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方法文章

用于人干细胞维持与肠道类器官生成的基底膜基质比较研究

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DOI：

10.3791/66277

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2024年3月15日

 ,  ,  , 
1Center for Pharmacometrics & Systems Pharmacology, Department of Pharmaceutics, University of Florida, 2TheWell Bioscience, Inc

本文内容

摘要

类器官已成为疾病建模的重要工具。在类器官生成过程中，细胞外基质（ECM） 可引导细胞命运，使用与天然组织相似的系统能够提高模型的准确性。本研究比较了人诱导多能干细胞来源的肠类器官在动物源性细胞外基质与无异源成分水凝胶中的生成情况。

摘要

细胞外基质（ECM）在细胞行为和发育过程中发挥着关键作用。由人诱导性多能干细胞（hiPSCs）生成的类器官目前受到多个研究领域的广泛关注。然而，传统细胞培养材料缺乏生理相关信号，限制了hiPSC的有效分化。将市售的细胞外基质引入干细胞培养体系，可为细胞维持提供有益的物理和化学信号。来源于动物的市售基底膜产品含有支持细胞维持的ECM蛋白和生长因子。由于ECM具有组织特异性，能够调控细胞命运，因此无异源成分（xeno-free）基质被用于促进向临床研究的转化。尽管市售基质已广泛应用于hiPSC和类器官研究，但这些基质之间的等效性尚未得到评估。本研究对四种不同基质——Matrigel（基质1-AB）、Geltrex（基质2-AB）、Cultrex（基质3-AB）和VitroGel（基质4-XF）——在hiPSC维持及人肠类器官（hIO）生成中的表现进行了比较。尽管细胞集落未呈现完美的圆形形态，但自发分化程度较低，超过85%的细胞表达干细胞标志物SSEA-4。使用基质4-XF可促进形成三维圆形细胞团。此外，提高用于制备基质4-XF水凝胶溶液的培养基中补充物和生长因子的浓度，可使hiPSC的SSEA-4表达水平提高1.3倍。在中/后肠阶段，基于基质2-AB维持的hiPSC分化过程中产生的球状体释放数量少于其他动物来源的基底膜组。与其他基质相比，无异源成分类器官基质（基质4-O3）可生成更大且更成熟的hIO，表明无异源水凝胶的物理特性可用于优化类器官的生成。综上所述，结果表明不同基质的组成差异会影响肠类器官分化的各个阶段。本研究强调了市售基质之间的差异，并为hiPSC和类器官研究中的基质优化提供了指导。

引言

细胞外基质（ECM）是组织中一种动态且具有多种功能的组分，在调控细胞行为和发育过程中发挥核心作用。作为一种复杂的网络结构，它可提供结构支持以及细胞黏附配体1以及储存调控细胞信号传导的生长因子和细胞因子。例如，在伤口愈合过程中，细胞外基质（ECM）可作为迁移细胞的支架，同时作为参与组织修复的生长因子的储存库2同样，细胞外基质（ECM）的失调可能导致多种疾病（如纤维化和癌症）的严重程度增加。3,4在胚胎发育过程中，细胞外基质（ECM）引导组织形态发生。例如，在心脏发育过程中，ECM组分在形成心脏组织的正确结构和功能中发挥重要作用。5十多年的研究所表明，仅微环境的硬度6,7 可以调控干细胞谱系特化。因此，在此期间 体外 细胞分化，细胞外基质通过提供分化信号影响干细胞命运。

类器官可以从诱导性多能干细胞（iPSCs）生成。成功生成类器官的前提是使用经过充分表征的iPSC细胞系。然而，传统细胞培养材料中缺乏生理相关的信号，阻碍了iPSC的有效分化和类器官的生成。此外，近期研究强调了细胞外基质（ECM）的组成、细胞与ECM之间的相互作用8，以及机械和几何信号9,10,11在类器官扩增与分化过程中的重要性12。通过引入组织特异性的物理和化学信号，有望提升类器官技术的可重复性，从而推动其发展。

类器官旨在生理相似的微环境中重现天然组织的特性。选择一种能紧密模拟天然组织细胞外基质（ECM）的系统，对于实现细胞行为、功能及对刺激反应的生理相关性至关重要13。ECM组分的选择可影响干细胞在类器官内向特定细胞类型的分化。不同的ECM蛋白及其组合可提供引导细胞命运的信号线索14。例如，已有研究表明，使用特定的ECM组分可促进肠干细胞向成熟肠细胞类型分化，从而获得具有生理相关性的肠类器官15。尽管类器官在疾病建模和药物筛选中是一种有价值的工具，但选择合适的ECM系统对该应用至关重要。合适的ECM系统可通过构建类似于病变组织的微环境，提高疾病建模的准确性16。此外，组织特异性的ECM有助于生成更真实地重现疾病相关表型和药物反应的类器官17。优化用于类器官分化的ECM系统，对于实现理想的分化结果至关重要。

