我们描述了一种研究非洲锥虫血液形态中糖酵体的pH值如何响应环境刺激的方法。该方法结合了一种对pH敏感的可遗传蛋白传感器和流式细胞术，可用于测量pH动态变化，既可进行时间过程检测，也可用于高通量筛选。
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摘要
摘要
葡萄糖代谢对非洲锥虫Trypanosoma brucei至关重要，既是其必需的代谢过程，也是寄生虫发育的调控机制。当环境中的葡萄糖水平发生变化时，细胞所产生的应答反应目前仍知之甚少。在血液型和前循环型（昆虫阶段）的寄生虫中，糖酵解的大部分过程发生在糖酵体中。这些细胞器在葡萄糖缺乏时会迅速酸化，这可能导致己糖激酶等糖酵解酶的变构调节。在以往的研究中，用于pH值测量的化学探针的定位存在困难，限制了其在其他应用中的实用性。
本文描述了表达定位于糖酵解体的pHluorin2（一种可遗传的蛋白质pH生物传感器）的寄生虫的构建与应用。pHluorin2是一种比率型pHluorin变体，在395 nm处的激发光强度随pH（酸性）降低而减弱，同时在475 nm处的激发光强度相应增强。通过将pHluorin2的开放阅读框克隆至锥虫表达载体pLEW100v5中，构建了转基因寄生虫，从而可在其生活周期的任一阶段诱导该蛋白的表达。采用免疫荧光技术验证pHluorin2生物传感器在糖酵解体中的定位，将其定位与糖酵解体固有蛋白醛缩酶的定位进行比较。为校准该传感器的响应特性，将细胞分别孵育于pH值从4到8的一系列缓冲液中（此前我们曾用此方法校准基于荧光素的pH传感器），在不同pH条件下进行标定。随后，利用流式细胞术在405 nm和488 nm处检测pHluorin2的荧光信号，以测定糖酵解体内的pH值。我们验证了活体转基因pHluorin2表达寄生虫的性能，监测了无葡萄糖条件下随时间变化的pH响应情况——这是已知可引发PF期寄生虫糖酵解体酸化的刺激因素。该工具具有多种潜在应用价值，包括可能用于高通量药物筛选。除糖酵解体pH外，该传感器还可被改造用于其他细胞器，或应用于其他动质体科原虫，以研究活细胞环境中的pH动态变化 。
引言
与大多数生物一样，寄生性动基体类原生生物依赖葡萄糖作为中心碳代谢的基本组成部分。该类群包括具有重要医学意义的生物，例如非洲锥虫Trypanosoma brucei；美洲锥虫T. cruzi；以及利什曼原虫属（Leishmania）的寄生虫。在寄生虫致病生命周期阶段，葡萄糖代谢对其生长至关重要。例如，当缺乏葡萄糖时，非洲锥虫的血液形态（BSF）会迅速死亡。值得注意的是，在感染的这一阶段，糖酵解是ATP的唯一来源1。利什曼原虫 寄生虫在人体宿主中同样依赖葡萄糖，其寄生于宿主巨噬细胞内的无鞭毛体生命周期阶段需要这种碳源以支持生长2。
尽管这些寄生虫具有涉及不同昆虫媒介的截然不同的生活方式，但它们在对葡萄糖的响应和摄取方面存在许多共同之处。例如，这些寄生虫将大多数糖酵解酶定位于一种称为糖酵体的修饰过氧化物酶体中。这种动质体特异性的细胞器在保守的生物合成机制和形态学上与哺乳动物的过氧化物酶体相关3,4,5,6。
大多数糖酵解途径酶被区室化于糖酵体中，这为寄生虫提供了特异性的代谢通路调控机制。我们利用一种化学pH探针发现，营养剥夺会触发克氏锥虫前循环型（procyclic form, PF）糖酵体的快速酸化，从而通过暴露关键糖酵解酶己糖激酶上的别构调节剂结合位点，改变其酶活性7,8。在我们之前的研究中，该化学探针需要持续给药才能发挥作用，限制了其在其他应用场景中的使用。此外，在血液型（BSF）阶段维持探针在糖酵体内的分布存在技术困难，因而限制了该方法在该生活周期阶段研究糖酵体pH的应用价值。
在本研究中，我们使用荧光蛋白生物传感器pHluorin2来监测布氏锥虫（T. brucei）血液形态（BSF）中糖酵解体pH值在环境刺激（包括葡萄糖饥饿）下的变化9（图1）。本研究结果表明，BSF T. brucei在饥饿条件下会迅速且可逆地酸化糖酵解体，这一反应与我们在前鞭毛体（PF）寄生虫中观察到的反应相似。我们预计该生物传感器将有助于加深对T. brucei及相关寄生虫中糖酵解调控机制的理解。
方案
使用T. brucei brucei 90-13 BSF 锥虫（一种单型态寄生虫品系）时，需注意安全问题，因为它们属于2级风险生物，应在生物安全二级设施中操作。
1. 锥虫培养与转染
- 在 HMI-9 培养基中培养 T. brucei brucei 90-13 血清型表型锥虫，培养基中添加 10% 热灭活 FBS 和 10% Nu-Serum，在 37 °C、5% CO2 条件下培养10。
注意：为保持培养物健康，需将细胞密度维持在 2 × 104 至 5 × 106 个细胞/mL 之间。 - 将 pHluorin2-PTS1 克隆至 pLEW100v5 载体
- 商业合成 pHluorin2 的开放阅读框，获得带有 3' 端延伸序列的基因，该延伸序列编码两个甘氨酸组成的连接子，后接三肽 AKL（一种 PTS1 定位标签）。
