本文介绍了一种利用低成本、节能型台式恒温混匀仪作为培养设备，针对嗜热微生物进行实验进化的适应性演化实验方案。该技术通过表征一种最适生长温度为75 °C的古菌——Sulfolobus acidocaldarius的温度适应性加以示范。
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方法文章
生命极端环境下的适应：利用嗜极古菌Sulfolobus acidocaldarius进行的实验进化
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
嗜酸热硫化叶菌（Sulfolobus acidocaldarius）已成为一种极具潜力的嗜热模式系统。研究嗜热微生物如何适应温度变化，不仅对于理解基本的进化过程至关重要，而且对于将S. acidocaldarius开发为生物工程的底盘系统也具有重要意义。然而，开展嗜热微生物实验进化的重大障碍之一，是传统高温培养箱在设备维护和能源消耗方面的高昂成本。为应对这一挑战，本文提出了一套完整的在S. acidocaldarius中进行实验进化的实验方案，该方案采用低成本且节能的台式恒温混匀仪。该方案采用分批培养技术，使用相对较小的培养体积（1.5 mL），可同时追踪多个独立谱系的适应过程。通过增加恒温混匀仪的数量，该方法可轻松实现规模扩展。这种方法通过降低实验研究的初始投入和持续运行成本，显著提高了S. acidocaldarius作为模式系统的可及性。此外，该技术还可推广应用于其他微生物系统，用于研究其对多种环境条件的适应机制。
引言
地球上的早期生命可能起源于极端环境，例如热液喷口，这类环境具有极高的温度和酸性特征1。微生物至今仍栖息于各种极端环境中，包括温泉和火山硫磺喷气孔。阐明在这些极端条件下发生的进化动态，有助于揭示使生物得以在其中生存的特化生理过程。这可能带来广泛的影响，从深化我们对生物多样性起源的理解，到推动具有生物技术应用价值的耐高温酶的开发。
尽管微生物在极端环境中的进化动态研究具有重要意义，但目前对此的理解仍然有限。相比之下，通过应用一种称为实验进化的技术，人们已在中温环境进化方面积累了大量知识。实验进化包括在实验室条件下观察进化变化2,3,4,5，通常涉及对环境的明确定义性改变（例如温度、盐度、引入毒素或竞争生物）7,8,9。当与全基因组测序相结合时，实验进化使我们能够检验进化过程中的关键方面，包括平行性、可重复性以及适应的基因组基础。然而迄今为止，绝大多数实验进化研究均以中温微生物（包括细菌、真菌和病....
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方案
1. 准备S. acidocaldarius 生长培养基（BBM+）
注意：为了培养 S. acidocaldarius，本实验方案采用基础布罗克培养基（BBM+)23首先将下述无机母液混合，配制BBM。−，可预先配制。BBM+ 然后通过将有机物储备液加入BBM中，按需制备−。也列出了储备液的配制方案 表1所有培养基和储备溶液均应在双蒸水中配制2O (ddH₂O)2O
- 生长培养基用无机贮存液的制备
- 制备微量元素储备液。
- 通过加入9 g/L的十水合四硼酸钠（Na₂B₄O₇·10H₂O）、0.13 g/L的七水合硫酸锰（MnSO₄·7H₂O）、0.22 g/L的七水合硫酸锌（ZnSO₄·7H₂O）、0.08 g/L的二水合氯化铜（CuCl₂·2H₂O）、0.06 g/L的四水合氯化钴（CoCl₂·4H₂O）、0.06 g/L的六水合氯化铁（FeCl₃·6H₂O）以及0.01 g/L的钼酸钠（Na₂MoO₄·2H₂O），配制微量元素储备液。2B4O7
- 制备微量元素储备液。
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结果
生长曲线测定
S. acidocaldarius DSM639 的生长曲线如图3A所示。比较使用恒温混匀仪与传统培养箱进行培养时，发现其生长情况相似。通过将逻辑斯蒂曲线拟合至每条重复的生长曲线，并计算平均值和标准误，估算了平均生长速率参数。在恒温混匀仪和培养箱中达到对数中期的时间分别为 27.2 h ± 1.1 h 和 31.1 h ± 1.9 h。在 75 °C 条件下，恒温混匀仪和培养箱的初始倍增时间估计值分别为 4.29 h ± 0.28 h 和 4.19 h ± 0.44 h，与先前发表的数值一致24。log10(OD600nm) 与 log10(CFU) 之间的关系可通过线性模型良好描述（校正后 R2 = 0.82，F(1,22) = 104，p < 0.00001，斜率 = 1.73 ± 0.17，截距 = 9.73 ± 0.14）.......
