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方法文章

测量线虫 Caenorhabditis elegans 趋化过程中的联想学习

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DOI：

10.3791/66311

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2025年6月17日

 ,  , 
1Institute for Mind Brain and Behavior, Faculty of Medicine, HMU Health and Medical University Potsdam

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用模式生物 C. elegans 进行经典条件反射实验以检测其联想学习能力的实验方案。该范式基于将环境中盐浓度与食物的存在或缺失进行配对，从而改变其趋向或回避盐的趋化行为。

摘要

为了适应环境，动物通过联想学习为感觉信息赋予正向或负向价值，并在环境条件变化时更新这种关联。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）对氯化钠 的行为反应为研究联想学习的调控机制提供了一个明确的范式。将线虫暴露于特定浓度的氯化钠环境中，同时给予或不给予食物，可分别诱导其对该氯化钠浓度产生趋向或回避的趋化行为。这种联想记忆可在数小时内形成，并可在相同时间范围内通过将动物暴露于不同浓度的氯化钠而加以改变。

本文介绍了基于秀丽隐杆线虫（C. elegans）盐趋向行为来检测行为可塑性与学习能力的方法。实验所用线虫品系经同步化培养至成虫阶段，随后在含有不同浓度氯化钠（NaCl）的培养板上进行数小时的训练，训练过程中可选择性地提供或不提供食物。训练结束后，将线虫转移至含有低、中、高三种NaCl浓度区域的检测板上，使其自由爬行30分钟，随后统计各区域中的线虫数量。根据线虫在培养板上的分布情况计算趋化指数。该检测方法可用于评估多种影响学习能力的因素的作用。

引言

为了与环境进行有意义的互动并产生适应性行为，动物需要解读所接收到的感觉信息：某种特定感觉线索对其生存是有益还是有害，几乎从不预先确定，而是取决于具体情境。因此，感觉系统和神经系统的一项关键任务是通过联想学习为环境信息赋予效价。某些刺激天生具有趋近性，例如食物；而另一些则天生具有回避性，例如伤害性刺激。这类非条件刺激（US）能够改变动物对其他同时呈现的刺激的反应；结果，动物可能对该其他刺激——即条件刺激（CS）——产生吸引或厌恶。这种现象被解释为：CS 能够提示或预测 US1,2,3。研究联想学习的模型对于阐明其背后的遗传、细胞和生理机制至关重要。然而，由于需要使用体内（in vivo）模型、行为存在变异性、动物操作需取得许可，以及研究人员和动物训练通常耗时较长，这类研究往往难以在本科生参与的科研环境中开展，更不用说在教学环境中实施了。

因此，无脊椎动物模型为本科生或硕士研究生开展联想学习实验提供了良好机会。无脊椎动物的饲养和操作无需动物使用许可，且成本较低。一种常用的联想学习范式是秀丽隐杆线虫（C. elegans）的盐趋化性学习4,5,6,7,8,9。 C. elegans能够感知其环境中氯化钠（NaCl）的浓度，并学会将特定的[NaCl]浓度与食物的存在或缺失相关联。通常情况下，线虫会趋向于先前与充足细菌食物同时出现的盐浓度，而避开先前在无食物条件下出现的盐浓度。因此，盐是条件刺激，而食物或饥饿则是非条件 刺激3。这种关联在不到一小时内即可形成，属于短期联想记忆的一个实例。NaCl趋化性的联想学习受到多种信号通路的调控，包括钙/钙调蛋白依赖性激酶 (CaMK) 信号、多巴胺能信号以及胰岛素/磷脂酰肌醇（PI）3-激酶信号通路5,9,10，这表明该过程涉及动机调控系统和CaMK依赖性的突触可塑性，其机制可能与脊椎动物中调控联想学习的信号通路相似。

在已建立的盐趋化学习实验方案中，线虫在琼脂平板上迁移，该平板通过在平板上分别放置不含盐或高盐的两个琼脂块形成空间盐浓度梯度7。由于NaCl从琼脂块持续扩散至平板中，导致趋化实验平板上的NaCl浓度随时间和空间发生动态变化，因此本科生难以对该实验进行定量操作，。另一种更易于操作的实验方法是使用四分区平板，其中两种不同的盐浓度（例如25 mM NaCl和0 mM NaCl）被塑料屏障分隔开11。然而，由于仅呈现两种不同的NaCl浓度，该方法无法同时用于检测相对于基线条件的低或高NaCl吸引或回避行为。C. elegans通常在含有50 mM NaCl和大肠杆菌OP50菌株的NGM（线虫生长培养基）平板上培养12，因此默认情况下会将该NaCl浓度与食物形成正向关联。

本文介绍了一种改良的盐趋化学习实验方案，研究人员和本科生均可操作。首先将动物在有或无食物存在的条件下，适应不同的氯化钠环境。随后将其转移至Y型琼脂培养皿中的检测平板，使其在低、中、高三种盐浓度之间进行选择。利用该条件下的趋化学习行为，可研究多种因素（如基因型、环境背景或动物年龄）对趋化学习的调节作用。