- 通过限制性酶切将该构建体克隆至可诱导的锥虫表达载体 pLEW100v5 中。使用 HindIII 和 BamHI 双酶切含有 pHluorin2-PTS1 的克隆载体和 pLEW100v511。建议通过琼脂糖凝胶纯化进行纯化步骤，以去除限制性内切酶、不需要的克隆载体骨架以及被切除的含荧光素酶基因的片段。
- 使用 T4 DNA 连接酶将携带 pHluorin2 的插入片段连接至经酶切的 pLEW100v5 中12。（参见 补充图 S1 中的克隆示意图）。
- 通过下一代全质粒测序对质粒进行测序，以确认插入片段与载体正确连接，并确保在克隆过程中 pHluorin2-PTS1 基因内未引入任何突变。
注意：完整的质粒序列已提交至 Addgene.org，并被分配编号 #83680。 - 用 40 单位的 NotI 酶切 20 µg 质粒以线性化；随后使用指定的人 T 细胞试剂盒（见 材料表）通过核转染法将其转染至 90-13 血清型表型寄生虫中。按照 Burkard 等人13 描述的方法筛选稳定整合子。
2. pHlourin2-PTS1 的免疫荧光共定位
- 将显微镜载玻片用含0.1% (w/v) 聚-L-赖氨酸的H2O溶液处理10分钟以进行准备。去除聚-L-赖氨酸溶液后，用PBS洗涤载玻片一次。
- 为诱导pHluorin2-PTS1表达，在收获前24小时，用四环素或强力霉素（1 µg/mL）处理浓度为2 × 105 cells/mL的细胞。通过离心（室温[RT]，10分钟，1,000 × g）收集2 × 106个亲本株和诱导表达pLEWpHluorin2-PTS1（pHL）的寄生虫，沉淀后用PBS洗涤一次。
- 将细胞重悬于200 µL新配制的含2%多聚甲醛的PBS中（由市售16%电镜级溶液配制）。将含固定液的细胞加至载玻片上，静置30分钟使细胞沉降。用洗涤液（含0.1%正常山羊血清的PBS）洗涤贴壁细胞两次。
- 向细胞加入透化溶液（含0.5% Triton X-100的PBS），准确孵育30分钟。去除透化溶液后，用大量洗涤液洗涤一次。
- 加入封闭液（含10%正常山羊血清和0.1% Triton X-100的PBS），孵育30分钟。
- 将针对T. brucei醛缩酶制备的抗血清用封闭液按1:500稀释后加至细胞上14。室温孵育1小时。用洗涤液对载玻片进行5次洗涤，每次3–5分钟。
- 将Alexa Fluor 568标记的山羊抗兔IgG抗体用封闭液按1:1,000稀释后加至细胞上。室温孵育1小时。用洗涤液对载玻片进行5次洗涤，每次3–5分钟。
- 加入封片剂，并将盖玻片封固于载玻片上。
- 使用100倍物镜（NA 1.4–0.7）对细胞成像，并使用ImageJ软件分析图像。利用ImageJ的“Coloc 2”插件进行Pearson共定位分析。代表性细胞图像参见补充图S2。)
- 完成此操作时，将图像文件导入Fiji，选择图像。
- 调节各通道的亮度和对比度，直至背景不可见。
- 将图像从16位转换为8位，合并图像，然后裁剪为单个细胞并分离各通道。
- 在分析与共定位菜单下，选择Coloc2插件。将醛缩酶（红色通道）设为通道1，将pHL（绿色通道）设为通道2，点击确定以启动Pearson相关性计算。
3. 流式细胞术样品制备
- 使用四环素或强力霉素（1 µg/mL）在过夜培养中诱导 pHL 细胞。
- 通过离心收集细胞（室温，10 分钟，1,000 × g），获得约 4 × 107 个 pHL 细胞和约 1 × 106 个亲本细胞。弃去上清液，根据样本是否需要饥饿处理，用 1 mL 含或不含 10 mM 葡萄糖的 PBS 重悬细胞。对于时间进程实验，使用添加了 10 mM 葡萄糖的 PBS 重悬细胞，以防止在洗涤完成前细胞进入饥饿状态；对于高通量筛选（HTS）实验，则使用不含葡萄糖的 PBS 重悬细胞，以最大限度减少葡萄糖残留，并额外重复洗涤两次。
- 进行第四次离心，弃去上清液，然后根据实验处理条件，将细胞沉淀重悬于 PBS、含 5 mM 葡萄糖的 PBS 或含 10 mM 葡萄糖的 PBS 中。向样本中加入 1 µg/mL 碘化丙啶（PI）或 100 nM 噻唑橙（TR），用于活/死细胞鉴定。将每个样本转移至适用于流式细胞仪的 5 mL 管中。
4. 流式细胞术
注意：请在配备以下激光器的流式细胞仪上进行实验：405 nm（紫色）、488 nm（蓝色）以及 561 nm（黄色）或 638 nm（红色）。有关下文讨论通道的常用名称，请参见补充表 S1。
- 为测量pHL荧光，使用KO525通道（VL2-H，激发波长405 nm，发射波长542/27 nm）和FITC通道（BL1-H，激发波长488 nm，发射波长530/30 nm）。为区分活细胞与死细胞，可使用PI或TR；PI在YL2-H通道检测（激发波长561 nm，发射波长620/25 nm），TR在RL1-H通道检测（激发波长638 nm，发射波长660/10 BP）。
- 在流式细胞仪软件中设置实验时，创建以下图谱：1）YL2-H 通道直方图（若使用 PI）或 RL1-H 通道直方图（若使用 TR），2）FSC-A 与 SSC-A 散点图，3）FSC-A 与 FSC-H 散点图，以及 4）BL1-H 与 VL2-H 通道散点图。
