将配体建模至电子冷冻显微镜解析的密度图中

摘要

本方案介绍了在大分子冷冻电镜图谱中对小分子配体进行建模可用的工具。

摘要

解析大分子复合物中的蛋白质-配体相互作用对于理解分子机制、基本生物学过程以及药物开发至关重要。近年来，冷冻样品电子显微镜技术（cryoEM）已成为确定大分子结构并研究配体结合模式的一种强大手段，其分辨率可达到近原子级别。由于目标分子在不同方向上的分辨率各向异性以及数据本身固有的噪声，识别和建模cryoEM密度图中的非蛋白质分子通常具有挑战性。本文向读者介绍了当前用于配体识别、模型构建以及原子坐标精修的多种软件和方法，并以若干选定的大分子为例进行说明。以烯醇化酶为例，识别配体存在的最简单方法之一是将有配体与无配体状态下获得的两个密度图相减，配体的额外密度在差值图中即使在较高阈值下也往往清晰可见。然而，也存在无法生成此类简单差值图的情况，例如代谢型谷氨酸受体mGlu₅的研究实例所示。近年来提出的一种Fo-Fc缺失图推导方法，可作为验证并展示配体存在性的有效工具。最后，以研究较为深入的β-半乳糖苷酶为例，分析了分辨率对在cryoEM密度图中建模配体及溶剂分子的影响，并展望了cryoEM在药物发现中的应用前景。

引言

细胞通过同时且独立地进行无数化学反应来实现其功能，每个反应都受到精细调控，以确保细胞在响应环境信号时的生存与适应能力。这种调控通过分子识别实现，即生物分子（尤其是蛋白质）能够与其他大分子以及小分子或配体形成瞬时或稳定的复合物¹。因此，蛋白质-配体相互作用是所有生物学过程的基础，包括蛋白质表达和活性的调控、酶对底物和辅因子的识别，以及细胞对信号的感知与传递^1,2。深入理解蛋白质-配体复合物的动力学、热力学和结构特性，有助于揭示配体相互作用的分子机制，同时也可通过优化药物的结合能力与特异性，推动合理药物设计的发展。研究蛋白质-配体相互作用的一种经济且快速的方法是采用分子对接，这是一种计算方法，可对多种小分子进行虚拟筛选，并预测这些配体与靶标蛋白的结合模式和亲和力³。然而，来自X射线衍射（XRD）、核磁共振（NMR）或冷冻电子显微镜（cryoEM）测定的高分辨率结构的实验证据，为这些预测提供了必要的验证，并有助于开发针对特定靶标的新型且更有效的激活剂或抑制剂。本文使用缩写“cryoEM”，因为该技术通常如此称呼。然而，关于正确命名法的选择目前仍存在争议，最近有建议提出应使用低温样品电子显微镜（cryoEM）这一术语，以表明样品处于低温条件下并使用电子成像⁴。类似地，由cryoEM获得的图谱曾被称为电子势、静电势或库仑势，为简便起见，本文统一使用“cryoEM图谱”这一说法^5,6,7,8,9,10。

尽管XRD一直是蛋白质-配体复合物高分辨率结构测定的金标准技术，但分辨率革命之后¹¹ 冷冻电镜技术已获得显著发展，这一点已有所体现 由电子显微镜数据库（EMDB）中存储的库仑势能图或冷冻电镜图的激增^12,13 在过去的几年中¹⁴由于样品制备、成像及数据处理方法的进步，蛋白质数据库（PDB）中的条目数量¹⁴ 2010年至2020年间，采用冷冻电镜（cryoEM）解析的结构占比从0.7%上升至17%，其中约50%在2020年报道的结构分辨率达到3.5 Å或更高^15,16冷冻电镜技术已被结构生物学界（包括制药行业）迅速采纳，因为它能够以接近原子级的分辨率研究具有柔性和非晶态特性的生物大分子，尤其是膜蛋白和多蛋白复合物，从而克服了X射线衍射（XRD）进行高分辨率结构解析所必需的结晶过程以及获得良好衍射晶体的难题。

在冷冻电镜图谱中精确地构建配体模型至关重要，因为这为蛋白质-配体复合物在分子水平上的结构提供了蓝图。X射线晶体学中使用了多种自动化的配体构建工具 ，这些工具依赖于配体电子密度的形状和拓扑特征，以将配体拟合或构建到电子密度中^17,18,19,20。然而，当分辨率低于3 Å时，这些方法往往产生较差的结果，因为其所依赖用于识别和构建的拓扑特征变得不够清晰。在许多情况下，这些方法在将配体准确建模到冷冻电镜图谱中已被证明效果不佳，因为这些图谱通常处于中低分辨率范围，一般在3.5 Å–5 Å之间¹⁷。

通过冷冻电镜（cryoEM）测定蛋白质-配体复合物三维结构的第一步，是将配体与蛋白质共纯化（当配体对蛋白质具有高结合亲和力时），或在制备载网前将蛋白质溶液与配体孵育特定时间。随后，取少量样品滴加至经等离子体清洗的带孔透射电镜（TEM）载网上，迅速在液态乙烷中冷冻，最终使用冷冻透射电镜（cryo-TEM）进行成像。来自数十万至数百万个单颗粒的二维投影图像经平均处理后，重建出该大分子的三维（3D）库仑势图。在许多情况下，由于图谱中分辨率各向异性（即在整个大分子范围内分辨率不均一）、配体结合区域的柔性以及数据中的噪声等因素，识别并建模配体和溶剂分子仍面临重大挑战。许多原本为X射线衍射（XRD）开发的建模、精修和可视化工具，目前正被逐步适配用于冷冻电镜的相同目的^{18, 19, 20, 21}。本文综述了当前用于识别配体、构建模型以及精修冷冻电镜所得坐标的各种方法和软件，并提供了一套逐步操作流程，以具体蛋白质-配体复合物为例，展示在不同分辨率和复杂程度下进行配体建模的过程。

在冷冻电镜图谱中对配体进行建模的第一步是识别图谱中的配体密度（非蛋白质部分）。如果配体结合未引起蛋白质发生任何构象变化，则通过计算蛋白-配体复合物与脱辅基蛋白之间的简单差值图谱，即可突出显示额外密度区域，从而提示配体的存在。此类差异可直接观察到，仅需两套图谱即可实现，甚至在三维精修过程中的中间图谱也可用于检测配体是否存在。此外，若分辨率足够高（<3.0 Å），差值图谱还可提供与配体及蛋白质残基相互作用的水分子以及离子位置的信息。

在缺乏脱辅基蛋白（apo-protein）图谱的情况下，现在可以使用 Servalcat²²，该工具既可作为独立程序使用，也已集成到 CCP-EM 软件套件^23,24 中，作为 Refmac 精修程序的一部分，并包含在 CCP4 8.0 版本^25,26 中。Servalcat 可利用未锐化处理的半图谱（half-maps）和脱辅基蛋白模型作为输入，计算 FSC 加权的差值图（Fo-Fc 图）。Fo-Fc 略过图（omit map）表示实验图谱（Fo）与模型衍生图谱（Fc）之间的差异。当模型中不存在配体时，Fo-Fc 图中与实验 EM 图谱重叠的正密度通常提示配体的存在。此处的假设是蛋白质主链在图谱中已得到良好拟合，因此残余的正密度指示了配体的位置。然而，必须仔细检查该正密度是否源于建模误差，例如蛋白质侧链构象（rotamer）错误所致。