来源于动物细胞外基质（ECM）的市售基底膜系统（例如 Matrigel、Cultrex）以及无异源成分的水凝胶（例如 VitroGel）在诱导多能干细胞（iPSC）和类器官研究中被广泛使用。多年来，相关产品开发商和使用者已针对其特定产品和应用发布了大量操作说明，其中许多说明为本实验方案的制定提供了指导。此外，这些材料因其内在特性所带来的优势与局限性也已被众多研究者分别记录18,19,20,21。然而，目前尚缺乏系统性的操作流程来指导研究者为iPSC和类器官工作选择最优的基质系统。本文提供了一种系统评估不同来源ECM系统在iPSC和类器官实验中等效性的操作流程。该研究比较了两种不同的人诱导多能干细胞系（hiPSC）的维持培养以及人肠类器官（hIO）在四种不同基质中的生成情况：Matrigel（基质1-AB）、Geltrex（基质2-AB）、Cultrex（基质3-AB）和VitroGel（基质4-XF）。在类器官培养中，使用了四种此前已针对类器官培养优化过的无异源成分基质VitroGel版本：ORGANOID 1（基质4-O1）、ORGANOID 2（基质4-O2）、ORGANOID 3（基质4-O3）、ORGANOID 4（基质4-O4）。同时，也使用了针对类器官优化的动物源性基质：高浓度Matrigel（基质1-ABO）和Cultrex Type 2（基质3-ABO）。实验中采用市售干细胞培养基（mTeSR Plus）和类器官分化试剂盒（STEMdiff intestinal organoid kit）。本实验方案结合了各产品制造商提供的操作说明与实验室实践经验，旨在指导读者针对其特定的iPSC和类器官研究实现ECM条件的成功优化。总体而言，本方案及代表性结果强调了为干细胞研究和类器官分化选择最佳微环境的重要性。

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方案

1. hiPSC 的维持

注意：所有操作均须在生物安全柜（BSC）中进行，并遵循标准的无菌技术。必须遵守美国职业安全与健康管理局（OSHA）对实验室的安全标准，包括正确使用个人防护装备，如实验服、手套和护目镜。

