本文介绍了一种利用模式生物 C. elegans 进行经典条件反射实验以检测其联想学习能力的实验方案。该范式基于将环境中盐浓度与食物的存在或缺失进行配对，从而改变其趋向或回避盐的趋化行为。
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方法文章
测量线虫 Caenorhabditis elegans 趋化过程中的联想学习
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
为了适应环境，动物通过联想学习为感觉信息赋予正向或负向价值，并在环境条件变化时更新这种关联。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）对氯化钠 的行为反应为研究联想学习的调控机制提供了一个明确的范式。将线虫暴露于特定浓度的氯化钠环境中，同时给予或不给予食物，可分别诱导其对该氯化钠浓度产生趋向或回避的趋化行为。这种联想记忆可在数小时内形成，并可在相同时间范围内通过将动物暴露于不同浓度的氯化钠而加以改变。
本文介绍了基于秀丽隐杆线虫（C. elegans）盐趋向行为来检测行为可塑性与学习能力的方法。实验所用线虫品系经同步化培养至成虫阶段，随后在含有不同浓度氯化钠（NaCl）的培养板上进行数小时的训练，训练过程中可选择性地提供或不提供食物。训练结束后，将线虫转移至含有低、中、高三种NaCl浓度区域的检测板上，使其自由爬行30分钟，随后统计各区域中的线虫数量。根据线虫在培养板上的分布情况计算趋化指数。该检测方法可用于评估多种影响学习能力的因素的作用。
引言
为了与环境进行有意义的互动并产生适应性行为，动物需要解读所接收到的感觉信息：某种特定感觉线索对其生存是有益还是有害，几乎从不预先确定，而是取决于具体情境。因此，感觉系统和神经系统的一项关键任务是通过联想学习为环境信息赋予效价。某些刺激天生具有趋近性，例如食物；而另一些则天生具有回避性，例如伤害性刺激。这类非条件刺激（US）能够改变动物对其他同时呈现的刺激的反应；结果，动物可能对该其他刺激——即条件刺激（CS）——产生吸引或厌恶。这种现象被解释为：CS 能够提示或预测 US1,2,3。研究联想学习的模型对于阐明其背后的遗传、细胞和生理机制至关重要。然而，由于需要使用体内（in vivo）模型、行为存在变异性、动物操作需取得许可，以及研究人员和动物训练通常耗时较长，这类研究往往难以在本科生参与的科研环境中开展，更不用说在教学环境中实施了。
因此，无脊椎动物模型为本科生或硕士研究生开展联想学习实验提供了良好机会。无脊椎动物的饲养和操作无需动物使用许可，且成本较低。一种常用的联想学习范式是秀丽隐杆线虫（C. elegans）的盐趋化性学习4,5
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方案
1. 在进行关联学习测试前，制备用于同步 C. elegans 的生长平板（GP），以及在测试当天用于建立[NaCl]-食物关联的条件化平板（CP）
注意：用于培养和处理的培养皿与标准线虫生长培养基（NGM）平板12相同，仅在0 mM NaCl CP和100 mM NaCl CP平板中改变了NaCl浓度。
- 准备四个洁净的 500 mL 玻璃瓶，并分别加入以下成分：
- 向其中一个瓶子加入 1.25 g 胰蛋白胨、8.5 g 琼脂、487.5 mL 蒸馏水和一个磁力搅拌子（用于制备 0 mM NaCl CP）；
- 向其中两个瓶子各加入 1.5 g NaCl、1.25 g 胰蛋白胨、8.5 g 琼脂、487.5 mL 蒸馏水和一个磁力搅拌子（分别用于制备 50 mM NaCl CP 和 GP）；
- 向另一个瓶子加入 3 g NaCl、1.25 g 胰蛋白胨、8.5 g 琼脂、487.5 mL 蒸馏水和一个磁力搅拌子（用于制备 100 mM NaCl CP）。
- 将四个瓶子在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟，然后在水浴中于 55 °C 冷却 30 分钟。
- 将瓶子（每次一个）置于加热磁力搅拌器上。向每个瓶子中加入 12.5 mL 的....