第二步涉及利用现有的化学信息获取或构建具有明确定义几何结构的配体笛卡尔坐标文件。标准配体（例如 ATP 和 NADP⁺) 已在 CCP4 单体库中提供的组分，可通过获取其坐标文件和几何文件用于精修 通过 其单体入库代码。然而，对于未知或非标准配体，可使用多种工具生成几何文件。其中一些示例包括 eLBOW²⁷ （电子配体构建与优化工作台）在 Phenix 中²⁸Lidia — Coot 软件内置工具²⁹, JLigand/ACEDRG^30,31，CCP-EM^23,24，Ligprep³²- 使用 Schrodinger 套件中的 Glide 模块。随后，配体坐标文件在 Coot 中依据实验获得的冷冻电镜密度图和差值图进行拟合。接着在 Phenix 中进行实空间精修。²⁸ 或在 Refmac 中进行互易精修³³一台配备高性能显卡和上述软件的Linux工作站或笔记本电脑是必需的。这些程序中的大多数包含在各种软件套件中。CCP-EM²⁴ 和 Phenix²⁸ 可免费供学术用户使用，包含本文所用的多种工具，如 Coot、Refmac5^33,34,35,36、Servalcat、phenix.real_space_refine 等。同样地， 嵌合体³⁷，以及 ChimeraX³⁸ 为学术用户提供免费许可。

方案

1. 建模烯醇化酶中磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的结构 结核分枝杆菌

1. PEP-烯醇化酶复合物冷冻电镜图谱中配体密度的鉴定
   1. 从EMDB的附加数据中下载apo-烯醇化酶的未锐化半图谱（emd_30988_additional_1.map 和 emd_30988_additional_2.map）（参见材料表）。
   2. 打开ChimeraX（参见材料表）。通过点击工具栏中的打开并选择文件名来打开apo-烯醇化酶的半图谱。在命令行中输入vop add #1 #2以合并两个半图谱，获得apo-烯醇化酶未锐化图谱。
      注：#1 和 #2 表示步骤1.1.1中提到的apo-烯醇化酶酶的两个半图谱。
   3. 通过输入命令rename #3 Apo-enolase-unsharpened-map重命名合并后的图谱（ChimeraX图谱ID：#3）。在模型面板中将图谱着色为灰色。该图谱表明烯醇化酶在溶液中呈八聚体，具有D4对称性。
   4. 使用以下半图谱 emd_30989_additional_1.map（图谱ID：4）和 emd_30989_additional_2.map（图谱ID：5），重复步骤1.1.1–1.1.3，以获得PEP-烯醇化酶未锐化图谱（图谱ID：#6）。
   5. 为计算差值图谱，首先在ChimeraX的图谱面板（工具栏）中点击拟合（图谱到图谱），将两个图谱（来自步骤1.1.3和1.1.4的PEP-烯醇化酶和apo-烯醇化酶未锐化图谱）相互拟合。
      注：两个图谱之间未进行归一化处理。在某些情况下，可能需要归一化以使图谱处于相同尺度。
   6. 在命令行中输入vop subtract #6 #3，从apo-烯醇化酶图谱中减去PEP-烯醇化酶图谱。
      注：#6 = PEP-烯醇化酶未锐化图谱，#3 = apo-烯醇化酶未锐化图谱。
   7. 将相减后的图谱（图谱ID：7）着色为绿色，表示正密度（按照X射线晶体学惯例）³⁹。
   8. 从蛋白质数据库（PDB）下载结核分枝杆菌（M. tuberculosis）八聚体烯醇化酶的坐标（PDB: 7e4x），点击工具栏中的打开，并选择文件名。
   9. 在命令行中输入rename #8 Apo_enolase.pdb重命名模型7e4x.pdb。#8表示ChimeraX中的Apo_enolase.pdb。
   10. 从模型面板中选择该模型。点击工具栏中的右键鼠标。点击移动分子，将模型定位至PEP-烯醇化酶图谱（#6）附近，并相对于图谱进行对齐。在命令行中输入fit #8 in #6，将该模型拟合到PEP-烯醇化酶未锐化图谱中。此处图谱编号为6，模型编号为8。
       注：在某些情况下，ChimeraX中的局部拟合可能不足以对齐模型。此时可在Phenix中执行额外的全局拟合步骤（DockinMap，参见材料表）。
   11. 在命令行中输入save Apo-enolase.pdb #8保存拟合后的模型。
2. 在PEP-烯醇化酶复合物的B因子锐化冷冻电镜图谱中对PEP进行建模与精修
   1. 在终端中输入./Coot &打开"coot"（参见材料表）。
   2. 点击文件 > 打开坐标 Apo-enolase.pdb，显示"Apo-enolase.pdb"。坐标文件以键线形式显示（按原子着色）。
   3. 从EMDB下载结合PEP的烯醇化酶锐化图谱，即emd_30989.map。点击文件 > 打开图谱 > emd_30989.map进行显示。通过滚动鼠标中键将阈值设置为7.00 σ。
   4. 点击验证 > 未建模团块 > 查找团块，寻找未建模的团块。
   5. 在烯醇化酶模型的活性位点残基Ser 42、Lys-386和Arg-364附近定位未建模的配体密度。
   6. 点击文件 > 获取单体，在Coot单体库中获取PEP单体模型文件，并输入PEP作为三字母代码。
   7. 使用侧边栏菜单中的旋转/平移-区域/链/分子选项将PEP分子移动至密度处。在侧边栏菜单中点击实空间精修区域，使用Coot中的实空间精修功能将PEP分子拟合到密度中。使用编辑选项卡中的合并分子选项将拟合后的配体与Apo-enolase.pdb合并。将模型保存为PEP-Enolase.pdb。
      注：也可使用配体> 抖动拟合配体选项来拟合配体。
   8. 为坐标文件中其余单体添加配体，点击计算 > NCS工具 > NCS配体。将弹出名为“查找NCS相关配体”的独立窗口。在“具有NCS的蛋白质”选项中，选择坐标文件Apo-enolase.pdb和链ID A作为NCS主链。
      1. 对于含有配体的分子，选择Apo-enolase.pdb作为坐标文件，链ID为J，残基编号为1至1。点击查找候选位置。将弹出名为“已拟合配体”的窗口，列出候选位置。通过点击各个候选配体并目视分析拟合情况来评估拟合质量。
         注：在Servalcat/Refmac中，只能提供单体模型，并可指定重构中使用的对称性以获得扩展模型。
   9. 在配体附近还观察到溶剂分子的额外密度。来自多种同源物的高分辨率烯醇化酶晶体结构表明存在两个Mg²⁺ 离子^40,41，可能用于稳定反应中间体的负电荷。通过点击放置原子并在指针原子类型列表中选择MG ，在活性位点密度中建模两个Mg²⁺离子。
      注：可利用键几何和距离作为选择金属离子的参考。对于与蛋白质残基中的氧原子结合的Mg²⁺，键距通常在2.1 Å – 2.4 Å之间，呈八面体几何构型。然而，在低分辨率图谱中，配位层常不完整，且由于分辨率限制，距离也可能有所变化。
   10. 重复步骤1.2.8，以在对称相关的单体中添加Mg²⁺离子。
   11. 点击文件 > 保存坐标 > 选择文件名>，输入Enolase+PEP+Mg.pdb，保存模型。
   12. 打开Phenix GUI（参见材料表）。使用Enolase+PEP+Mg.pdb作为输入模型，emd_30989.map作为输入图谱，使用默认参数运行实空间精修任务。此步骤需与Coot迭代进行，以实现良好的图谱-模型拟合和几何结构。
       注：未锐化差值图谱用于在图示中展示配体的存在， 例如在图中展示 。对于建模目的，推荐使用B因子锐化图谱。B因子锐化图谱也可用于计算差值图谱以供展示，而非使用未锐化图谱。然而，若配体结合区域的分辨率较低，则用于锐化整个图谱的单一B因子可能无法清晰揭示配体密度。
3. 建模配体的可视化与图像生成
   1. 在PyMOL⁴²中（参见材料表），点击文件 > 打开并选择文件名，打开最终Phenix精修作业中的精修模型Enolase+PEP+Mg。
   2. 点击文件 > 打开并选择文件名，加载emd-30989.map（结合PEP的锐化图谱）。
   3. 点击emd_30989对象旁的操作 > 重命名，输入PEP-sharpened，将图谱重命名为PEP-sharpened。
      注：在大多数情况下，例如烯醇化酶，当图谱在PyMOL中打开时会自动归一化，因为PyMOL中默认选中“归一化图谱”选项。由于冷冻电镜图谱位于较大的盒子中心，归一化将包含盒子中的所有内容。因此，可在打开前在PyMOL中关闭归一化。
   4. 点击显示 > 序列，选择配体。
   5. 在命令行中输入isomesh mesh_ligands, PEP-sharpened, 6.0, sele, carve=3.0 ，然后按回车。
   6. 点击mesh_ligand对象旁最后一个方框C，将mesh_ligand着色为蓝色。
   7. 以棍状和球状分别显示与PEP和Mg²⁺相互作用的活性位点残基Ser-42、 Asp-241、Glu-283、Asp-310、 Arg-364和Lys-386，烯醇化酶酶以卡通表示。
   8. 输入ray 3600, 3600进行光线追踪以生成出版级图像，并点击文件 > 保存，选择PEP.png作为文件名，保存为png文件。