- 将未染色的野生型（亲本细胞系）对照样本首先放入样品进样口（SIP），并升起载物台至指定位置。在流式细胞仪上以最低流速开始采集数据，以便有时间进行必要的调整。为避免记录到非特异性碎片和死细胞，应在开始采集样本5秒后开始记录事件。
- 调节 YL2 或 RL1 电压，使主峰位于 10 以内3-104 相对荧光强度（RFI）单位。调节FSC和SSC电压，使 >90% 的事件位于点图上。调整 FSC 阈值以排除碎片群体，但不应排除可能的细胞。
- 调整 VL2 和 BL1 通道，使主峰位于 10 以内3-104 未染色野生型对照的 RFI 单位。
- 将第一个含有经PI或TR染色的诱导pHL样品置于SIP上，并升起载物台至指定位置。以最低流速开始采集数据，仔细观察各图中的事件。确保 >每个图中包含90%的事件，且VL2-H和BL1-H通道无饱和事件。
- 继续运行样品，确保每个样品至少记录10,000个事件。
- 将样本数据以 .fcs 文件格式保存并导出用于分析。
5. 流式细胞术结果的数据分析
注意：本数据分析流程使用 FlowJo 软件。如果使用其他流式细胞术分析软件，请参照以下所述关键步骤，并使用相应软件的工具进行操作。有关图谱显示与设门策略，请参见补充图 S3和补充图 S4。
- 新建一个布局，并打开步骤 4.3 中获取的 .fcs 文件。将 .fcs 文件拖放到布局窗口中。
- 对活细胞设门。
- 双击未染色的野生型（WT）对照样本，以打开该样本的窗口。
- 在 YL2-H 通道（若使用 PI）或 RL2-H 通道（若使用 TR）上以直方图形式查看数据。在该图与使用活力染料染色的样本之间切换，以识别活细胞和死细胞群体。
注意：所有事件均应为未染色状态，因为该样本中未添加活力染料。 - 创建一个双分门（bisector gate），将活细胞和死细胞群体分开；将左侧门命名为 Live ，右侧门命名为 Dead。将此门应用于所有样本，然后在各样本间切换，确保该门适用于所有样本。根据需要调整门的位置。
- 对细胞群体设门。
- 在未染色的野生型（WT）对照样本中，双击 Live 门以查看该门内的事件。将散点图的 x 轴 改为 FSC-A ，y 轴 改为 SSC-A。
- 使用 多边形门工具 在细胞群体周围绘制门，并将其命名为 Cells。注意排除碎片/濒死细胞（通常位于散点图的最左侧和底部）以及聚集体（位于散点图的最右侧和顶部）。
- 将此门应用于所有样本的 Live 门下。在各样本间切换，确保该门覆盖了所有样本中可能的细胞群体，并进行必要的调整。修改门后，务必重新将其应用于所有样本。
注意：在饥饿与非饥饿条件下，FSC 与 SSC 图上的细胞群体分布有明显差异；请确保 Cell 门在所有条件下均覆盖了相应的细胞群体。
- 对单细胞设门，以提高 pH 测量的准确性。
- 在未染色的野生型（WT）对照样本中，双击 Cell 门以查看该门内的事件。将散点图的 x 轴 改为 FSC-A ，y 轴 改为 FSC-H。
- 在该散点图上寻找呈对角线分布的单细胞群体，双联体（doublets）则形成位于单细胞群体右下方的次级群体（见 补充图 S1 第三个图）。使用 多边形门工具，围绕单细胞事件绘制门，排除双联体群体，并将此门命名为 Singlets。
- 将 Singlets 门应用于所有样本的 Cell 门下。再次在各样本间切换，确保该门正确排除双联体群体，同时包含单细胞群体。根据需要进行调整。
- 对荧光性 pHL 细胞设门。
- 在未染色的野生型（WT）对照样本中，双击 Singlets 门，以打开该群体的散点图。将 x 轴 改为 BL1-H，y 轴 改为 VL2-H。
- pH 传感器 pHluorin2 在 VL2 和 BL1 通道均具有荧光。使用 多边形门工具 ，从散点图左下角的自发荧光群体出发，向右上方绘制一个对角线形状的门。将此门命名为 pHL+。
- 将 pHL+ 门应用于所有样本的 Singlets 门下。切换至 pHL 样本，并调整门的位置，使其包含在 VL2-H 和 BL1-H 通道中荧光强度高于野生型对照的事件。确保该门覆盖所有样本中的荧光群体，因为该群体的位置会随糖酵解体 pH 的变化而移动。
注意：pHL+ 群体的微小但可见的位移是由于荧光团激发光谱的 pH 依赖性变化所致。
- 导出统计数据。
- 点击 Table Editor | Edit bar | Add Column，以添加要导出的新统计项。
注意：对于每一项要导出的统计量，选择相应的统计指标及来源群体。对于 Median 等适用的统计量，务必选择正确的参数。样本名称保持不变。 - 添加以下统计量的列：Total (ungated) Count, pHL+ Count, Live Freq. of Total (基于总事件数的百分比), pHL+ Freq. of Parent (基于父门的百分比), pHL+ Median VL2-H, 和 pHL+ Median BL1-H。
- 点击 Table Editor ，并更改以下导出设置：Display 改为 To File ，Text 改为 CSV，然后选择 文件保存路径 和 文件名。点击 Create Table。
