸头	StarLab	S1111-0816	可以使用其他移液器吸头。
50 mL 锥形底聚苯乙烯管	Corning	430828 或 430829	可以使用其他管。在 75 &°C 下检查性能。带有塞子密封盖的试管可能无法充分通气;使用前请检查。
50 mL 注射器	BD plastipak	300865	用于注射器驱动的过滤器。
96 孔微量滴定板（未处理，平底）	Nunc	260860	用于在分光光度计中测量 600 nm 处的外径。
宽度可调的多通道移液器	Pipet-Lite	LA8-300XLS	可选，但在微量离心机和 96 孔板之间转移时可节省时间。
硫酸铵 （（NH4）2SO4）	Millipore	168355	用于布洛克储备溶液 I。
高压灭菌	Priorclave	B60-SMART 或 SV100-BASE	也可以使用其他高压灭菌器。
Breathe-EASY 透气密封膜	Sigma-Aldrich	Z763624-100EA	按尺寸切割，可用于穿孔微量离心管。如果替代其他透气膜，请确保性能在 75 °C
氯化钙二水合物 （CaCl2·2H2O）	Sigma-Aldrich	C3306	用于布洛克原液 I。
CELLSTAR 六孔板（悬浮液/未处理）	Greiner	M9062	其他制造商的六孔板可能会被替代。检查高温下的性能。
硫酸钴 （II） 七水合物 （CoSO4·7H2O）	Supelco	1025560100	用于痕量元素储备液。
铜 （II） 二水合物 （CuCl2·2H2O）	Sigma-Aldrich	307483	用于痕量元素储备液。
D-（+）-葡萄糖无水 （C6H12O6）	Thermo Scientific 化学品	11462858也可以使用	其他戊糖和己糖（例如 D-木糖、D-阿拉伯糖）。葡萄糖不是 S. acidocaldarius的首选碳源（SV Albers，个人通信）
双蒸水 （ddH2O）
Gelrite	Duchefa Biochemie	G1101.1000	Gelrite（结冷胶）由于其熔点较高，用于代替琼脂制造固体介质。
玻璃 100 mm 培养皿	品牌	BR455742	使用玻璃培养皿是因为大多数标准聚苯乙烯 90 mm 培养皿在 75 °C 处变形;C（取决于品牌）。或者，可以使用六孔板，因为它们在高温下不会变形。
培养箱	New Brunswick	Innnova 42R	其他培养箱。在购买/使用之前检查设备的工作温度，因为许多培养箱无法承受高于 65&°C 的温度。
铁 （III） 六水合物 （FeCl3·6H2O）	Supelco	103943	用于铁储备溶液
硫酸镁七水合物（泻盐）（MgSO4·7H2O）	Sigma-Aldrich	230391	用于布洛克储备液 I。
锰 （II） 四水合物 （MnCl2·4H2O）	Sigma-Aldrich	SIALM5005-100G	用于痕量元素储备液。
迷你智能 Wi-Fi 插座，能源监控	Tapo	Tapo P110	监控能源消耗
N-Z-胺 A - 酪蛋白酶解物	Sigma-Aldrich	C0626-500G	N-Z-胺-A 用作氨基酸的来源。
回形针（或其他坚固的金属丝）	无	用于	刺穿 2 mL 微量离心管。
磷酸二氢钾（磷酸二氢钾）（KH2PO4）	Sigma-Aldrich	P0662	用于布洛克原液 I。
Promega Wizard 基因组 DNA 纯化试剂盒	Promega	A1120	可选，在实验室中提取基因组 DNA
钼酸钠二水合物 （Na2MoO4·2H2O）	Sigma-Aldrich	M1651-100G	用于痕量元素储备液。
四硼酸钠十水合物（硼砂）（Na2B4O7·10H2O）	Sigma-Aldrich	S9640	用于痕量元素储备溶液。
分光光度计	BMG	SPECTROstar OMEGA	用于测量 600 nm 处的外径。可以使用其他可以在 600 nm 处读取 OD 的分光光度计。
硫酸（用水以 1：1 的比例稀释）（H2SO4）	Thermo Scientific 化学品	11337588	用于将布洛克储备液 II/III 的 pH 值调节至最终 pH 值 2–3。
Thermomixer	DLab	HM100-Pro	也可以使用其他温度混合器;关键考虑因素是保持 65&ndash 的能力;75 °C 温度和 400 RPM
尿嘧啶 （C4H4N2O2）	Sigma-Aldrich	U0750	pyrE 缺失是 S. acidocaldarius 中常用的遗传标记。缺失菌株必须补充尿嘧啶才能生长。DSM639 野生型菌株并非严格要求补充，但此处包括补充剂，因为未来的实验可能涉及缺失菌株。
硫酸钒二水合物 （VOSO4·2H2O）	Sigma-Aldrich	204862	用于痕量元素储备液。
硫酸锌七水合物 （ZnSO4·7H2O）	Sigma-Aldrich	221376	用于痕量元素储备液。