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结果
在含有不同浓度 NaCl（0 mM、50 mM、100 mM）的培养板上，有或无食物条件下驯化 4 小时，显著影响了野生型（N2）C. elegans 的行为。在检测板上放置 30 分钟后，经高 NaCl 浓度并有食物条件驯化的线虫（CP100+）以及经无 NaCl 且无食物条件驯化的线虫（CP0-）表现出正向趋化指数（CI），表明其偏好较高 NaCl 浓度（图 2、表 1、表 2 和 补充表 1）。相反，经高 NaCl 无食物（CP100-）、中等 NaCl 无食物（CP50-）以及无 NaCl 有食物（CP0+）条件驯化的线虫则表现出负向 CI，表明其偏好较低 NaCl 浓度（图 2、表 1）（p < 0.0001，采用 Tukey 多重比较检验的双因素重复测量方差分析）。根据这些数据，我们得出结论：经过 4 小时的驯化，线虫学会了 NaCl 浓度与食物存在.......
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讨论
本文中，我们描述了对线虫关联学习能力的评估 秀丽隐杆线虫 以趋化性作为实验范式。在本示例中，我们采用了六种实验条件，具体为N2野生型 秀丽隐杆线虫 在低（0 mM）、中（50 mM）或高（100 mM）NaCl浓度的平板上培养，部分平板接种标准线虫食物E. coli OP50 菌株）或不接种细菌。然后， 秀丽隐杆线虫 允许线虫在未接种的检测平板上自由移动，该平板含有三种不同NaCl浓度的琼脂区域。通过从位于检测平板100 mM NaCl区域的线虫数量中减去位于0 mM NaCl区域的线虫数量，再除以检测平板上总的线虫数量，计算得到趋化指数（CI）。15,16该CI在-1到+1的量表上显示了 秀丽隐杆线虫 表现出对检测平板中低盐（0 mM NaCl，负趋化指数）或高盐（100 mM NaCl，正趋化指数）区域的偏好，具体取决于动物是否将特定盐浓度与食物关联。需要注意的是，尽管趋化指数（CI）能够标准化地总结动物的盐趋化行为，但如果动物.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本文献给约翰内斯·贝尔托尔德（Johannes Berthold）以表纪念。部分菌株由线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center，CGC）提供，该中心由美国国立卫生研究院研究基础设施项目办公室（NIH Office of Research Infrastructure Programs，P40 OD010440）资助。E.I.B. 感谢德国人民学术基金会（Studienstiftung des deutschen Volkes）提供的经济支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂 | Chemsolute | 9972-2KG | |
| 蛋白胨 | Gibco | 211677 | |
| CaCl2 1M 溶液 | Merck | 2389 | |
| Caenorhabditis elegans 菌株 | 秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC） | ||
| 胆固醇 | Roth | 8866.1 | |
| E. coli OP50 液体培养物 | N/A | N/A | |
| 乙醇 | Chemsolute | 22731000 | |
| KH2PO4 | Roth | P018.2 | |
| KPO4 (KH2PO4, K2HPO4) 1 M 溶液 | Chemsolute | 16341000 | |
| MgSO4 1 M 溶液 | Roth | T888.2 | |
| 1.5 mL 微量离心管 | Eppendorf | N/A | |
| Na2HPO4 | Roth | T877.1 | |
| NaCl | Chemsolute | 13671000 | |
| Y型培养皿 90 × 10 mm | Moonlab | 4-0033 |
参考文献
- Ardiel, E. L., Rankin, C. H. An elegant mind: Learning and memory in Caenorhabditis elegans. Learn Mem. 17, 191-201 (2010).
- Rescorla, R. A., Holland, P. C. Behavioral studies of associative learning in animals. Ann Rev Psychol. 33, 265-308 (1982).
- Schleyer, M.,....
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