- 点击 Table Editor | Edit bar | Add Column，以添加要导出的新统计项。
- 计算荧光比值。
- 将导出的 .csv 文件另存为电子表格文件。
- 通过比较实验中所有样本的以下指标进行质量控制分析：每个样本的事件数、活细胞事件百分比、pHL+ 事件百分比。根据实验设计，使用柱状图或散点图进行可视化比较。
- 新建一列并标记为 pHL+ Median VL2/BL1。对每个样本，将 VL2-H 的中位数值除以 BL1-H 的中位数值，如公式（1）所示。
(1)
- 使用统计分析软件，基于荧光比值进行统计分析。
6. pH 生物传感器校准
注意：为了将测得的荧光比值转换为pH单位，需使用尼日里菌素（nigericin）和缬氨霉素（valinomycin）对表达pHL的细胞进行校准。尼日里菌素是一种K+/+ 反向转运蛋白，一种离子载体，当存在足量 K 时可使膜两侧的 pH 达到平衡+ 在缓冲液中15尼日里菌素常用于校准pHluorin及其他pH传感器16,17. 由于过氧化物酶体定位的pHluorin此前已使用 10 µM nigericin18，我们选择用该浓度进行处理。缬氨霉素是一种钾离子载体，已被使用（在 4 µM以平衡线粒体膜两侧的pH19我们使用了 10 µM 缬氨霉素通过确保K+离子跨膜平衡，辅助尼日里菌素的pH平衡作用。尽管我们采用了尼日里菌素与缬氨霉素的组合，但尼日里菌素本身可能已足以实现细胞器pH的平衡。
- 配制八种不同pH值（范围为5至8.5）的通用校准缓冲液（UCB；15 mM MES，15 mM HEPES和130 mM KCl）溶液。
- 离心（室温，10 分钟，800–1,000 × g) 8个独立的2 mL含有表达pHL的BSF培养物的离心管（约4 × 106 每个细胞
- 移去上清液，然后将每份细胞沉淀重悬于不同pH值的UCB中。
- 加入尼日里菌素和缬氨霉素，分别至 10 µMPI 中的尖峰 1 µg/mL.
- 将细胞在每种溶液中孵育15 min。
- 使用流式细胞仪检测每个样本，测量荧光比值，具体步骤如4-5所述。
- 对每个 pH 值重复该实验两次，共获得三个生物学重复。以 .fcs 格式导出数据。
- 按照步骤 5.1 至 5.8 所述分析 .fcs 文件。在今后的实验中，使用测得的每种 pH 下的荧光比值，通过公式（2).
(2)
注意： 补充图 S3 显示点图和设门方案。结果可在 补充表 S2以下介绍如何使用 GraphPad Prism 通过荧光比值插值 pH 值。若使用其他统计软件，请遵循相同的关键步骤。- 打开 GraphPad Prism，创建一个包含三个 y 重复值的 XY 表格。将 pH 值粘贴到 x 列中，将其对应的荧光比值粘贴到 y 重复值列中。
- 点击与表格相关的图表。查看图表时，点击 分析 在……之下 分析 丝带 | 插值计算标准曲线 在……下方 XY分析.
- 选择 S型曲线，四参数逻辑斯蒂拟合，X轴为浓度的对数值 由于pH单位采用对数尺度。Top和Bottom参数分别为估计的顶部和底部平台值。选择 无需特殊处理离群值.
注意：该软件将尝试根据公式（2）以及步骤 6.9.3。查看结果表和图中曲线是否存在拟合不良的证据。 - 要从其他实验的荧光比值中插值pH，请转到包含pHL校准数据的表格。将荧光比值粘贴在校准数据下方 在 y 列中为每个 y 值添加标题，但 x 值（pH）留空，因其未知。
- 在 结果图集，点击 插值分析 然后前往 插值 X 重复组 查找与输入的荧光比值并列列出的插值pH值。
注意：该软件利用校准数据得出的模型及最优拟合参数值，通过荧光比值对pH未知的实验样本进行pH插值。
7. 葡萄糖饥饿及补充时间进程
- 按照步骤 1.1 所述，在 37 °C 条件下用 1 µg/mL 多西环素诱导 15 mL BSF pHL 寄生虫过夜。
- 用含 10 mM 葡萄糖的 PBS 洗涤 15 mL 诱导后的 pHL 培养物，重复此步骤 3 次。
- 同时，按照步骤 3.2 所述，用 PBS 洗涤 3 mL WT 培养物 3 次。
- 在第一次洗涤后，当 pHL 样品重悬于 1 mL PBS 中时，取出 0.1 mL pHL 细胞悬液，保存于含 10 mM 葡萄糖的环境中，作为未饥饿对照。
- 最后一次洗涤后，将 pHL 样品重悬于含 1 µg/mL PI 的 PBS 中。
- 获取流式细胞术数据
- 根据实验和样品情况，每隔 5、10、30 或 90 分钟在流式细胞仪上检测一次样品，开始监测饥饿和非饥饿样品的糖酵解体 pH 值。按照步骤 4.1 至 4.3 所述获取流式细胞术数据，并确保预先设置好电压和图谱。
- 首先在 0 分钟时运行未染色的 WT 对照样品。
- 从 0 分钟开始，每 90 分钟在细胞仪上运行一次未饥饿对照样品。对于饥饿时间进程实验，从 0 分钟开始每 10 分钟运行一次饥饿样品；对于葡萄糖回补实验，分别在 0、5、10、20、30、60 和 90 分钟运行饥饿样品，然后在加入葡萄糖后重复检测。
- 在 90 分钟饥饿时间进程和 180 分钟葡萄糖回补时间进程中，将样品于室温孵育。
- 按照步骤 5.1 至 5.8 所述分析 .fcs 文件。