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讨论
本研究建立了一种适用于嗜热微生物的实验进化方案，此处针对嗜酸热古菌S. acidocaldarius进行了优化，但也可根据需要调整用于其他需高温生长的微生物。该方案基于最初为中温细菌设计的技术，但经过专门改进，以克服高温好氧培养过程中存在的技术难题2,4,5,24。该方法的建立将有助于探索在极端温度条件下发生的、此前尚未被表征的进化动态，这类条件可能类似于生命进化最早阶段所存在的环境1。
为了从进化实验中获得可靠的结果，必须遵守该实验方案中的若干关键要点。首先是确保各进化谱系之间的独立性，这可通过在实验开始前划线分离至单菌落来实现。这是必要的，以确保在不同谱系中发现的相同突变具有独立的起源。相反，如果使用大量液体培养物分装来启动各个谱系，则可能将共同的遗传变异分配.......
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披露
作者声明不存在任何利益冲突。
致谢
作者感谢弗莱堡大学的 SV Albers 教授、布鲁塞尔自由大学的 Eveline Peeters 教授以及布鲁塞尔自由大学的 Rani Baes 博士提供的建议和帮助 S. acidocaldarius DSM639 菌株。本工作由英国皇家学会研究资助（授予 DRG：RGS\R1\231308）和英国研究与创新署-自然环境研究委员会（UKRI-NERC）资助。 "探索前沿" 研究资助（授予 DRG 和 CGK：NE/X012662/1）以及科威特大学博士奖学金（授予 ZA）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 μm 注射器驱动膜过滤器 | StarLab | E4780-1226 | 用于过滤不能高压灭菌的培养基组分。 |
| 1 μL 接种环 | Greiner | 731161、731165 或 731101 | 用于接种培养物。也可使用其他类型的接种环。 |
| 1000 μL 移液器吸头 | StarLab | S1111-6811 | 也可使用其他移液器吸头。 |
| 2 mL 微量离心管 | StarLab | S1620-2700 | 用于在恒温混匀仪中培养 S. acidocaldarius。 |
| 200 μL 移液器吸头 | StarLab | S1111-0816 | 也可使用其他移液器吸头。 |
| 50 mL 带锥形底的聚苯乙烯管 | Corning | 430828 或 430829 | 可使用其他类型的管。请在 75 °C 下检测其性能。带插塞盖的管可能无法提供足够的通气；使用前请先测试。 |
| 50 mL 注射器 | BD plastipak | 300865 | 用于配合注射器驱动过滤器使用。 |
| 96 孔微孔板（未处理，平底） | Nunc | 260860 | 用于在分光光度计中测定 600 nm 处的光密度（OD）。 |
| 可调间距多通道移液器 | Pipet-Lite | LA8-300XLS | 可选，但在微量离心管与 96 孔板之间转移液体时可节省时间。 |
| 硫酸铵 ((NH4)2SO4) | Millipore | 168355 | 用于配制 Brock 储液 I。 |
| 高压灭菌器 | Priorclave | B60-SMART 或 SV100-BASE | 也可使用其他类型的高压灭菌器。 |
| Breathe-EASY 气体可渗透密封膜 | Sigma-Aldrich | Z763624-100EA | 裁剪至合适尺寸后用于穿孔的微量离心管。若使用其他气体可渗透膜，需确保其在 75 °C 下性能良好 |
| 二水氯化钙 (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | 用于配制 Brock 储液 I。 |
| CELLSTAR 六孔板（悬浮/未处理） | Greiner | M9062 | 其他厂家的六孔板也可能适用。需检测其在高温下的性能。 |
| 七水硫酸钴(II) (CoSO4·7H2O) | Supelco | 1025560100 | 用于配制微量元素储备液。 |
| 二水氯化铜(II) (CuCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | 307483 | 用于配制微量元素储备液。 |
| 无水 D-(+)-葡萄糖 (C6H12O6) | Thermo Scientific Chemicals | 11462858 | 也可使用其他戊糖和己糖（例如 D-木糖、D-阿拉伯糖）。葡萄糖并非 S. acidocaldarius 的优选碳源（SV Albers，个人交流） |