2. 代谢型谷氨酸受体 mGlu₅ 中配体的建模

1. 鉴定并建模激动剂和拮抗剂结合的 mGlu₅ 的冷冻电镜图谱中的配体密度
   1. 下载激动剂结合（EMD-31536，7fd8.pdb）和拮抗剂结合（EMD-31537，7fd9.pdb）mGlu₅ 复合物的两套半图谱及其对应的坐标文件。
   2. 打开 ChimeraX
      1. 点击 open 并选择 7fd8.pdb，打开坐标文件 7fd8.pdb。
      2. 在命令行中输入 delete ligand，然后按 Enter。
      3. 类似地，使用命令 delete/B 删除 B 链。
         注意：可通过顶部的下拉菜单，使用 select 和 actions > atoms/bonds > delete 来删除配体和链。
      4. 在命令行中输入以下命令，保存无配体的 pdb 文件：save 7fd8_noligand_chainA.pdb #1。#1 表示模型 ID。
      5. 对 7fd9.pdb 重复步骤 2.1.2.1–2.1.2.4。
   3. 打开 CCP-EM。创建一个名为 mGlu₅ 的新项目，并指定项目目录和用户名。
      1. 从左侧面板的选项中打开 Relion。
         1. 转到 Mask Creation 选项卡。
         2. 将 EMD-31536 的一个半图谱作为输入提供。
            注意：Relion 接受以 .mrc 为后缀的图谱，而 EMD 图谱的后缀为 .map。可在 ChimeraX 中打开图谱文件进行检查，并将其保存为 .mrc 格式。
         3. 在 mask 选项卡中，将像素尺寸设为 0.89 Å，初始二值化阈值设为 0.007。
         4. 以别名 31536（或其他易于识别的名称）运行任务。
         5. 类似地，为 EMD-31537 半图谱创建掩膜。
      2. 在 CCPEM 左侧面板的选项中打开 Refmac Servalcat 程序。
         1. 将名称设为 mGlu₅_agonist。
         2. 导入如模型部分 2.1.2.4 所述的 7fd8_noligand_chainA.pdb 文件。提供两个半图谱的位置以及在 Relion 中创建的对应掩膜。
         3. 将分辨率指定为 3.8 Å。
         4. 转到 refinement settings > Strict Symmetry，并将 Relion 点群对称性设为 C2。
         5. 点击顶部的启动按钮开始程序。
   4. 任务完成后，在结果部分顶部的选项中打开 Coot。默认情况下，这将在 Coot 中显示一个 diffmap.mtz 文件，其中红色和绿色分别表示负密度和正密度。
      1. 转到 Display manager > properties，选择标记为 DELFWT PHDELWT 的差值图谱，并将等高线水平更改为 4.0（绝对值）。
         注意：阈值的选择取决于图谱和分辨率。
      2. 隐藏标记为 FWT PHWT 的图谱和标记为 refined.pdb 的分子。
      3. 使用鼠标移动图谱以观察正密度（绿色），并将较大的密度团块移至中心。
      4. 转到 File > Get monomer，输入 QUS，然后按 Enter。
      5. 转到 Calculate > Modeling > Rigid Body Fit molecule，双击 QUS 单体以调整分子，使其适配 Fo-Fc 密度。
      6. 在 edit 选项卡中使用 merge molecule 选项，将 QUS 分子添加到坐标文件 refined.pdb 中。
      7. 重复步骤 2.1.4.3–2.1.4.6，分别在细胞外区域和跨膜结构域顶部的较小密度团块中，使用单体代码 NAG 和 CHS 拟合配体。
      8. 将坐标文件保存为 refined_ligands.pdb。
         注意：跨膜（TM）结构域的分辨率较低，因此此处不作讨论。
2. mGlu₅ 配体结合结构的精修
   1. 打开 CCPEM，克隆之前的精修任务（步骤 2.1.3.2），使用 refined_ligands.pdb 和锐化后的图谱（emd.31536.mrc）作为输入，采用默认参数和 C2 对称性运行任务。
      注意：如果程序无法识别配体，则需要提供 CIF 文件。这些 CIF 文件可从 PDB 下载或使用各种程序生成（详见步骤 3.1.1）。
3. 在 PyMOL 中进行可视化和图像生成
   1. 在 PyMOL 中打开最新 Refmac 精修任务生成的 refined_expanded.pdb 模型。
   2. 转到 File > Open，浏览至 Refmac 任务目录，加载 diffmap_normalised_fofc.mrc 文件（即步骤 2.1.3.2 中 Servalcat 任务的差值图谱）。
      注意：如果浏览时未显示 .mrc 扩展名的文件，请将文件类型更改为 all files 后再进行浏览。
   3. 使用 display > sequence 选择配体。
   4. 点击 Actions 按钮，将所选内容重命名为 ligands。
   5. 在命令行中输入以下命令并按 Enter：isomesh mesh_ligands, diffmap_normalised_fofc, 6.0, ligands, carve=2.5。
      注意：可调整网格宽度。此处使用 0.2 的网格宽度，可通过以下命令设置：set mesh_width=0.2。
   6. 右键单击其中一个 monomer，转到 chain > color，为每个单体指定颜色。使用 ligand 和 mesh_ligands 对象中最后一个标有 c 的方框为配体和网格着色。mGlu₅ 受体二聚体以卡通形式显示，两个单体分别着色为青绿色和小麦色。配体以棍状表示，围绕配体的网格为绿色。
   7. 对相关对象使用 actions > orient/center/zoom 选项，手动调整以清晰观察网格。选择可能与配体相互作用的邻近残基（例如 QUS 的 Tyr64、Trp100），并根据需要以棍状形式显示其侧链或主链或两者。
   8. 进行光线追踪以生成高分辨率图像，并将其保存为 png 文件。
      注意：上述步骤同样适用于拮抗剂结合图谱 EMD-31537 及其对应的坐标文件 PDB-7fd9。