注意：补充图 S4 展示了如何进行设门以及点图应呈现的形态。补充表 S3 和 补充表 S4 分别展示了葡萄糖饥饿时间进程实验和葡萄糖回补时间进程实验的结果。
8. 优化药物筛选检测方法
- 将约 32 mL 表达 pHL 的 BSF 寄生虫和约 3 mL 的野生型（WT）细胞（浓度均约为 2 × 106 个细胞/mL）按照前述方法用 PBS 洗涤两次。
注意：为减少测得荧光比值的变异性并准确测量 Z 因子统计值，每孔需记录超过 10,000 个事件。完成此目标所需的最小培养体积约为 26 mL，但我们推荐使用 32 mL 以方便操作。- 第一次洗涤后，将 pHL 样本均等地分装至两个微量离心管中。
- 洗涤完成后，将一份 pHL 样本重悬于 18 mL 含 5 mM 葡萄糖、0.1% DMSO 和 TR 的 PBS 中，另一份 pHL 样本则重悬于 18 mL 含 0.1% DMSO 和 TR 的 PBS 中。
注意：DMSO 用于模拟药物筛选中的缓冲液组成，因为化合物通常溶解于 DMSO 中。 - 将上述两种细胞悬液转移至 12 孔储液槽中，每孔 9 mL。
- 使用移液机器人将细胞悬液分别加入 384 孔板的两个半板中，每孔 80 µL。
- 将该板在室温下孵育 1.5 小时，期间轻轻震荡，并用铝箔包裹以保护荧光染料免受光照。
- 在可运行 384 孔板的流式细胞仪上检测该板。
注意：以下操作流程适用于配备 Cytkick Max 自动进样器的 Attune NxT 流式细胞仪。若使用其他流式细胞仪，仍需遵循关键步骤。- 检测时选择最快速度（1,000 µL/min）并启用boost 模式，每孔采集 20 µL。每孔之间执行一次混匀循环和一次清洗循环。
- 按照步骤 4.1.3 中所述创建图谱。
- 运行未染色的 WT 管对照样本，并按照步骤 4.1.3 和 4.1.4 所述优化电压；运行饥饿处理的 pHL 管样本，并按照步骤 4.1 所述优化 VL2 和 BL1 电压。
- 开始在流式细胞仪上采集板数据。应水平运行该板，以确保饥饿与非饥饿样本孔之间的采集时间无显著差异。确保整个板的采集在约 1.5 小时内完成。
- 导出 .fcs 文件，并按照步骤 5.1 至 5.8 所述分析数据。计算经葡萄糖（Glc）或无葡萄糖（饥饿处理）处理样本的荧光比值的平均值（AVG）和标准差（SD）。
注意：本研究中 Z 因子实验的数据见补充表 S5。 - 使用公式（3）计算 Z 因子20 统计值。
(3)
图 1：活体血液形态布氏锥虫中糖酵解体 pH 值检测方法示意图。（A）表达定位于糖酵解体的 pHluorin2 传感器的细胞系示意图。加入过氧化物酶体靶向序列可控制其定位。注意：我们预计去除 PTS-1 序列将导致传感器在胞质溶胶中定位，从而为未来分析该亚细胞区室的 pH 值提供可能。（B）传感器验证实验示意图。缩写：BSF = 血液形态。 请点击此处查看该图的放大版本。
注意：Z因子统计量用于确定一种检测方法是否适用于高通量筛选（HTS）。Z因子值在0.5至1.0之间通常表明该检测方法的质量可满足高通量筛选的要求。
结果
pHLuorin2-PTS1 在布氏锥虫（T. brucei）血液形态中的糖酵解体定位
为评估 pHluorin2-PTS1 的亚细胞定位，对寄生虫进行了免疫荧光检测。转基因表达信号与针对糖酵解体驻留蛋白醛缩酶（TbAldolase）的抗血清信号共定位（图 2A）。抗 TbAldolase 抗体与 pHluorin2-PTS1 之间的平均 Pearson 相关系数为 0.895，表明 pHluorin2-PTS1 主要定位于糖酵解体。在确认 pHluorin2-PTS1 定位于糖酵解体后，我们进一步研究了 BF 阶段糖酵解体的 pH 值。
图2：pHluorin2-PTS1在布氏锥虫（Trypanosoma brucei）血液形态（BSF）中定位于糖酵解体。（A）pHluorin2-PTS1与糖酵解体驻留蛋白TbAldolase的共定位。将BF 90-13寄生虫转染pLEWpHluorin2-PTS1质粒，并用多西环素（1 µg/mL）诱导表达。使用抗TbAldolase血清对TbAldolase进行定位，随后与Alexa Fluor 568标记的山羊抗兔IgG抗体孵育。平均Pearson相关系数为0.895（分析30个细胞）。（B）在布氏锥虫（T. brucei）血液形态（BSF）中对pHluorin2-PTS1进行校准。比例尺 = 4 µm。缩写：BSF = 血液形态。请点击此处查看该图的放大版本。
pHluorin2-PTS1 校准