  1. 基质工作液分装与细胞培养基的制备
    1. 对于市售的动物源性基底膜（BMs；Matrix 1-AB、Matrix 2-AB、Matrix 3-AB），按照表1中总结的制造商建议，将工作体积分装成单次使用量，并在-20 °C或-80 °C长期保存。避免产生气泡。若出现气泡，在储存前于4 °C、<200 x g条件下离心约1-2分钟，使气泡上浮至表面。
      注意：制备单次使用分装可避免反复冻融破坏细胞外基质（ECM）结构。由于不同批次BM的浓度存在差异，务必遵循制造商建议进行单次分装及包被溶液的配制。高浓度BM黏稠，难以移液，应使用预先在-20 °C保存的预冷枪头。
    2. 根据制造商建议配制干细胞培养基。为配制本实验方案中使用的特定市售完全培养基，将100 mL的5x补充剂混合液加入400 mL基础培养基中，充分混匀后分装为40 mL每管，储存于20 °C。使用时，将每管完全培养基解冻后立即使用，或在2 - 8 °C保存不超过2周。切勿再次冷冻。
    3. 将干细胞完全培养基分装成含3x浓度补充剂的分装液，用于配制Matrix 4-XE水凝胶，即：将5x补充剂稀释至3x。
  2. 使用动物源性基底膜（Matrix 1-3AB）包被组织培养塑料表面
    1. 开始前准备如下：解冻和操作过程中始终将基质置于冰上，防止其发生凝胶化。使用预冷的培养基配制稀释基质。在开始前以及人诱导多能干细胞（hiPSC）分化过程和hIO类器官生成的每个阶段，为每种实验条件准备足够数量的重复孔。
      注意：本研究使用24孔板。其他孔板尺寸的推荐包被体积请参见表2。
    2. 为每种基质，在50 mL锥形管中准备25 mL含15 mM HEPES的预冷Advantage DMEM/F-12培养基，并保持在冰上。
    3. 将解冻后的基质加入各自对应的预冷Advantage DMEM/F-12中，充分混匀。混匀过程中保持培养基低温，并通过肉眼观察确认无团块，确保混合均匀。
    4. 立即使用稀释后的基质溶液对选定孔进行包被（若使用24孔板，则每孔250 µL）。
    5. 轻轻倾斜培养器皿，使包被液均匀覆盖表面。室温（15 - 25 °C）孵育至少1小时后使用。
      注意：若未立即使用，包被后的孔板可在2 - 8 °C保存最多1周，但必须用透明封膜密封以防止蒸发。使用储存的孔板时，需在下一步操作前于室温（15 - 25 °C）平衡30分钟。
    6. 使用移液管或抽吸法轻柔去除多余液体，确保不刮伤包被表面。
    7. 立即加入温热的完全干细胞培养基（为特定孔所需总体积的50%，例如使用24孔板时为每孔250 µL）。
  3. 使用Matrix 4-XE水凝胶包被组织培养塑料表面
    1. 开始前准备如下：将Matrix 4-XE水凝胶从冰箱中取出，使其升温至室温（25 °C）。为每种实验条件准备足够数量的重复孔，用于在hiPSC分化过程和hIO类器官生成的各个阶段进行细胞检测。
      注意：本研究使用24孔板。其他孔板尺寸的推荐包被体积请参见表3。
    2. 配制一种干细胞完全培养基，其生长因子浓度为标准干细胞培养基配方的3倍（即3x干细胞培养基）。
    3. 按2:1（v/v）比例混合Matrix 4-XE水凝胶与3x干细胞培养基，轻柔吹打5-10次以充分混匀。
    4. 将水凝胶混合物转移至孔板中，小心倾斜培养器皿使混合物均匀覆盖表面。若使用24孔板，每孔使用250 µL。推荐体积参见表3。
    5. 室温静置10-15分钟，以形成软凝胶。在水凝胶形成过程中，切勿倾斜或震荡孔板，以免干扰凝胶结构。
  4. hiPSC无酶团块传代与接种
    1. 开始前准备如下：传代前至少1小时，用基质包被所需器皿。分装足量的完全干细胞培养基并升温至室温（15 - 25 °C）。避免对完全培养基进行多次加热。
      注意：以下步骤描述了在6孔板上已建立且汇合度>90%的iPSC培养物的传代过程，并将其接种至24孔板以进行肠类器官分化。
    2. 用1 mL不含Ca++和Mg++的D-PBS冲洗细胞，吸除。加入1 mL无酶人多能干细胞选择试剂，轻柔旋转使液体均匀覆盖，1分钟内吸除。细胞集落仅需接触一层薄液膜即可。
    3. 37 °C孵育，直至集落外观变得松散，通常需要约3-8分钟。
      注意：最佳孵育时间可能因细胞系而异。首次使用无酶人多能干细胞选择试剂对每种细胞系进行传代时，必须确定其最佳孵育时间。
    4. 加入1 mL完全干细胞培养基。通过轻敲培养板侧壁使集落脱落，另一只手应稳握培养板。
    5. 使用1 mL或更大规格的移液器，将细胞团块悬液转移至15 mL锥形管中。在明场显微镜下评估团块大小，确保细胞团块直径在50-200 µm之间；若团块过大，可轻柔振荡锥形管使其分散。
    6. 在将用于团块计数的平底96孔板的每个孔底部绘制x-y网格，并向每孔加入50 µL D-PBS。建议取3个孔的计数结果取平均值。
    7. 轻柔振荡管子使细胞团块均匀分布，然后向平底96孔板的每孔加入5 µL团块悬液。
      注意：不建议使用自动细胞计数仪进行团块计数，推荐采用手动计数。
    8. 统计每孔中直径为50 - 200 µm的团块总数。若大多数细胞团块直径>200 µm（见图1），重复步骤1.4.5 - 1.4.7。
    9. 按下式计算接种6,000个团块所需的团块悬液体积（单位为µL）：
      团块悬液体积计算公式；数学方程；科学研究。
      注意：最佳接种密度需针对每种细胞系进行优化。建议初始接种时设置一系列团块密度（如每孔4,000、5,000和6,000个团块），接种后24-48小时检查是否达到85%-90%汇合度，以确定最佳密度。
    10. 作为质量控制，分离部分细胞用于流式细胞术检测干细胞标志物。常见标志物列表见表4。
    11. 将所需体积的iPSC团块悬液分别转移至不同的15 mL离心管中，用于接种于包被有不同细胞外基质（ECM）的孔中。
    12. 将含有iPSC团块悬液的离心管在200 x g条件下离心5分钟，以去除含无酶人多能干细胞选择试剂的培养基。离心期间，若尚未完成，向每孔加入相当于目标体积50%的培养基。
  5. 在含动物源性基质的孔板中培养iPSC
    1. 将iPSC团块轻柔重悬于计算体积50%的完全干细胞培养基中，以达到目标密度，并将细胞聚集体混合物接种至已包被且含有计算体积50%完全干细胞培养基的孔中。
      注意：对于某些细胞系或当团块直径≤50 µm时，可能需要添加ROCK-1抑制剂。建议添加浓度<10 µM，以避免过早发生原肠胚形成。
    2. 小心将含细胞的培养基加至基质上方，若使用24孔板则每孔250 µL。其他规格孔板的推荐培养基体积请参见表2。
    3. 轻柔地前后、左右短距离多次倾斜孔板，使细胞团块均匀分布。
      警告：聚集体分布不均会导致人iPSC自发分化增加。若团块悬液呈环形扩散，会导致团块在孔边缘聚集，中心区域密度降低。
    4. 将孔板置于37 °C培养箱中，每日或隔日更换完全干细胞培养基。换液时肉眼观察培养物生长情况，判断细胞是否需要传代或已准备进入分化阶段。若需跳过连续两天的换液，应加入单日所需培养基体积的2倍量。
  6. 在含Matrix 4-XE的孔板中培养iPSC
    1. 将iPSC团块轻柔重悬于计算总量的3x完全干细胞培养基中，以达到目标密度。
    2. 小心将含细胞的培养基加至水凝胶上方，若使用24孔板则每孔250 µL。其他规格孔板的推荐培养基体积请参见表3。
      警告：水凝胶会吸水膨胀，体积大于刚制备时。iPSC集落将部分嵌入孔底的水凝胶中，因此建议更换50%-80%的上层培养基，避免扰动水凝胶。
    3. 快速、短距离地前后、左右移动孔板数次，使细胞团块均匀分布。
    4. 将孔板置于37 °C、5% CO2、95%湿度的培养箱中。使用完全干细胞培养基进行换液，每日或隔日更换一次；若为隔日更换，应加入单日所需体积的2倍量。
    5. 肉眼观察培养物，追踪其生长情况，直至达到适合分化的阶段。