3. 在β-半乳糖苷酶的高分辨率锐化图谱中对抑制剂脱氧半乳糖-诺吉林霉素（DGN）及溶剂分子进行建模

1. 利用冷冻电镜半图鉴定配体 DGN
   1. 为建模制备未知配体字典 [脱氧半乳糖基-诺吉林霉素 (DGN)]
      注意：脱氧半乳糖野尻霉素 字典文件包含在 CCP4 单体库中，其配体三字母编号为 DGJ。 然而，在此将其视为一种新的未知配体，以说明为未知配体生成字典文件的过程，其中使用 DGN 作为三字母代码。
      1. 在 PubChem 网页中打开脱氧半乳糖-诺吉林霉素（deoxygalacto-nojirimycin, DGN）的化合物摘要，复制该化合物脱氧半乳糖-诺吉林霉素的 SMILES 字符串。
      2. 打开 Phenix > 配体 > 肘部.
      3. 将SMILES字符串指定为输入。
      4. 指定合适的配体构建优化方法。此处采用简单优化。
      5. 在配体定义部分粘贴化学SMILES字符串。
      6. 正确填写职位名称、输出文件前缀和配体编号，然后点击运行。
         注意：该任务的输出包含一个坐标文件 DGN.pdb 和一个字典文件 DGN.cif。Jligand²⁹ 也可用于生成 cif 文件。
   2. 从PDB下载β-半乳糖苷酶坐标文件（6tsh.pdb），并使用文本编辑器或Coot中的删除链/区域功能，移除蛋白链（B、C、D）、配体DGN及其他溶剂分子的坐标。 将坐标文件保存为 apo-betaGal_chainA.pdb。
      注意：也可使用 ChimeraX 或 Pymol 去除配体/溶剂分子。
   3. 从EMDB的EMD-10563条目附加数据中下载半图谱文件（emd_10563_half_map_1.map 和 emd_10563_half_map_2.map）。
   4. 打开 CCPEM 并使用 Relion 在阈值处为该图创建掩膜 0.01 （如步骤 2.1.3.1.1-2.1.3.1.4 所述）。
   5. 使用步骤 3.1.3 中获得的半图（half-maps）和步骤 3.1.2 中的无配体模型（apo-model），并设定 D2 对称性，在 CCPEM 套件中运行 Servalcat（如步骤 2 所述）。
      注意：为了定位配体密度，模型必须与其中一个半图或全图对齐。可通过使用 ChimeraX 将模型拟合到图中，然后保存相对于半图的坐标来实现。在本示例中，EMDB 中的半图与主图具有不同的盒子尺寸/网格，因此需要将模型放置在半图中。
   6. 开放 Coot.
      1. 打开 DGN.cif 使用 Phenix eLBOW 在步骤 3.1.1 中生成的配体字典。此操作通过进入 文件 > 导入CIF字典 并浏览 eLBOW 职位目录。
      2. 打开蛋白质和配体的坐标文件，分别为步骤 3.1.2 中的 apo-betaGal_chainA.pdb 和步骤 3.1.6 中的 DGN.pdb。
      3. 自动打开 diffmap.mtz 从 Servalcat 作业文件（步骤 3.1.5）中调取数据，在 Coot 中查看标记为 DELFWT PHDELWT 的电子密度图。将该图的等高线阈值设为约 4 的绝对值进行轮廓化显示。
         注意：通过输入以下命令来检查地图统计信息非常重要 header map.mrc 或使用 Chimera 中的工具。可获取像素大小、盒尺寸、最小密度、平均密度、最大密度以及密度均值的均方根偏差等所有必要信息。检查冷冻电镜图谱的像素大小和盒尺寸至关重要。三维图谱以三维体素网格的形式表示蛋白质-配体图谱体积。每个体素中存储的是该位置的电子势能值或发现电子的概率。当选择特定阈值时，密度低于指定值的体素将被设为零。这有助于最小化图谱中的实验噪声，并更清晰地可视化图谱特征⁴³因此，应选择一个使图谱特征清晰可见且噪声最小的阈值来绘制等高线。
      4. 前往 配体 > 寻找配体在出现的新窗口中，选择配体、差值图和 apo-betaGal_chainA.pdb 模型。其他选项保持默认设置，然后点击 寻找配体 开始搜索。
      5. 显示潜在配体密度的高置信度结果列表，每个密度位置均放置了一个拷贝。手动检查所有已放置配体的结果，保留最可能的命中项，剔除不明确的结果。
         注意：在高阈值下地图密度的差异明显表明配体存在于活性位点中。
2. 模拟配体 DGN 和溶剂分子
   1. 执行 实空间精修 在 Coot 中将配体（DGN.pdb）拟合到差值密度图中，然后 融合 配体与apo-betaGal_chainA.pdb进行对接，并将其保存为betaGal_chainA+ligand.pdb。
      注意：位于其他链区域中的配体在保存合并的坐标文件时可以被移除，且不会被合并。其他链中的配体可通过NCS配体生成，如示例1中步骤1.2.8所示，或在Refmac/Servalcat中通过对称性扩展生成。
   2. 使用 betaGal_chainA+ligand.pdb 作为输入模型，以及具有 D2 对称性的半图（来自步骤 3.1.3），按上述方法（步骤 3.1.5）运行另一个 Servalcat 任务。
   3. 步骤3.2.2中Servalcat作业生成的差值电子密度图显示，在建模配体周围存在提示溶剂分子与配体分子配位的电子密度。靠近配体附近的中心密度区域过大，无法容纳水分子。
   4. 基于先前的生化与结构数据，这些数据表明存在 Mg²⁺ 在 该位置 Mg²⁺ 离子在此通过点击进行建模 放置原子 选项并指定原子为 MG.
   5. 通过点击活性位点中指示溶剂分子存在的差值密度中的水分子模型 开启 的 将原子置于指针位置 并选择 水.
      注意：Coot 还具有自动挑选水分子的选项。此处，由于重点是 仅在活性位点手动添加水分子。
   6. 合并 Mg 的坐标²⁺ 使用 betaGal+ligand.pdb 文件中的水分子，并将其保存为 betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb。
   7. 使用 betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb，在 Servalcat 中进行具有 D2 对称性的 Refmac 精修。
      注意：该任务生成的差值电子密度图可用于验证配体建模的准确性，因为差值图中应显示极小的残余正密度或负密度。
3. 使用 PyMOL 进行可视化与图像生成
   注意：以下步骤简要示例了如何利用模型和图谱制作插图，可用于展示配体和溶剂的存在情况。
   1. 使用上一次 Servalcat 作业（步骤 3.2.6）生成的 refined_expanded.pdb 文件，其中包含已建模的配体和溶剂分子。
   2. 如示例2所述，分别选择不同的链，并将其着色为品红色、黄色、绿色和青绿色。
   3. 前往 显示 > 序列分别选择水分子、镁离子和 DGN，并将这些对象重命名为 water、MG 和 DGN。
   4. 选择将MG和水分子以球状形式显示 物体，右键单击，以及 显示 > 球体同样，以棍状模型显示配体，并对配体和溶剂进行适当着色。本例中，配体按杂原子着色为黄色，镁离子着色为紫色，水分子着色为红色。
   5. 选择 DGN，MG，以及 水分子. 右键单击并选择 操作 > 复制到对象 并将其命名为配体。
   6. 打开步骤 3.2.6 中 Servalcat 作业的 diffmap_normalised_fo.mrc 文件，并将其重命名为 ligand_fo.mrc。输入以下命令： isomesh mesh_ligands_fo, ligand_fo, 3, 配体, carve=2.
      注意：在原子周围应用 2 Å 的 carve 选项，根据图谱的分辨率和质量，也可使用 3–5 Å 的值。此外，在 PyMOL 中打开冷冻电镜图谱时，建议将 normalize_ccp4_maps 设置为关闭状态。
   7. 使用 操作 > 调整方向/缩放 选项并手动调整，以显示配体及附近相互作用的残基（如适用），如步骤 2.3.7 所示。
   8. 使用命令对这些场景进行光线追踪，以保存高分辨率图像 ray 3600, 3600.
   9. 将场景保存为 .png 文件。
      注意：以下步骤为可选操作，概述了可视化以下内容的流程：（1）未建模配体 DGN 的差值电子密度（Fo-Fc）；（2）已建模配体 DGN 的电子密度（Fo），以及未建模溶剂分子的差值电子密度（Fo-Fc）；最后是（3）活性位点中已建模配体 DGN 和溶剂分子的电子密度（Fo）。
   10. 为了利用差值图展示配体 DGN 及其周围溶剂分子的存在，打开 diffmap_normalised_fofc.mrc 来自步骤 3.1.5 中的 Servalcat 任务。通过点击将地图文件重命名为 unliganded_fofc.mrc 操作 > 重命名 紧邻地图对象。在命令行中输入以下内容： isomesh mesh_配体_fofc, 无配体_fofc, 配体, level=6, carve=2.
   11. 为了展示所建模配体 DGN 及其周围未建模溶剂的密度，打开 diffmap_normalised_fo.mrc 以及 diffmap_normalised_fofc.mrc 从步骤 3.2.2 的 servalcat 任务中，将 diffmap_normalised_fo.mrc 重命名为 DGN_fo 以及 diffmap_normalised_fofc.mrc 作为 DGN_未建模溶剂分子_fofc.
   12. 选择 MG 和 水 从 显示 > 序列，右键单击并选择 操作 > 复制到对象，并将它们命名为溶剂。
   13. 在命令行中输入以下内容： isomesh mesh_DGN_fo, DGN_fo, DGN, level=3, carve=2；isomesh mesh_solvent_fofc, DGN_unmodelled_solvents_fofc, solvents, level=6, carve=2.
       注意：mesh_DGN_fo 将显示配体的密度，而 mesh_solvent_fofc 将显示 Mg 和水分子的缺失密度。
   14. 最后，为了在活性位点中可视化所建模的配体及其周围的溶剂分子，打开 diffmap_normalised_fo.mrc 来自步骤 3.2.6 中的 Servalcat 任务，并将其重命名为 ligand_fo.mrc。
   15. 在命令行中输入以下内容： isomesh mesh_ligand_fo, 配体_fo, selection=配体, level=3, carve=2.
       注意：此处我们使用了 diffmap_normalised_fo.mrc，但也可使用最终经锐化的图谱来展示配体及其周围残基的密度。在图注中注明所使用的图谱类型及B因子锐化值是一种良好的做法。
   16. 可通过输入以下命令来设置网格宽度和球体大小： 设 mesh_width=0.2 和 set sphere_scale=0.25 使球体尺寸更小。
   17. 将fo网格染成蓝色，将fofc网格染成绿色。
   18. 使用 操作 > 调整方向/缩放 选项并手动调整以显示配体及附近相互作用的残基（如适用），如步骤 2.3.7 所示。
   19. 使用以下命令对这些场景进行光线追踪，以保存高分辨率图像 ray 3600, 3600.
   20. 将各个场景保存为 .png 文件。