pH 的变化会改变 pHluorin2-PTS1 的激发光谱。在中性 pH 条件下，pHluorin2-PTS1 在 405 nm 处的激发强度大于在 488 nm 处；随着 pH 降低，情况相反9,21通过流式细胞术测量糖酵解体的相对pH值时，我们检测了在405 nm激光激发下的发射荧光（VL2通道）以及在488 nm激光激发下的发射荧光（BL1通道），并利用VL2/BL1的比值（荧光比值）来反映糖酵解体的相对pH。为将荧光比值转换为pH值，我们使用离子载体缬氨霉素（valinomycin）和尼日里菌素（nigericin）使细胞内及糖酵解体内的pH与细胞外pH达到平衡。17,18 随后通过流式细胞术分析以测定荧光比值。正如预期，随着细胞外pH值升高，在细胞内K⁺存在的情况下，荧光比值随之增加d pH 6.5图2B）。该 Kd 略低于已报道的 体外 Kd pHluorin29有趣的是，在葡萄糖存在下，BSF 糖酵体的 pH 值约为 8.0，比在葡萄糖存在下的 PF 糖酵体更偏碱性22我们使用该标准曲线将后续实验中的荧光比值转换为pH值。
由于葡萄糖饥饿导致的糖酵体酸化
尽管T. brucei PF寄生虫在缺乏葡萄糖时会使其糖酵体酸化22，但BSF糖酵体对葡萄糖的响应方式尚不清楚。为了探究这一点，我们将表达pHluorin2-PTS1的BSF寄生虫用含10 mM葡萄糖的PBS洗涤，以去除培养基，然后将细胞重悬于不含葡萄糖的PBS中。通过流式细胞术立即检测传感器对该扰动的响应，并在之后每10分钟检测一次，持续1.5小时。将结果与在含10 mM葡萄糖PBS中（未饥饿）的细胞进行比较。
在饥饿条件下，我们观察到随着时间推移，糖酵解体的pH值逐渐发生轻度酸化，并在约90分钟时趋于稳定（图3A）。这种糖酵解体pH值的变化具有统计学显著性（p < 0.0001），且在三次独立实验中均可重复。这表明，当缺乏葡萄糖时，血液形态（BSF）细胞会轻微酸化其糖酵解体，这与在昆虫形态（PF）生活阶段中观察到的反应相似9。
图 3：在缺乏葡萄糖时，BSF T. brucei 糖酵体的可逆性酸化。（A）在无葡萄糖（饥饿状态，蓝色）或有葡萄糖（非饥饿状态，红色）条件下培养的细胞的糖酵体 pH 值。饥饿细胞在首次使用 Attune NxT 流式细胞仪测量前约 2 分钟重悬于不含葡萄糖的 PBS 中。该时间过程实验进行了三次生物学重复。非饥饿寄生虫在含 10 mM 葡萄糖的 PBS 中孵育。对饥饿与非饥饿组在 90 分钟时间点的数据进行未配对双尾 Student's t-检验，***p = 0.0001。（B）饥饿（蓝色）和非饥饿（红色）BSF 寄生虫糖酵体 pH 值随时间变化的过程，在 90 分钟时重新加入 10 mM 葡萄糖（绿色虚线）。该时间过程实验进行了五次生物学重复。NS = 无显著差异（p = 0.25，未配对双尾 Student's t-检验）。请点击此处查看该图的放大版本。
葡萄糖响应下的糖酵解体可逆性酸化
接下来，我们通过饥饿细胞后再重新加入葡萄糖，检测BSF糖酵解体的酸化是否可逆。将寄生虫在无葡萄糖条件下孵育90分钟，随后加入葡萄糖（10 mM），并通过流式细胞术继续检测90分钟内的传感器响应（图3B）。我们观察到，在重新加入葡萄糖后约30分钟内，糖酵解体pH值恢复至饥饿前水平。这些结果表明，BSF糖酵解体pH值具有动态性，并可响应葡萄糖进行调节，这与在PF寄生虫中观察到的pH响应相似。
将pHluorin2检测法改进用于高通量药物筛选
糖酵体对锥虫至关重要，因为其内含有关键的代谢通路。糖酵体的重要性提示，干扰其稳态的抑制剂可能成为潜在的治疗候选药物。本文中，我们将糖酵体pH检测方法改进为高通量形式，以便进一步应用于药物筛选，以鉴定能够抑制糖酵体pH的化合物。鉴于pH值对糖酵体内蛋白质功能的已知影响7，我们推测干扰该调控过程可能对寄生虫产生不利影响。
为建立高通量检测体系，我们评估了该检测方法的稳健性。为此，将诱导表达pHluorin2-PTS1的寄生虫接种于384孔微孔板中，分别加入5 mM葡萄糖（高值对照）或无葡萄糖（低值对照），室温孵育90分钟。随后通过流式细胞术分析微孔板。如图所示 图4，复孔测量值之间的变异性较低，且高、低对照组分离良好，这些特征使得Z因子达到可接受的0.645。检测值为 > 0.5 通常被认为已足够稳健，可适用于高通量筛选项目。鉴于本研究取得的成功，我们预计该传感器及方法将在未来的高通量药物筛选中得到应用。
图 4：用于评估携带 pHluorin2-PTS1 传感器的 BSF 细胞是否适用于未来高通量筛选（HTS）实验的检测方法。 细胞分别在含葡萄糖（高值对照，红色，5 mM 葡萄糖）或不含己糖（低值对照，蓝色，未额外添加葡萄糖）的条件下孵育 90 分钟。计算得到的 Z 因子为 0.645。 请点击此处查看该图的放大版本。
补充图 S1：将 pHluorin2-PTS1 基因克隆至诱导型 T. brucei 表达载体 pLEW100v5 中。（A）两种载体均用 HindIII 和 BamHI 进行双酶切消化，随后进行纯化。使用 T4 DNA 连接酶将 pHluorin2-PTS1 基因片段连接至 pLEW100v5 中。（B）pLEW100-pHluorin2-PTS1。请点击此处下载该文件。
补充图 S2：用 pLEWpHluorin2-PTS1 转染的 TbAldolase BF 90-13 寄生虫中 pHL 与 TbAldolase 的共定位。 使用强力霉素（1 µg/mL）诱导表达。使用抗 TbAldolase 血清（以封闭液按 1:500 稀释）对 TbAldolase 进行定位，随后与 goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 孵育。平均 Pearson 相关系数为 0.895（30 个细胞）。比例尺 = 10 µm。请点击此处下载该文件。