显微镜图像中iPSC的大小比较；比例尺200μm；细胞培养分析。
图1：最佳克隆块大小。 显示iPSC细胞系SCTi003A克隆块最佳大小示例的图像。比例尺 = 200 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. hiPSC 分化与肠道类器官生成

注意：所有操作均须在生物安全柜（BSC）中进行，并遵循标准的无菌技术。必须遵守实验室的 OSHA 安全标准，包括正确使用个人防护装备，如实验服、手套和护目镜。

  1. 开始前准备以下事项：准备各阶段所需的分化培养基分装 aliquot。解冻后立即使用，切勿重新冷冻。遵循 表5 有关24孔板各阶段培养基类型及所需体积的一般性指南。
    注意：每个细胞系在各分化阶段的最佳时间可能有所不同，建议检测各阶段细胞标志物的表达以提高分化效率。本研究未包含对iPSC培养物进行定期基因表达评估，因为我们使用的是经供应商验证的低代次批次细胞；但对于新建立或尚未验证的iPSC细胞系，在后续分化过程中，建议将其作为质量控制步骤。
  2. 第1阶段：定型内胚层（DE）
    1. 为评估是否具备启动分化的准备条件，请检查以下标准。
      1. 使用显微镜评估干细胞集落的融合度以及培养物中自发分化的程度。不应仅依赖形态学评估。最佳融合度应在85%–90%之间（约高于105 细胞/厘米²2），且应观察到最少的自发分化 <5% 分化
      2. 从一个用于牺牲的孔中收集细胞，用于流式细胞术检测hiPSC标志物，然后再进行下一步操作。代表性流式细胞术分析采用前向散射和侧向散射的设门策略。若细胞符合最佳标准，则开始诱导分化。细胞传代标准为 >理想情况下3种标志物的表达率达到85%表4），尤其是在实验室中使用新建立或尚未充分鉴定的iPSC细胞系时。
        注意：在不同基质上培养的iPSC经历的整体过程相同，但Matrix 4-XE上的iPSC生长需更轻柔地更换培养基，以避免扰动半嵌入的细胞。在定型内胚层诱导过程中预期会出现明显的细胞死亡，因为此阶段细胞特别敏感。更换培养基时应格外小心，尽量缩短细胞暴露在培养箱外的时间 37 °C 尽可能保持孵育环境的一致性。
    2. 按照下述方法开始细胞集落的分化。
      1. 第0天：将一份DE培养基预热至 37 °C为避免因反复升降温循环导致培养基变性，仅需将第0天所需的培养基体积（0.7 mL/孔）进行温育。
      2. 吸除hiPSCs的培养基。沿孔壁小心加入0.7 mL DE培养基至每孔。避免剧烈吹打，以防菌落脱落或受损。将培养板置于 37 °C 含5% CO2 和95%湿度下培养24小时。
      3. 第1天：将一份分化培养基（DE培养基）预热至仅用于第1天所需体积（每孔0.5 mL） 37 °C吸弃细胞中的 DE 培养基，沿孔壁小心加入 0.5 mL DE 培养基。于 37 °C 含5% CO2 和95%湿度下培养24小时。
      4. 第3天：细胞已准备好进行定型内胚层形成的检测。参考 表4 针对推荐的标记物，在进入下一阶段前，应牺牲一个培养孔，以进行与定型内胚层（DE）相关的特异性标记物的流式细胞术表征。代表性流式细胞术分析采用前向散射与侧向散射的设门策略。建议检测不止一种标记物的表达，特别是在实验室中使用新建立或尚未充分验证的诱导多能干细胞（iPSC）系时。
  3. 第二阶段：中肠/后肠（MH）
    1. 第3天：仅将第3天所需的MH培养基体积（每孔0.5 mL）加热至15 - 25 °C吸弃细胞中的 DE 培养基，加入 0.5 mL MH 培养基。于 37 °C 含5% CO2 和95%湿度下培养24小时。
    2. 第4至9天：每日换液前，使用显微镜在2倍或4倍放大倍数下观察类球体的形成情况，检查是否存在可见的三维结构（可能从第4天开始出现）以及是否形成游离的类球体（可能从第5天开始出现）。
    3. 一旦类球体开始脱落，使用1 mL移液器将细胞培养基轻轻转移至无菌15 mL锥形管中，以评估从细胞脱落的类球体数量。
      注意：避免任何可能导致3D结构从单层脱落的剪切力；一旦准备就绪，球状体将自行脱落。
    4. 如果脱落的类球体少于50个，以200 x g离心 g 孵育5分钟，弃去旧培养基，将类球体重悬于0.5 mL/孔的新培养基中，并转移至相应孔中，直至足够数量的类球体成熟。