4. 分辨率对β-半乳糖苷酶中配体建模的影响

1. 打开终端，进入包含两个半图（half-maps）的目录。
2. 在 ChimeraX 中以 .map 格式打开步骤 3.1.3 中生成的两个半图，进行可视化，并将其保存为 emd10563_half1_1_unfil.mrc 和 emd10563_half2_1_unfil.mrc。
3. 步骤 3.1.4 中创建的掩膜（mask）可用作输入。
4. 在 Relion 中运行PostProcessing任务，使用步骤 4.2–4.3 中的半图和掩膜，并采用默认参数。
5. 重复步骤 4.4，但此次启用Skip FSC-weighing选项，并指定一个临时的低通滤波值为3 Å。
6. 再次重复步骤 4.4，使用临时的低通滤波值 3.5 Å。
7. 在 PyMOL 中打开步骤 4.4–4.6 生成的图谱文件（postprocess.mrc，分别经不同分辨率滤波处理）以及步骤 3.1.2 中已与半图对齐的模型坐标文件 6tsh.pdb。根据各自的分辨率，将不同图谱重命名为 3.0、3.5 和 2.3。
   注意：可通过在 ChimeraX 或 Coot 中可视化图谱，确认其低通滤波效果。
8. 通过在不同分辨率滤波后的图谱中，围绕配体和溶剂分子创建半径为 2 Å、阈值为 6σ 的网格（mesh）（如步骤 3.3.6 所述），观察分辨率对配体和溶剂分子密度的影响。

结果

示例 1
结核分枝杆菌（M. tuberculosis）的烯醇化酶催化糖酵解的倒数第二步反应，将 2-磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），而 PEP 是多种代谢途径中必不可少的中间产物^44,45。对无配体烯醇化酶（apo-enolase）和 PEP 结合态烯醇化酶样品的冷冻电镜数据在相同的 1.07 Å 像素尺寸下采集，图像处理使用 Relion 3.1 软件完成^46,47。无配体烯醇化酶和 PEP-烯醇化酶结构的分辨率分别为 3.1 Å 和 3.2 Å⁴⁸。相关电子密度图和结构模型已存入 EMDB 和 PDB 数据库^49,50（EMD-30988、EMD-30989、PDB-7e4x 和 PDB-7e51）。该酶的冷冻电镜图显示其在溶液中以八聚体形式存在（图 1A）。为了识别 PEP-烯醇化酶图谱中的配体密度，选取了无配体酶和 PEP 结合酶的未锐化图谱，并在 ChimeraX 中通过从无配体酶图谱中减去 PEP-结合酶图谱计算出差减图。在较高阈值下观察到明显的密度（绿色），提示存在配体（图 1B）。在未锐化图谱中对蛋白链进行建模明确表明，额外的密度位于蛋白的活性位点内（图 1C）。随后，在 B 因子锐化图谱中使用 Coot 软件对配体 PEP 进行建模，并利用 Phenix 在实空间中对蛋白-配体复合模型进行精修。在配体附近观察到的密度中还建模了两个 Mg²⁺ 离子（图 1D）。配体 PEP 的取向与其他烯醇化酶同源物中观察到的相似，多个活性位点残基（如 Lys-386、Arg-364）与配体 PEP 形成氢键相互作用。Mg²⁺ 离子则与 Asp-241、Glu-283、Asp-310 以及 PEP 的磷酸基团形成金属配位键（图 1D）。

示例 2
在缺乏可用的脱辅基蛋白结构，或蛋白发生较大构象变化的情况下，无法按照上述方法计算差值图谱。2021年，剑桥大学分子生物学实验室的Garib Murshudov研究团队推出了Servalcat²²，该工具采用Refmac实现了一套精修工作流程，并在精修后计算Fo-Fc差值图谱。Fo-Fc差值密度呈正峰提示存在在精修过程中未被包含在模型中的分子或配体，本质上相当于一张缺失图（omit map）。然而，建议首先整体评估模型与图谱的拟合情况，然后再分析差值密度图谱。