补充图 S3：以 pH 8 校准缓冲液样本为例，用于校准 BSF pHL 传感器细胞系的代表性设门策略和点图。 样本使用 PI 活性染料染色，通过 YL2-H 通道评估 pH 对细胞活性的影响，但在设门策略中未使用活性信息。在 FSC-A 与 SSC-A 图上设置较宽的门以圈选细胞，因为校准过程中同时使用了活细胞和死细胞。在圈选细胞后，通过 FSC-A 与 FSC-H 图圈选单细胞（单一群体）。最后，在 BL1-H 和 VL2-H 通道中对具有 pHL 荧光信号的事件使用严格设门。缩写：BSF = 血液形态；PI = 碘化丙啶；FSC-A = 前向散射峰值面积；SSC-A = 侧向散射峰值面积；FSC-H = 前向散射峰值高度。请点击此处下载该文件。
补充图 S4：葡萄糖饥饿及恢复时间过程实验的代表性设门策略与点图。 以饥饿 0 分钟样本为例。由于使用了碘化丙啶（PI），活细胞通过 YL2-H 通道进行设门。通过 FSC-A 与 SSC-A 图进行设门以排除碎片和聚集体。单细胞通过 FSC-A 与 FSC-H 图进行设门。使用 BL1-H 和 VL2-H 通道对 pHL+ 事件进行设门。设门时使用野生型（WT）对照以排除自发荧光事件。缩写：PI = 碘化丙啶；FSC-A = 前向散射峰值面积；SSC-A = 侧向散射峰值面积。请点击此处下载该文件。
补充表 S1：流式细胞术使用的通道及常用名称。 提供了通道名称、常用名称以及所用激光器和发射滤光片的信息。 请点击此处下载该文件。
补充表 S2：使用尼日利亚菌素和缬氨霉素在不同 pH 缓冲液中进行 pHL 校准的结果。 本表格包含从 FlowJo 对 .fcs 文件分析导出的统计结果。这些数值用于计算荧光比值（VL2-H/BL1-H），以进行 pHL 校准，如图 2所示。这些 pH 校准结果还用于葡萄糖饥饿及恢复实验的时间过程中的 pH 插值计算（图 3）。以下统计参数用于质量控制：总事件数、pHL+ 细胞数、PI-（%）、PI+（%）以及 pHL+（%）。每个生物学重复的数据分别列在不同的工作表中，“汇总结果”标签页包含每种 pH 处理条件及重复的荧光比值。请点击此处下载该文件。
补充表 S3：BSF pHL 葡萄糖饥饿时间过程实验的分析数据 图3A. 此表格包含从 FlowJo 软件分析的 .fcs 文件中导出的统计数据。荧光比值通过计算 VL2-H 中位数与 BL1-H 中位数的比值获得（两者均来自 pHL+ 群体）。这些比值汇总在标签为“Summarized Results”的工作表中。PI- (%) 用于评估葡萄糖饥饿随时间对细胞活力的影响。总细胞数和 pHL+ 细胞数用于质量控制。 请点击此处下载此文件。
补充表 S4：BSF pHL 葡萄糖回补时间过程实验中分析的数据 图3B. 此表格包含从 FlowJo 软件分析的 .fcs 文件中导出的统计数据。pHL+ 中位数 VL2/BL1 值由 Excel 中的 pHL+ 中位数 VL2-H 与 BL1-H 计算得出。其余统计数据用于质量控制。 请点击此处下载此文件。
补充表 S5：使用 pHL 进行 Z 因子试验高通量筛选实验的 FlowJo 分析结果数据。 标签为“0 mM 葡萄糖”（低浓度）和“5 mM 葡萄糖”（高浓度）的工作表分别包含经 0 或 5 mM 葡萄糖处理的细胞数据。这些荧光比值在 图 4 中展示。在“汇总分析”工作表中，整合了两种处理条件下的荧光比值，并分别计算了各样本的均值和标准差（SD）。Z 因子统计值使用公式 3 计算得出。通过计算高浓度与低浓度均值的比值（High/Low）来评估均值之间的分离程度。请点击此处下载该文件。
讨论
非洲锥虫对环境的感知与响应机制目前尚不明确。已知营养物质可用性的变化会触发该寄生虫产生多种响应，包括糖酵解体的酸化。本文中，我们描述了一种利用可遗传的蛋白质传感器pHluorin2结合流式细胞术，在活细胞中研究糖酵解体pH值对环境扰动响应的方法。
使用该传感器时有几个关键步骤。首先，对表达外源基因的转染寄生虫进行表征非常重要，因为不同细胞间的表达可能存在差异。某些外源基因的表达水平可能随时间推移而下降。尽管迄今为止尚未在携带pHluorin2的细胞中观察到这一现象，但如果传感器的响应性变得高度不稳定（例如，诱导后传感器信号较弱），则可能需要对培养物进行克隆筛选，因为群体中部分细胞可能比其他细胞表达更高水平的蛋白。或者，重新转染并进行筛选已被证明是生成具有更高（尽管可能是短暂的）表达水平新细胞系的有效方法。如果需要重新转染，我们建议对单个细胞系进行克隆分离，因为目标外源基因的表达可能会带来轻微的生长劣势，导致高表达细胞在培养过程中逐渐丢失。
此外，在检测过程中以及常规培养期间，监测寄生虫的存活能力至关重要。我们在检测中加入了PI或噻唑红，以实现这一目的，这些报告分子可确保数据仅反映活细胞的反应。确保细胞在正常培养条件下的倍增时间保持恒定，尤其是在开展大规模检测（例如高通量筛选类检测）之前，有助于避免使用生长不良的细胞启动实验，从而防止对高、低对照信号产生不利影响，并提升整体筛选的稳健性。