      注意：类器官在中肠/后肠培养基中的暴露时间对于决定发育中小肠类器官的区域特性（如十二指肠（较短暴露时间）或回肠（较长暴露时间））具有关键作用。为获得具有相同区域特性的更均一的培养物，应尽量同时收集暴露于中肠/后肠培养基的类球体。
    5. 重复步骤 2.3.3，直至有足够数量的类球体脱落，用于包埋并启动人肠道类器官（hIO）培养。
    6. 在进入下一阶段之前，分离一部分类球体样本，并对与中肠/后肠（Midgut/Hindgut, MH）相关的特异性标志物进行流式细胞术表征。代表性流式细胞术分析采用了前向散射和侧向散射的设门策略。参考 表 4 有关常用标记物的列表，请参见相关资料。建议检测多个标记物的表达，特别是在实验室中针对新建立或尚未充分鉴定的iPSC细胞系。
  4. 第3阶段：类球体包埋
    1. 开始实验前，请准备好以下物品。
      1. 在冰上解冻Matrix 1-ABO和Matrix 3-ABO的分装样品。根据收集的类球体数量确定所需基质的总量，每30个类球体使用适量基质。40 µL 每个穹顶所需的基质用量。 
      2. 配制 25 mL 含 15 mM HEPES 的冷 Advanced DMEM/F-12。高浓度 ECM 黏稠，难以移液。放置一盒无菌 100 µL 移液器吸头置于 -20 °C 用于制备冷枪头以辅助操作流程。准备肠道类器官生长培养基（OGM）的分装 aliquot，每孔每次添加 0.5 mL，共需添加 4 次。参见 表5 用于制备。
      3. 在冰上解冻一份OGM添加剂。解冻后请立即使用，切勿重新冷冻。将完全配制好的OGM储存于2-8 °C 长达2周。
      4. 配制OGM培养基，其中所含补充剂浓度为标准配方的3倍（即3x OGM）。将Matrix 4-XFO1至Matrix 4-XFO4从冰箱中取出，置于室温下回温25 °C).
    2. 对于动物来源的系统，执行以下步骤。
      1. 将无菌的24孔细胞培养板放入培养箱中预热至 37 °C 在制备类球体和基质时，让收集的类球体沉降到15 mL锥形管底部。小心吸除并弃去上清液。
        注意：为了更准确地比较不同基质的影响，务必将在每种基质上分化的hiPSC所形成的类球体分别收集于不同的离心管中。
      2. 向类球体中加入1 mL含15 mM HEPES的DMEM/F-12培养基。以300 x g 5分钟，室温（15 - 25 °C).
      3. 小心地尽可能吸除上清液。建议先使用1 mL移液器开始移除，然后换用 100 µL 甚至 10 µL 使用移液器尽可能吸除上清液，避免扰动球状体沉淀。
        注意：残留的培养基体积越大，基质的稀释程度就越高。稀释后的基质可能导致凝胶化问题或形成较软的穹顶结构。较软的穹顶在受到轻微扰动时更容易发生塌陷。
      4. 使用带有冷端的移液器 100 µL 移液器吸头，添加 40 µL/50 个冷（2 - 8 °C将 Matrix 1-ABO 或 Matrix 3-ABO 加入相应的离心管中。用移液器轻轻吹打约 5 次，使类球体均匀分散到基质中。注意不要将移液器吸头完全排空，以免引入气泡。
      5. 从培养箱中取出培养板，使用预冷的移液枪头，按照以下步骤将包埋的类球体轻柔转移至培养板中央 图2避免将Matrix 1-ABO和Matrix 3-ABO过快加入培养皿中，以免压平穹顶结构.
      6. 小心地将培养板转移至 37 °C 孵育器中孵育30分钟，以确保穹顶凝胶化。在转移和孵育过程中，需特别注意避免任何晃动或剧烈移动。.
      7. 在孵育穹顶以使其凝胶化的同时，进行温育 37 °C 根据待使用孔的数量，加入足量的肠道类器官生长培养基（0.5 mL/孔）。
        注意：仅加热所需体积，避免反复冻融。在将培养基加入类器官前确保其已预热；冷的培养基可能导致类器官结构塌陷。
      8. 30分钟后，小心地将0.5 mL肠道类器官生长培养基（intestinal OGM）沿孔壁加入，避免扰动类器官结构。置于培养箱中孵育 37 °C 含5% CO2 并保持95%湿度。每3-4天进行一次完全换液，移除原有培养基后加入新鲜培养基。
    3. 对于Matrix 4-XF类器官系统，请遵循所述步骤操作。
      注意：Matrix 4-XF 类器官系统包含四种不同选项（O1–O4）；每种类型的生物功能配体、刚度和可降解性各不相同。因此，建议进行初步实验以确定特定应用的最佳类型。本方案描述了如何利用这四种选项筛选适用于人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的肠类器官的最佳配方。此外，尽管存在多种可选的培养方案（例如三维包埋、穹顶状包埋），本方案采用穹顶法，以便能够与使用动物源性基底膜系统时的常用方法进行直接比较。