为说明 Servalcat/Refmac 的使用，以 mGlu 为例₅，选择了一种可与神经递质L-谷氨酸结合的二聚体G蛋白偶联受体。当激动剂L-喹啉酸结合时，胞外结构域发生重排，进而引发七次跨膜区（7TM）的旋转，使其相互靠近以稳定激活状态。因此，在无配体/拮抗剂结合状态与激活状态之间可观察到显著的构象变化 与. 激动剂结合状态⁵¹ (图2A 和 图2E）。激动剂（EMD-31536）和拮抗剂（EMD-31537）结合复合物的两个半图均来自EMDB，冷冻电镜图谱显示分子不同区域的分辨率存在差异，其中细胞外结构域的分辨率较高。随后，将这些半图与无配体蛋白（apo-protein）作为模型一起输入Servalcat，以计算每套数据的差值图（Fo-Fc图）。该图清晰显示了多种配体分子（非蛋白质）的存在。根据FSC（傅里叶壳层相关系数）估计，激动剂和拮抗剂结合复合物的分辨率分别为3.8 Å和4.0 Å。在激动剂结合的mGlu₅，Servalcat Fo-Fc 差值图显示了激动剂（L-quisqualate）的存在（图2B）和N-乙酰葡萄糖胺（NAG）（图2C) 在受体的胞外区（ECD）中（由于跨膜区（TMD）分辨率较低，此处仅关注ECD及TMD顶部）。可观察到Tyr-64、Trp-100、Ser-151和Thr-175等蛋白残基与激动剂相互作用。Asn-210残基附近的电子密度提示存在N-乙酰葡萄糖胺（N-acetyl glucosamine）图 2C）。其密度与在mGlu纯化过程中添加的胆固醇半琥珀酸酯一致_5, 在跨膜螺旋1的顶端附近观察到图 2D）。由于分辨率适中，且配体L-quisqualate可呈现多种取向，因此参考了配体结合状态下细胞外结构域的先前结构（PDB-6N50）来对配体进行建模。拮抗剂的结合可稳定受体的开放态或静息态图2E在ECD的Venus flytrap结构域的叶I和叶II铰链处观察到与拮抗剂LY341495密度一致的电子密度。该拮抗剂与类似于激动剂所结合的残基相互作用。叶II中的Tyr-223与拮抗剂之间的堆积相互作用使受体稳定在开放状态。图2F）。与激动剂结构类似，在Asn-210附近观察到糖基化或N-乙酰葡糖胺基团的存在。图 2G).

示例 3
第三个示例阐明了在高分辨率冷冻电镜（CryoEM）图谱中对片段大小或小分子配体及溶剂分子进行建模的实验方案。基于片段的药物发现（Fragment-based Drug Discovery, FBDD）作为一种强大且创新的方法，已在多种疾病领域的靶向新药研发中崭露头角，成为制药行业极具前景的研究方向&D^52,53基于片段的药物发现（FBDD）始于对小分子片段的筛选与严格筛选，这些片段具有高溶解性、低分子量，并能结合特定的目标蛋白或感兴趣的生物分子。测定这些蛋白-片段复合物的结构可揭示片段的结合模式，从而为设计出对目标蛋白具有更高亲和力和特异性的更大、更复杂的类药分子提供指导。⁵⁴然而，该方法需要高分辨率的配体电子密度，以准确确定配体的构象并正确放置其官能团¹⁵.

β-半乳糖苷酶是首批通过冷冻电镜（cryoEM）技术解析出高分辨率结构的蛋白质之一，是一种被广泛研究的450 kDa同源四聚体酶，可催化乳糖水解为葡萄糖和半乳糖⁵⁵。为展示冷冻电镜在片段筛选药物发现（FBDD）中的应用，英国Astex公司解析了β-半乳糖苷酶与一个片段大小的抑制剂——脱氧半乳糖-诺吉林霉素（deoxygalacto-nojirimycin, DGN）结合于活性位点的结构（EMDB-10563，PDB:6tsh）⁵⁶。该数据集用于说明如何在高分辨率电子密度图中明确地对配体和溶剂分子进行建模。为了展示分辨率对配体建模与可视化的影响，在Relion软件的后期处理步骤中，将密度图分别过滤至3.0 Å和3.5 Å分辨率。这突显了不同分辨率下电子密度图质量的差异，并强调了高分辨率对于准确建模配体和溶剂分子的重要性。

该酶在溶液中为具有D2对称性的四聚体（图3A）。Servalcat计算的差值电子密度图（图与模型之间的差值）显示，酶的活性位点中存在DGN及多个溶剂分子（图3B）。在约2.3 Å分辨率下，电子密度呈现高分辨率特征，有助于在蛋白活性位点中精确建模抑制剂DGN。观察到DGN与Tyr-503及His-540之间的相互作用（图3C）。差值密度图还提示存在与DGN及蛋白残基相互作用的溶剂分子。Mg²⁺和多个水分子被建模于电子密度中（图3D）。观察到Mg²⁺与Glu-416、Glu-461以及多个水分子之间的金属配位键（图3D）。Mg²⁺通过一个水分子与DGN发生相互作用。

在3.5 Å和3.0 Å的较低分辨率下，配体的电子密度呈现为模糊的团块状，缺乏对配体进行精确建模所必需的高分辨率特征（图4A、B）。在此类分辨率下，水分子的密度几乎无法观察到。总之，随着分辨率的提高，特别是高于3.0 Å时，电子密度能够支持对更多水分子的建模（图4C、D）。在约2.3 Å分辨率下，由于电子密度图中出现了清晰可辨的特征，能够准确确定配体手性中心的位置，同时也有助于水分子和Mg²⁺的定位与建模（图4C、D）。相比之下，Mg²⁺的电子密度在整个分辨率范围内均保持可识别（图4A–C）。

