我们描述了一种研究非洲锥虫血液形态中糖酵体的pH值如何响应环境刺激的方法。该方法结合了一种对pH敏感的可遗传蛋白传感器和流式细胞术，可用于测量pH动态变化，既可进行时间过程检测，也可用于高通量筛选。
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摘要
摘要
葡萄糖代谢对非洲锥虫Trypanosoma brucei至关重要，既是其必需的代谢过程，也是寄生虫发育的调控机制。当环境中的葡萄糖水平发生变化时，细胞所产生的应答反应目前仍知之甚少。在血液型和前循环型（昆虫阶段）的寄生虫中，糖酵解的大部分过程发生在糖酵体中。这些细胞器在葡萄糖缺乏时会迅速酸化，这可能导致己糖激酶等糖酵解酶的变构调节。在以往的研究中，用于pH值测量的化学探针的定位存在困难，限制了其在其他应用中的实用性。
本文描述了表达定位于糖酵解体的pHluorin2（一种可遗传的蛋白质pH生物传感器）的寄生虫的构建与应用。pHluorin2是一种比率型pHluorin变体，在395 nm处的激发光强度随pH（酸性）降低而减弱，同时在475 nm处的激发光强度相应增强。通过将pHluorin2的开放阅读框克隆至锥虫表达载体pLEW100v5中，构建了转基因寄生虫，从而可在其生活周期的任一阶段诱导该蛋白的表达。采用免疫荧光技术验证pHluorin2生物传感器在糖酵解体中的定位，将其定位与糖酵解体固有蛋白醛缩酶的定位进行比较。为校准该传感器的响应特性，将细胞分别孵育于pH值从4到8的一系列缓冲液中（此前我们曾用此方法校准基于荧光素的pH传感器），在不同pH条件下进行标定。随后，利用流式细胞术在405 nm和488 nm处检测pHluorin2的荧光信号，以测定糖酵解体内的pH值。我们验证了活体转基因pHluorin2表达寄生虫的性能，监测了无葡萄糖条件下随时间变化的pH响应情况——这是已知可引发PF期寄生虫糖酵解体酸化的刺激因素。该工具具有多种潜在应用价值，包括可能用于高通量药物筛选。除糖酵解体pH外，该传感器还可被改造用于其他细胞器，或应用于其他动质体科原虫，以研究活细胞环境中的pH动态变化 。
引言
与大多数生物一样，寄生性动基体类原生生物依赖葡萄糖作为中心碳代谢的基本组成部分。该类群包括具有重要医学意义的生物，例如非洲锥虫Trypanosoma brucei；美洲锥虫T. cruzi；以及利什曼原虫属（Leishmania）的寄生虫。在寄生虫致病生命周期阶段，葡萄糖代谢对其生长至关重要。例如，当缺乏葡萄糖时，非洲锥虫的血液形态（BSF）会迅速死亡。值得注意的是，在感染的这一阶段，糖酵解是ATP的唯一来源1。利什曼原虫 寄生虫在人体宿主中同样依赖葡萄糖，其寄生于宿主巨噬细胞内的无鞭毛体生命周期阶段需要这种碳源以支持生长2。
尽管这些寄生虫具有涉及不同昆虫媒介的截然不同的生活方式，但它们在对葡萄糖的响应和摄取方面存在许多共同之处。例如，这些寄生虫将大多数糖酵解酶定位于一种称为糖酵体的修饰过氧化物酶体中。这种动质体特异性的细胞器在保守的生物合成机制和形态学上与哺乳动物的过氧化物酶体相关3,4,5,6。
大多数糖....
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方案
使用T. brucei brucei 90-13 BSF 锥虫（一种单型态寄生虫品系）时，需注意安全问题，因为它们属于2级风险生物，应在生物安全二级设施中操作。
1. 锥虫培养与转染
- 在 HMI-9 培养基中培养 T. brucei brucei 90-13 血清型表型锥虫，培养基中添加 10% 热灭活 FBS 和 10% Nu-Serum，在 37 °C、5% CO2 条件下培养10。
注意：为保持培养物健康，需将细胞密度维持在 2 × 104 至 5 × 106 个细胞/mL 之间。 - 将 pHluorin2-PTS1 克隆至 pLEW100v5 载体
- 商业合成 pHluorin2 的开放阅读框，获得带有 3' 端延伸序列的基因，该延伸序列编码两个甘氨酸组成的连接子，后接三肽 AKL（一种 PTS1 定位标签）。
- 通过限制性酶切将该构建体克隆至可诱导的锥虫表达载体 pLEW100v5 中。使用 HindIII 和 BamHI 双酶切含有 pHluorin2-PTS1 的克隆载体和 pLEW100v511。建议通过琼脂糖凝胶纯化进行纯化步骤，以去除....