      1. 向在 Matrix 4-XFO4 系统上生成的类球体中每孔加入 1 mL 含 16 mM HEPES 的冷进阶 DMEM/F-12 培养基。以 300 x g 5分钟，室温（15 - 25 °C).
        注意：为确定应用的最佳配方，务必在离心前将类球体分装至4个独立的离心管中。在动物源性基质上生成的类球体也可利用该系统进一步成熟为肠类器官。
      2. 使用1 mL移液器，移除上清液，注意不要扰动球状体。加入 50 µL 向类球体沉淀物（约100个类球体）中加入3倍体积的OGM。添加 100 µL 选定的Matrix 4-XFO的 50 µL 类球体悬浮液轻柔吹打混匀5至10次。保持Matrix 4-XFO与3x OGM以2:1的体积比混合，最终浓度为1x。
      3. 添加 40 µL 将水凝胶-球体混合物置于24孔组织培养板的中央。小心地将培养板转移至 37 °C 培养箱中孵育30分钟。
        注意：Matrix 4-XFO 不需要 37 °C 孵育以促进凝胶化；然而，建议将类器官置于与Matrix 1-ABO和Matrix 3-ABO体系相似的条件下培养，因为这些体系需要 37 °C 以促进穹顶结构更好地凝胶化。
      4. 30分钟后，小心地将0.5 mL肠道OGM沿孔壁缓慢加入，避免扰动类器官结构。置于培养箱中孵育 37 °C 含5% CO2 并保持95%湿度。每3-4天更换一次完全培养基，方法是移除原有培养基，然后加入新鲜培养基。
  5. hIO传代与成熟
    1. 按照步骤2.4.1中的方法配制相同的化学药品、溶液和试剂。
    2. 向一个15 mL锥形管（每种条件1个）中加入1–2 mL抗黏附冲洗液，轻轻旋转以润洗管壁。
    3. 去除防粘附溶液，用 5 mL D-PBS（不含 Ca++ 和 Mg++）冲洗管壁。盖紧所有包被管，于室温（15 - 25 °C直至需要时。
    4. 吸除半球状结构中的培养基。使用1 mL移液器，直接向半球状结构中加入1 mL冰冷的DMEM/F-12。目的是使半球状结构从培养板上脱离。
    5. 向孔中再加入 1 mL 冷的 DMEM/F-12，反复吹打以收集残留的类器官。转移至包被的 15 mL 圆锥形管中。
      注意：通过显微镜下观察孔内情况，确认类器官是否成功收获。若观察到残留的类器官，需重复步骤 2.5.5。
    6. 使用1 mL移液器，对悬液进行上下吹打，以解离类器官，直至获得具有理想类器官大小的均匀碎片悬液（例如，100 - 500 µm).
      注意：使用一个 200 µL 使用移液器确认类器官符合推荐尺寸。采用 200 µL 移液器可根据需要促进进一步的片段化，确保片段能够顺利通过 200 µL 移液器吸头
      注意：避免通过剧烈或长时间吹打将组织碎片分散为单个细胞。
    7. 通过计数类器官片段或使用分割比例来确定所需的类器官密度。取一份等分样品，采用与步骤1.4.6–1.4.9相同的程序进行团块计数。
      注意：最佳类器官密度需针对每种细胞系进行优化；通常建议每个凝胶滴中接种40 - 80个肠类器官。
    8. 在类器官计数过程中，确保将试管置于冰上。大约5分钟后，类器官片段会因重力作用沉降至试管底部。
      注意：类器官溶液的体积越大，沉降到底部所需的时间越长。
    9. 轻柔地去除大部分上清液以及类器官顶部形成的浑浊层。在早期传代阶段，当类器官正在成熟时，该浑浊层包含基质和单个细胞。
    10. 加入2 mL冷的DMEM/F-12，直接用移液器加至沉淀上。以200 x g 5分钟，室温（15 - 25 °C).
    11. 对于动物来源的体系，按照步骤 2.4.2.4–2.4.2.9 中所述的相同步骤，小心移除并弃去上清液。
    12. 对于 Matrix 4-XFO 系统，按照步骤 2.4.3.2–2.4.3.4 中所述的相同操作，小心移除并弃去上清液。
      注意：使用 Matrix 4-XFO 系统时，建议采用无异源性成分的水凝胶类器官回收溶液，以实现水凝胶残留物的最佳去除。当从动物源性水凝胶系统转换至无异源性成分水凝胶系统时，尤其推荐使用该回收溶液，以确保彻底清除任何异源性物质。