本文所述的测定糖酵体pH值的方法具有较高的稳健性和灵敏度。然而，该方法也存在一定的局限性。首先，需要具备配备适当功能的流式细胞仪，包括能够容纳微量滴定板的进样装置。虽然比率荧光数据也可通过荧光显微镜采集，但该方法可分析的样本数量有限，因而限制了其在筛选实验或基于时间进程的检测等应用中的实用性。
第二个潜在的局限性在于，该实验涉及具有生物安全风险的试剂。拥有实验所需仪器的核心设施可能不允许将活体寄生虫带入其设备中。这些限制，以及在转基因锥虫的构建与维持方面的技术挑战，均可通过具备寄生虫生物学和细胞分析相关专业知识的研究团队之间的合作加以克服。
本文所述工作重点是利用非洲锥虫中的糖酵解体pH传感器，但该工具也可经改造后用于其他动质体类寄生虫。尽管目前尚不清楚糖酵解体酸化在Leishmania spp.或Trypanosoma cruzi生物学中可能发挥的作用，但鉴于已有针对寄生虫的特异性表达载体，且这些生物体的糖酵解体蛋白导入机制相似，因此有可能将pHLuorin2-PTS1作为转基因在细胞中表达5,23,24。
携带传感器的细胞的一个潜在应用是鉴定能够改变细胞酸化糖酵解体能力的小分子。这类分子可能对寄生虫具有毒性，因为已有研究发现pH值的改变可能是调控己糖激酶的一种途径，而己糖激酶是一种存在于糖酵解体中的蛋白质，在非洲锥虫致病生命周期阶段至关重要7。本文所述的检测方法已优化为高通量形式（图4），可用于大规模化合物库的活性筛选。
总之，该工具提供了研究寄生虫特异性细胞器中动态响应机制的机会。将传感器品系与正向和反向遗传学方法结合使用，有望鉴定出独特的寄生虫特异性通路。此外，这些传感器品系还可用于筛选能够抑制该响应的小分子抑制剂，从而为新药物靶点的发现开辟途径。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
pHluorin2-PTS1 由 Twist Bioscience 公司克隆至 pLEW100v5 载体中，该公司提供了该构建体的高拷贝克隆载体；pLEW100v5 载体由乔治·克罗斯博士（Dr. George Cross）惠赠。抗 T. brucei 醛缩酶的抗血清可应要求从克莱姆森大学梅雷迪思·T·莫里斯博士（Dr. Meredith T. Morris）处获得。JCM 和 KAC 实验室的工作部分得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，项目编号 R01AI156382）的资助。SSP 得到了 NIH 3R01AI156382 项目的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 50 mL 组织培养瓶（未处理，无菌） | VWR | 10861-572 | |
| 75 cm2 组织培养瓶（未处理，无菌） | 康宁 | 431464U | |
| 80 µL型平底384孔板 | BrandTech | 781620 | |
| Amaxa Human T Cell Nucleofector 试剂盒 | Lonza | VPA-1002 | |
| Attune NxT 流式细胞仪 | 赛默飞世尔科技旗下Invitrogen品牌 | A24858 | FlowJo 软件 |
| BRANDplates 96孔平底板 | 默克密理博 | BR781662 | |
| ImageJ 的 Coloc 2 插件 | https://imagej.net/plugins/coloc-2 | ||
| CytKick Max 自动采样器 | 赛默飞世尔科技旗下 Invitrogen 公司 | A42973 | |
| CytoFLEX 流式细胞仪 | Beckman-Coulter | ||
| Electron Microscopy Sciences 16% 甲醛水溶液，电镜级，10 mL 安瓿 | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| GraphPad Prism | 统计软件 | ||
| 尼日尔菌素（钠盐） | Cayman Chemical | 11437 | |
| Nucleofector 2b | Lonza | 已停产产品 | |
| OP2 液体处理仪 | opentrons | OP2 | |
| 聚-L-赖氨酸，0.1%（w/v）溶于 H2O | Sigma生命科学 | CAS:25988-63-0 | 用于高通量筛选实验的移液机器人 |
| 噻唑红（TO-PRO-3） | Biotium | #40087 | 我们加工了一个定制的丙烯酸培养板支架，以便该品牌的培养板可在我们的 CytKick Max 自动进样器上被检测和使用 |
| 缬氨霉素 | Cayman Chemical | 10009152 | 用于高通量筛选实验的移液机器人 |
| 用于pH校准 | |||
| 用于pH校准 |
参考文献
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