图1：在磷酸烯醇式丙酮酸配体的建模中 M. tuberculosis 烯醇化酶 (A) 显示了结合磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的烯醇化酶的B因子锐化图谱。该图谱表明烯醇化酶在溶液中呈八聚体状态，图中每个单体以不同颜色标示。B) 显示了无辅因子结合的烯醇化酶（apo-Enolase）的未锐化的冷冻电镜图谱（灰色），其上叠加了磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）结合态与无辅因子态烯醇化酶未锐化图谱之间的差值图谱（绿色），提示配体PEP的存在。该图谱用于演示配体存在的检测方法。C)展示了烯醇化酶模型在未锐化的冷冻电镜图谱中的拟合情况，突出显示了差异密度相对于蛋白质的位置。蛋白质模型以卡通形式呈现，并采用Chainbow着色。该图表明，在每个单体的活性位点均存在额外的密度（绿色）。D) 显示配体 PEP 被包裹在经 B 因子锐化处理的电子密度图中，呈蓝色。此外，还可见两个 Mg 的电子密度²⁺ 还观察到离子与多个活性位点残基（包括Ser-42、Asp-241、Glu-283、Asp-310）以及配体原子形成金属配位键。该配体与Lys-386、Lys-335和Arg-364形成氢键相互作用。蛋白质残基以棍状模型表示，Mg²⁺ 离子显示为紫色球体。图中各面板的图像（A-D）使用 PyMOL 生成。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图 2：mGlu₅ 受体中多种配体的鉴定、建模与可视化。 Fo-Fc 缺失图谱使用 Servalcat 获得。（A）显示 mGlu₅ 受体二聚体结构（PDB-7fd8）的卡通表示，两个单体分别以青绿色和小麦色表示，并与激动剂 L-喹啉酸结合。在受体的胞外区及跨膜区顶部鉴定出的所有配体均被包裹在 Fo-Fc 缺失图谱中，图谱呈绿色，等高线设为 6σ。（B）突出显示激动剂 L-喹啉酸在差值图谱中的拟合情况。L-喹啉酸与多个 mGlu₅ 残基相互作用，包括 Tyr-64、Trp-100、Ser-151、Thr-175 和 Gly-280。氢键相互作用以红色虚线表示。（C）在受体胞外区的 Asn-210 附近可见额外的电子密度，据此建模了 N-乙酰氨基葡萄糖分子（NAG）。为清晰起见，本图中 NAG 未与 Asn 成键。（D）显示在受体脂质暴露表面附近呈绿色的胆固醇半琥珀酸酯（CHS）的差值密度。CHS 分子以棍状表示，并被建模于该密度中。（E）显示 mGlu₅ 受体结构（PDB-7fd9）与拮抗剂 LY341495 结合的卡通表示。（F）在胞外区叶瓣 I 与叶瓣 II 铰链区域的 Fo-Fc 差值图谱中可见额外密度，提示存在拮抗剂。围绕拮抗剂的关键残基（Tyr-64、Trp-100、Ser-152、Ser-173、Thr-175 和 Tyr-223）以棍状表示，与拮抗剂可能形成的氢键相互作用以红色虚线表示。（G）显示在拮抗剂结合结构中 Asn-210 附近存在 NAG 分子的差值密度（注：为清晰起见，NAG 未与 Asn 成键）。图像由 Pymol 生成。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：β-半乳糖苷酶高分辨率图谱（EMD-10563）中对小分子抑制剂和溶剂分子的鉴定、建模与精修。 （A）展示了以卡通模型表示的分辨率至 2.3 Å 的 β-半乳糖苷酶模型（PDB: 6tsh），每个单体以不同颜色显示。灰色框突出显示配体结合位点。（B）显示了酶活性位点中来自 Servalcat 的 Fo-Fc 差值密度（绿色网格）。密度差异提示活性位点中存在抑制剂（DGN）及多个溶剂分子。（C）表明在 Fo-Fc 差值密度图引导下，将脱氧半乳糖基-诺吉林霉素（deoxygalacto-nojirimycin, DGN）抑制剂建模至活性位点。该建模配体以棍状形式表示，并包裹在来自 Servalcat 的 Fo 密度（蓝色网格）中。观察到 DGN 与多个蛋白残基（包括 Tyr-503 和 His-540）之间存在氢键相互作用。配体周围额外的 Fo-Fc 差值密度（绿色）提示存在溶剂分子。（D）该图显示在确认每个溶剂分子均与蛋白残基（Glu-416、His-418 和 Glu-461）或配体残基成键后，将多个溶剂分子（包括水分子和 Mg²⁺）建模至活性位点，分别以红色和紫色球体表示。水分子和 Mg²⁺ 均被包裹在 Fo 密度（蓝色网格）中。Mg²⁺ 通过一个水分子与配体 DGN 发生相互作用。图（B, C）中的 Fo-Fc 密度图（绿色网格）等高线水平设为 6σ，而图 C 和 D 中的 Fo 密度（蓝色网格，来自建模后的 Servalcat 精修）等高线水平设为 3σ。图（A–D）由 Pymol 生成。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：分辨率对β-半乳糖苷酶中配体建模的影响。使用EMD-10563的半图作为Relion后处理步骤的输入，将合并后的后处理图谱分别用不同的B因子过滤至2.3 Å、3.0 Å和3.5 Å分辨率。所有图中图谱的等高线均设定为6σ。为清晰起见，图A、B和C中仅显示蛋白质主链，未显示侧链、配体或溶剂分子。（A）图谱被过滤至3.5 Å分辨率，显示β-半乳糖苷酶的活性位点。在此分辨率下可见一个类似配体DGN的电子密度团，周围还伴随几个较小的密度团。由于图谱中缺乏明确的特征，难以准确地以正确取向对配体进行建模。（B）图谱被过滤至3.0 Å分辨率。此时，配体的密度团略为清晰，但总体上仍缺乏细节特征。此外还可观察到更多提示为溶剂分子的小密度团。（C）图谱被过滤至2.3 Å分辨率，配体电子密度呈现出明显特征，特别是清晰显示出亚氨基糖的椅式构象。在此分辨率下还观察到大量对应于水分子的小密度团。Relion后处理中的自动B因子估计/锐化功能对过滤至3 Å和3.5 Å的图谱给出-18 Ų的B因子值，而对过滤至2.3 Å的图谱则为-52 Ų。EM图谱的不同B因子锐化也可在Coot中完成，有助于模型构建。（D）该图显示在2.3 Å分辨率下于活性位点建模的配体DGN（棍状表示）、Mg²⁺以及水分子（球状表示），以及围绕这些原子的蓝色网格表示的锐化图谱。图（A-D）使用Pymol生成。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

近年来，显微镜硬件和软件的进步使得冷冻电镜（cryoEM）结构的数量显著增加。尽管目前单颗粒冷冻电镜所能达到的最高分辨率为1.2 Å^57,58,59，但大多数结构的分辨率仍集中在3–4 Å范围内。在中等至低分辨率的密度图中构建配体模型具有挑战性，常常存在不确定性。鉴于冷冻电镜在学术界和制药行业广泛应用于转化研究和药物发现，确保配体模型的准确性与无歧义至关重要。因此，通过计算Q分数⁶⁰来量化配体原子的可分辨性是合理且必要的做法，目前该指标已作为评估密度图质量和模型拟合度的参数，被整合至EMDB数据库和Chimera软件中。

在第一个示例中，使用 ChimeraX 计算结核分枝杆菌（M. tuberculosis）烯醇化酶中脱辅基状态与配体结合状态在实空间中的差异图。在较高阈值下出现的额外电子密度提示配体磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate）存在于活性位点，并且有 Mg²⁺ 与该配体结合。需要特别注意的是，本例中的结构分辨率为中等（3.2 Å），水分子无法被可靠地建模（图1）。该方法的局限性在于，仅当配体结合未引起蛋白质显著构象变化时方可适用。本例中未进行密度图归一化处理，因为脱辅基状态和配体结合状态的数据集均以相同的像素尺寸采集，并在 Relion 中使用完全相同的参数进行处理。然而值得注意的是，当比较由不同重构程序（如 Relion^46,47 和 CryoSparc⁶¹）或不同质量的数据生成的密度图时，在进行有意义的比较之前，必须对密度图进行归一化处理。

下一个例子是 mGlu₅，其在激动剂结合后会发生显著的分子重排，这一点从冷冻电镜结构中可以明显看出^51,62（图2）。在此情况下，由于未结合（apo）状态与配体结合状态受体之间的电子密度图存在显著差异，无法直接计算简单的差值图。因此采用了 Servalcat 方法，该方法以未锐化且未加权的半图作为输入，在倒易空间中进行结构精修，随后计算实验图与模型衍生图之间的差值图。在较高阈值下，可以观察到差异特征，从而为模型的修正与优化提供指导。在 mGlu₅ 的胞外区及跨膜区附近观察到多个未建模的电子密度团块，并以此为依据对配体进行了建模（图2）。