在孔板中分配液体的移液技术示意图；移液器使用步骤。
图 2．推荐用于形成穹顶结构的技术示意图。 该示意图描述了在所有系统中成功形成穹顶结构所推荐的逐步操作流程。请点击此处查看此图的放大版本。

3. IO 尺寸表征

注意：类器官的大小通过4倍和10倍明场图像进行表征。图像处理分析采用MATLAB自动完成。下文描述了该过程的整体步骤，并在补充文件1中提供了代码示例。

  1. 定义包含图像的目录，并列出该目录中的所有图像文件。初始化用于存储结果的表格。读取文件中的明场图像。
  2. 定义像素为 µm 转换并设置比例尺。如果图像中没有比例尺，请向用户询问像素与实际尺寸的换算关系µm 转换系数
  3. 将图像转换为灰度图像。应用高斯滤波器以减少图像中的噪声。对滤波后的图像进行阈值分割，以分离类器官与背景。
  4. 填充小孔洞并移除小物体以清理二值图像。进行连通区域分析以识别单个类器官，并计算其属性，如面积、质心、主轴长度和次轴长度。
  5. 根据长轴和短轴长度计算类器官大小。在原始图像上显示已分割的类器官，并标注其大小。输出类器官大小并将结果保存至 .csv 文件。
    注意：最初几张图像通过手动分析，以确定高斯滤波器标准差和阈值面积的最优参数。代码在 补充文件 1 提供了从明场图像进行类器官大小分析的基本框架示例；然而，还需进一步优化以适应不同类型和质量图像的具体需求。该过程也可使用开源软件（如 ImageJ 中的 FIJI）完成。
  6. 按照以下步骤使用 FIJI 软件。
    1. 定义像素至 µm 转换并设置比例尺。如果图像中不包含比例尺，请向用户询问像素与实际单位之间的换算关系。µm 通过点击转换系数 分析 > 设定比例尺.
    2. 单击将图像转换为灰度图像 图像 > 类型 > 8bit应用高斯滤波器以减少图像噪声，方法是单击 过程 > 过滤 > 高斯模糊 > 使用的 Sigma（半径）：2.
    3. 对滤波后的图像进行阈值处理，以通过点击将类器官与背景分离 图像 > 阈值 > 最大熵 > 应用.
    4. 通过点击填充小孔洞并移除小物体，以清理二值图像 过程 > 噪声 > 去除异常值 > 20 像素.
    5. 执行连通域分析以识别单个类器官，并通过点击计算其属性，如面积、质心、长轴长度和短轴长度 分析 > 设置测量 > 确保包含面积、周长和直径 > 分析 > 分析颗粒 > 显示大纲.
  7. 统计分析
    1. 通过 JMP (SAS) 软件使用 Shapiro-Wilk 检验评估数据分布的正态性。为检验组间统计学差异，采用双因素方差分析（two-way ANOVA），并在 JMP (SAS) 软件中使用非参数 Wilcoxon 方法进行事后检验。显著性水平设定为 α = p ≤ 0.05。

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结果

根据本方案，成功利用市售的基底膜和一种无异源成分的水凝胶系统培养了人诱导多能干细胞（hiPSC），并将其分化为人肠道类器官（hIO）。这些实验的主要目标是系统评估不同来源基质在hiPSC和hIO研究中的等效性。本方案的第一部分重点介绍了健康iPSC培养物的维持与鉴定，以实现高效的肠道类器官生成。文中描述并比较了使用动物来源基质Matrix 1-AB、Matrix 2-AB和Matrix 3-AB包被培养器皿的方法，以及与无异源成分的水凝胶系统Matrix 4-XF的对比。