| 双蒸水 (ddH2O) | |||
| 琼脂替代物 Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101.1000 | Gelrite（结冷胶）因具有更高的熔点，可替代琼脂用于制备固体培养基。 |
| 玻璃 100 mm 培养皿 | Brand | BR455742 | 使用玻璃培养皿是因为大多数标准的 90 mm 聚苯乙烯培养皿在 75 °C 下会变形（取决于品牌）。也可使用六孔板，因其在高温下不会变形。 |
| 培养箱 | New Brunswick | Innnova 42R | 也可使用其他类型的培养箱。购买或使用前请确认设备的工作温度，因为许多培养箱无法达到高于 65°C 的温度。 |
| 六水氯化铁(III) (FeCl3·6H2O) | Supelco | 103943 | 用于配制铁储备液 |
| 七水硫酸镁（Epsom 盐）(MgSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 230391 | 用于配制 Brock 储液 I。 |
| 四水氯化锰(II) (MnCl2·4H2O) | Sigma-Aldrich | SIALM5005-100G | 用于配制微量元素储备液。 |
| 迷你智能 Wi-Fi 插座，带能耗监测功能 | Tapo | Tapo P110 | 用于监测能耗 |
| N-Z-Amine A - 酪蛋白酶解水解物 | Sigma-Aldrich | C0626-500G | N-Z-Amine-A 用作氨基酸来源。 |
| 回形针（或其他坚固金属丝） | 无 | 无 | 用于穿刺 2 mL 微量离心管。 |
| 磷酸二氢钾（单磷酸钾）(KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | 用于配制 Brock 储液 I。 |
| Promega Wizard 基因组 DNA 纯化试剂盒 | Promega | A1120 | 可选，用于实验室提取基因组 DNA |
| 二水钼酸钠 (Na2MoO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | M1651-100G | 用于配制微量元素储备液。 |
| 十水四硼酸钠（硼砂）(Na2B4O7·10H2O) | Sigma-Aldrich | S9640 | 用于配制微量元素储备液。 |
| 分光光度计 | BMG | SPECTROstar OMEGA | 用于测定 600 nm 处的光密度（OD）。其他可读取 600 nm OD 值的分光光度计也可使用。 |
| 硫酸（按 1:1 比例用水稀释）(H2SO4) | Thermo Scientific Chemicals | 11337588 | 用于将 Brock 储液 II/III 的 pH 调整至最终 pH 2–3。 |
| 恒温混匀仪 | DLab | HM100-Pro | 也可使用其他类型的恒温混匀仪；关键是要能维持 65–75 °C 的温度和 400 RPM 的转速 |
| 尿嘧啶 (C4H4N2O2) | Sigma-Aldrich | U0750 | pyrE 基因的缺失是 S. acidocaldarius 中常见的遗传标记。缺失菌株必须补充尿嘧啶才能生长。对于 DSM639 野生型菌株，补充尿嘧啶并非严格必需，但此处仍包含此步骤，因为后续实验可能涉及缺失菌株。 |
| 二水硫酸钒氧 (VOSO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | 204862 | 用于配制微量元素储备液。 |
| 七水硫酸锌 (ZnSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 221376 | 用于配制微量元素储备液。 |
参考文献
- Nisbet, E. G., Sleep, N. H. The habitat and nature of early life. Nature. 409 (6823), 1083-1091 (2001).
- Buckling, A., Craig Maclean, R., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. The Beagle in a bottle. Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).
- Lenski, R. E.
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