第三个示例展示了分辨率（2.3 Å）在β-半乳糖苷酶中片段大小抑制剂的电子密度图解析与建模中的关键作用。此处的挑战在于，需在Servalcat差值电子密度图中识别出一个非常小的配体（<200 Da），并克服数据固有噪声的影响，实现其精确建模。除了通过傅里叶壳层相关（FSC）确定的高全局分辨率外，配体所在区域的局部分辨率也足够高，从而确保了配体手性中心的准确定位（图3）。在整个酶结构中，尤其是配体周围，在差值图中均观察到了溶剂分子的电子密度。分辨率对配体及溶剂原子建模的影响也在图中得以展示（图4）。在对水分子或溶剂分子进行建模时需格外谨慎，因为在较低阈值下，噪声有时可能呈现出类似水或溶剂分子的密度特征，从而导致潜在的误判。

另一个重要的考虑因素是，仅凭冷冻电镜图谱可能不足以准确识别金属离子。通常需要借助其他生物物理方法，如扩展X射线吸收精细结构（EXAFS）或能量色散X射线光谱（EDX），以确认金属离子的存在及其种类。在烯醇酶和β-半乳糖苷酶这两种酶中，由于已有大量关于这些蛋白质的信息支持，因此建模时确定为Mg²⁺，并由此确认了金属离子的身份。此外，在这些案例中金属离子的配位特征——例如典型的八面体几何构型以及Mg²⁺接近理想值的配位距离——也为确定其身份提供了有力证据。

在对冷冻电镜图谱中的配体进行建模时，通常需要考虑几个重要的因素。首先，选择正确的图谱用于配体的识别与建模至关重要。在所有情况下，建议使用未经锐化和加权的图谱或半图谱来观察配体电子密度，而不建议使用经过锐化和加权的图谱，因为锐化和加权可能导致图谱中出现欠锐化或过锐化区域（由级数截断引起的噪声）。这可能造成配体密度显示不理想，因此在Coot中进行模型构建时，可采用不同的B因子锐化方法来评估电子密度。尽管使用锐化图谱识别冷冻电镜图谱中的配体存在一定风险，但未锐化的图谱可能无法充分展现配体密度的细节，仅可用于示意目的，如图1B、C所示。

应对模拟配体的构象进行验证，尤其是在数据质量较弱的情况下。以mGlu₅为例，局部分辨率在冷冻电镜图谱中存在差异，这使得对配体进行无偏建模具有挑战性。Servalcat可作为检测蛋白质和配体建模中潜在误差的有力工具²²。

在蛋白质-配体复合物中可能存在组成异质性，其中仅特定亚群含有配体（如果配体分子量较低，则分类步骤可能无法消除这种异质性）。然而，在进行配体建模之前，图像处理过程中应迭代执行三维分类⁶³步骤，并验证配体密度是否得到改善。当存在多个蛋白质拷贝时，在初始模型生成和精修过程中若对整个电镜图施加对称性，需格外谨慎，因为这可能导致所有对称相关分子中的配体密度被平均化。只有在彻底检查电镜图并确认所有蛋白质链中均存在配体密度后，方可施加对称性。

根据原子所处的状态（晶体或溶液）和位置（埋藏或表面），其可能具有动态性，在模型精修中，这被称为原子位移参数（ADP）。结合差值电子密度图（可为模型中可能存在的误差提供视觉线索），ADP值可用于评估配体在精修后的准确性^64,65,66,67。通常情况下，配体的ADP值应与周围残基相近，即表明其结合稳定且建模准确。然而，位于边缘区域的配体，或距离大分子较远的配体原子（如脂类），其ADP值可能较高。除了坐标精修外，Refmac^33,34 和 Phenix 均支持对ADP值进行精修^28, 68。在Refmac中，采用Mott-Bethe近似法计算单个原子在电子密度图计算过程中的电子散射因子。在Phenix的最新版本中，已引入类似于晶体学中的个体B因子精修方法，以考虑原子的无序性。在源自冷冻电镜（cryoEM）的精修模型中，常常观察到较宽范围的ADP值（有时接近于零），甚至EMDB中用于评估模型与电子密度图拟合程度的Q-score，也依赖于所提交的原始电子密度图以及B因子锐化的方式⁶⁰。在冷冻电镜模型构建过程中，通常会使用多个电子密度图，因此应在方法部分明确说明建模和精修所使用的图谱，因为在许多大分子中存在各向异性分辨率，单一图谱可能不足以解释所有细节。

在大分子中配体的建模过程中，冷冻电镜图谱（与晶体学类似）的主要局限之一是：如果配体结合位点的分辨率较低，或结合的配体具有动态性，则确定其正确构象可能十分困难。此外，大多数冷冻电镜结构的分辨率低于3 Å，图谱中水分子的呈现有限，使得评估水合作用在配体或药物结合中的作用变得困难（如文中烯醇化酶和mGluR的示例所示）。可将计算方法与冷冻电镜数据结合使用，以克服这些局限⁶⁹。与晶体学不同，只有模型本身经历精修，而图谱不进行精修。目前，指示配体存在或确保建模准确性的唯一方法是生成省略图谱（使用如Servalcat等工具）。因此，尽管已有多种工具可帮助研究人员构建和评估模型，但在模型精修方面，未来仍有望出现新的方法或对现有方法的改进。

本文重点介绍了当前配体建模的方法，包括对配体电子密度的手动分析、生成配体几何文件，以及随后在冷冻电镜（cryoEM）密度图中进行配体建模。结构生物学与药物发现正处在一个令人振奋的时期，得益于具有更快帧率的直接电子探测器以及更快速的数据采集技术⁷⁰，研究人员能够在相对较短的时间内获得多种大分子（通常结合有小分子配体）的高分辨率结构图（<2.8 Å）。近期，Schrodinger 软件套件中的 GEMspot⁶⁹ 和 Rosetta 软件套件中的 EMERALD¹⁷ 等自动化配体建模工具相继问世，这些工具在整合实验性冷冻电镜数据的基础上，尝试确定配体最可能的结合构象，有望显著简化并实现该过程的自动化。类似于X射线晶体学，未来有望在一天内完成对一个甚至多个小分子配体结合模式的解析，这将逐渐成为现实可行的目标。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CCP4-8.0	多家机构组成的联盟	https://www.ccp4.ac.uk	学术用户免费使用，包含 Coot 及为 X 射线晶体学开发的一系列工具
CCP-EM	多家机构组成的联盟	https://www.ccpem.ac.uk/download.php	学术用户免费使用，包含 Coot、Relion 及其他多种软件
Coot	Paul Emsley, LMB, Cambridge	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/	通用的模型构建软件，也可作为上述其他软件套件的一部分使用
DockinMap (Phenix)	多家机构组成的联盟	https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html	Phenix 软件包中用于将模型对接到冷冻电镜图谱的工具
电子显微镜数据库	多家机构组成的联盟	https://www.ebi.ac.uk/emdb/	电子显微镜图谱的公共存储库
Falcon	Thermo Fisher Scientific	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf	商业产品，Thermo Fisher 生产的相机
Phenix	多家机构组成的联盟	https://phenix-online.org/download	学术用户免费使用，包含 Coot
蛋白质数据库	多家机构组成的联盟	https://rcsb.org	大分子结构的公共数据库
Pymol	Schrodinger	https://pymol.org/2/	分子可视化工具。教育版免费，但功能受限；完整版需支付少量费用获取。
Relion	MRC-LMB, Cambridge	https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html	用于冷冻电镜图像处理的软件，也可通过 CCP-EM 获取
Titan Krios	Thermo Fisher Scientific	https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c& gad_source=1&gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE	商业产品，Thermo Fisher 生产的冷冻透射电子显微镜
UCSF Chimera	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html	用于显示、分析等用途的通用软件
UCSF Chimera X	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	用于显示、分析等用途的通用软件