如图3A所示，来源于CD34+细胞的hiPSC系BXS 0116在三种动物源性基质上培养时表现出相似的形态。然而，将BXS 0116细胞系与来源于PBMC的SCTi003-A细胞系在Matrix 1-AB包被孔板上的培养情况进行比较，可发现不同细胞系之间的内在差异（见表6）可能导致细胞增殖、分化及形态方面的差异。例如，SCTi003-A细胞系生成定型内胚层（DE）需要3天，而BXS0116细胞系则需要5天。此外，如

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讨论

选择干细胞和类器官研究的最佳微环境是在广泛应用这些平台时至关重要的初始步骤。我们的代表性结果表明，Matrix 4-XFO3 与较高浓度的生长因子联合使用可产生更大的类器官，提示可利用无异源成分水凝胶的物理特性，通过这些系统优化类器官的生成。已有研究证实，细胞外基质（ECM）的独特特性与类器官内细胞的身份密切相关12由于细胞通过整合素及其他受体感知外部力学信号，细胞外基质（ECM）的力学特性对干细胞具有深远影响，而干细胞亦可相应地产生内部力学作用12干细胞与其微环境之间的相互作用在启动多种信号通路中起关键作用12此外，已有研究表明，细胞外基质（ECM）可作为储存和释放生长因子及其他影响细胞行为的信号分子的储库。因此，我们的代表性结果及数十年的研究均强调，在选择基质系统时，必须考虑天然细胞微环境及组织特性的生化与物理因素。 体外 研究29,30.

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披露

John Huang 博士是 TheWell Bioscience 的创始人兼首席执行官。

致谢

作者感谢Christina Pacak博士、Silveli Susuki-Hatano博士和Russell D'Souza博士在启动hiPSC和类器官研究方面提供的前期培训和一般性建议。他们感谢Chelsey Simmons博士在使用水凝胶系统方面的指导 体外 细胞培养工作。此外，作者感谢STEMCELL Technologies公司的Christine Rodriguez博士和Thomas Allison博士在hiPSC培养方面的指导。作者还感谢TheWell Bioscience公司承担了出版费用。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
24孔板（经培养处理，无菌）Falcon353504
37 °C 水浴VWR
96孔板 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）FB012931
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634
抗黏附冲洗液STEMCELL Technologies7010
生物安全柜（BSC）Labconco Logic
明场显微镜Echo RebelREB-01-E2
BXS0116ATCCACS-1030
带温度控制的离心机（可维持4 °C）ThermoScientific75002441
锥形管，15 mL，无菌Thermo Fisher Scientific339650
锥形管，50 mL，无菌Thermo Fisher Scientific339652
Cultrex RGF BME，2型Bio-techne3533-005-02
Cultrex 干细胞认证 RGF BME Bio-techne3434-010-02
D-PBS（不含 Ca++ 和 Mg++）Thermo Fisher Scientific14190144
Geltrex LDEV-Free，hESC认证，生长因子减量Gibco A14133-02
GlutaMAX 添加剂Thermo Fischer Scientific35050-061
Guava Muse 细胞分析仪或其他流式细胞仪设备（可选）Luminex0500-3115
HEPES 缓冲液Thermo Fischer Scientific15630-056
Heralcell Vios 细胞培养孵育箱（37 °C，5% CO2）Thermo Scientific 51033775
JMP 软件SAS InstituteJMP 16
MATLABMathWorks, IncR2022b
Matrigel 生长因子减量（GFR）基底膜基质，LDEV-freeCorning 356231
Matrigel 高浓度（HC）基质，生长因子减量（GFR），LDEV-freeCorning 354263
mTeSR Plus 培养基STEMCELL Technologies100-0276
Nunclon Delta 表面处理 24孔板Thermo Scientific144530
PE 小鼠抗人 CD326（EpCAM）BD Pharmingen566841
PE 小鼠抗人 CDX2 BD Pharmingen563428
PE 小鼠抗人 FOXA2BD Pharmingen561589
PerCP-Cy 5.5 小鼠抗人 SSEA4 BD Pharmingen561565
ReLeSRSTEMCELL5872
SCTi003-ASTEMCELL Technologies200-0510
血清移液管（10 mL） 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）13-678-11E
血清移液管（5 mL） 赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）13-678-11D
STEMdiff 肠类器官生长培养基STEMCELL Technologies5145
STEMdiff 肠类器官试剂盒STEMCELL Technologies5140
Vitrogel 水凝胶基质TheWell BioscienceVHM01
VitroGel ORGANOID 发现试剂盒TheWell BioscienceVHM04-K

参考文献

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