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结果
pHLuorin2-PTS1 在布氏锥虫（T. brucei）血液形态中的糖酵解体定位
为评估 pHluorin2-PTS1 的亚细胞定位，对寄生虫进行了免疫荧光检测。转基因表达信号与针对糖酵解体驻留蛋白醛缩酶（TbAldolase）的抗血清信号共定位（图 2A）。抗 TbAldolase 抗体与 pHluorin2-PTS1 之间的平均 Pearson 相关系数为 0.895，表明 pHluorin2-PTS1 主要定位于糖酵解体。在确认 pHluorin2-PTS1 定位于糖酵解体后，我们进一步研究了 BF 阶段糖酵解体的 pH 值。
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讨论
非洲锥虫对环境的感知与响应机制目前尚不明确。已知营养物质可用性的变化会触发该寄生虫产生多种响应，包括糖酵解体的酸化。本文中，我们描述了一种利用可遗传的蛋白质传感器pHluorin2结合流式细胞术，在活细胞中研究糖酵解体pH值对环境扰动响应的方法。
使用该传感器时有几个关键步骤。首先，对表达外源基因的转染寄生虫进行表征非常重要，因为不同细胞间的表达可能存在差异。某些外源基因的表达水平可能随时间推移而下降。尽管迄今为止尚未在携带pHluorin2的细胞中观察到这一现象，但如果传感器的响应性变得高度不稳定（例如，诱导后传感器信号较弱），则可能需要对培养物进行克隆筛选，因为群体中部分细胞可能比其他细胞表达更高水平的蛋白。或者，重新转染并进行筛选已被证明是生成具有更高（尽管可能是短暂的）表达水平新细胞系的有效方法。如果需要重新转染，我们建议对单个细胞系进行克隆分离，因为目标外源基因的表达可能会带来轻微的生长劣势，导致高表达细胞在培养过程中逐渐丢失。
此外，在检测过程中以及常规培养期间，监测寄生虫的存活能力至关重要。我们在检测中加入了PI.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
pHluorin2-PTS1 由 Twist Bioscience 公司克隆至 pLEW100v5 载体中，该公司提供了该构建体的高拷贝克隆载体；pLEW100v5 载体由乔治·克罗斯博士（Dr. George Cross）惠赠。抗 T. brucei 醛缩酶的抗血清可应要求从克莱姆森大学梅雷迪思·T·莫里斯博士（Dr. Meredith T. Morris）处获得。JCM 和 KAC 实验室的工作部分得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，项目编号 R01AI156382）的资助。SSP 得到了 NIH 3R01AI156382 项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 50 mL 组织培养瓶（未处理，无菌） | VWR | 10861-572 | |
| 75 cm2 组织培养瓶（未处理，无菌） | 康宁 | 431464U | |
| 80 µL型平底384孔板 | BrandTech | 781620 | |
| Amaxa Human T Cell Nucleofector 试剂盒 | Lonza | VPA-1002 | |
| Attune NxT 流式细胞仪 | 赛默飞世尔科技旗下Invitrogen品牌 | A24858 | FlowJo 软件 |
| BRANDplates 96孔平底板 | 默克密理博 | BR781662 | |
| ImageJ 的 Coloc 2 插件 | https://imagej.net/plugins/coloc-2 | ||
| CytKick Max 自动采样器 | 赛默飞世尔科技旗下 Invitrogen 公司 | A42973 | |
| CytoFLEX 流式细胞仪 | Beckman-Coulter | ||
| Electron Microscopy Sciences 16% 甲醛水溶液，电镜级，10 mL 安瓿 | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| GraphPad Prism | 统计软件 | ||
| 尼日尔菌素（钠盐） | Cayman Chemical | 11437 | |
| Nucleofector 2b | Lonza | 已停产产品 | |
| OP2 液体处理仪 | opentrons | OP2 | |
| 聚-L-赖氨酸，0.1%（w/v）溶于 H2O | Sigma生命科学 | CAS:25988-63-0 | 用于高通量筛选实验的移液机器人 |
| 噻唑红（TO-PRO-3） | Biotium | #40087 | 我们加工了一个定制的丙烯酸培养板支架，以便该品牌的培养板可在我们的 CytKick Max 自动进样器上被检测和使用 |
| 缬氨霉素 | Cayman Chemical | 10009152 | 用于高通量筛选实验的移液机器人 |
| 用于pH校准 | |||
| 用于pH校准 |
参考文献
- Coley, A. F., Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. Glycolysis in the African trypanosome: Targeting enzymes and their subcellular compartments for therapeutic development. Molecular Biology International. 2011, 123702(2011).
- Mcconville, M. J., Saunders, E. C., Kloehn, J., Dagley, M. J.
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重印与许可