本方案专为本科生实验课程设计，课程分为八个学生小组，每个小组在每个实验时间点进行六组测量（每种实验条件下进行一次测量）。然而，本方案可根据实验人员数量灵活调整，适用于单个实验者或任意数量的小组/人员，只需相应调整试剂用量即可。

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方案

1. 在进行关联学习测试前，制备用于同步 C. elegans 的生长平板（GP），以及在测试当天用于建立[NaCl]-食物关联的条件化平板（CP）

注意：用于培养和处理的培养皿与标准线虫生长培养基（NGM）平板12相同，仅在0 mM NaCl CP和100 mM NaCl CP平板中改变了NaCl浓度。

  1. 准备四个洁净的 500 mL 玻璃瓶，并分别加入以下成分：
    1. 向其中一个瓶子加入 1.25 g 胰蛋白胨、8.5 g 琼脂、487.5 mL 蒸馏水和一个磁力搅拌子（用于制备 0 mM NaCl CP）；
    2. 向其中两个瓶子各加入 1.5 g NaCl、1.25 g 胰蛋白胨、8.5 g 琼脂、487.5 mL 蒸馏水和一个磁力搅拌子（分别用于制备 50 mM NaCl CP 和 GP）；
    3. 向另一个瓶子加入 3 g NaCl、1.25 g 胰蛋白胨、8.5 g 琼脂、487.5 mL 蒸馏水和一个磁力搅拌子（用于制备 100 mM NaCl CP）。
  2. 将四个瓶子在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟，然后在水浴中于 55 °C 冷却 30 分钟。
  3. 将瓶子（每次一个）置于加热磁力搅拌器上。向每个瓶子中加入 12.5 mL 的 1 M KPO4（室温 [RT] 下 pH = 6.0）。充分混合 2 分钟后，再加入 0.5 mL 的 1 M CaCl2、0.5 mL 的乙醇溶解胆固醇溶液（5 mg/mL）和 0.5 mL 的 1 M MgSO4 （所有溶液均需无菌）。通过磁力搅拌充分混匀。
    注：在加入 KPO4 后充分混匀，可防止加入 CaCl2 时产生磷酸钙沉淀。
  4. 在接近无菌的条件下（在超净工作台或本生灯旁），将每种培养基各 8 mL 分装至 55 mm × 10 mm 的培养皿中（分别对应 0 mM CP、50 mM CP、100 mM CP 和 GP 类型）。
    注：此步骤可制备约 62 个每种类型的 NGM 平板。
  5. 将平板在室温下静置约 3 小时使其冷却，随后于 4 °C 保存，最长可保存 2 周，待用。
  6. 向每个 NGM GP 平板中加入 200 µL 的 E. coli OP50 菌悬液，并在 20 °C 恒温培养箱中过夜干燥。
    注：平板可在室温下保存最多 1 周后再使用。

2. 通过定时产卵进行秀丽隐杆线虫（C. elegans）的维持及关联学习测试前准备 13（实验前3天）

注意：以建议格式进行一轮趋化性实验至少需要24块生长板（GP）、48块实验板（Assay Plates, AP）以及每种诱导条件8块板（诱导板，CP）。若一个班级分为八个学生小组，则每个小组将获得3块GP、6块CP和6块AP，即每种实验条件对应1块CP和1块AP。

  1. 维持 秀丽隐杆线虫 N2（布里斯托变种）在含有活菌的NGM琼脂平板上培养 E. coli OP50，20 °C 培养。在日常维护过程中，始终将培养皿倒置存放，以减少培养皿内水分流失。
  2. 将30只年轻的（第2天）N2成虫转移至每块GP上。
  3. 让动物在 20 °C 下产卵约 8 小时。
  4. 将所有成虫从培养皿中移除，倒置培养皿，在 20 °C 下培养 3 天。

3. 检测前准备（检测前1天）

  1. 准备接种（+）和未接种（-）的 CP。
    1. 在每批 0 mM NaCl CP、50 mM NaCl CP 和 100 mM NaCl CP 中，将其中一半平板每板接种 200 µL OP50（分别为 CP0+、CP50+ 和 CP100+）。
      注意：向 CP0+ 中加入 OP50 悬液可能会带入少量 NaCl（<2 mM NaCl），这不太可能显著影响趋化行为。在需要考虑低浓度 NaCl 的情况下，可通过向 CP0- 平板及检测平板上的“无盐”区域添加 2 mM NaCl 来进行校正。
    2. 将接种与未接种的两组平板（分别为 CP0-、CP50- 和 CP100-）一同置于 20 °C 培养箱中过夜干燥。
  2. 制备检测平板（AP）。
    1. 准备三个洁净的 1 L 玻璃瓶，并分别加入以下成分：
      1. 在一个瓶中加入 2.5 g 蛋白胨、17 g 琼脂、975 mL 蒸馏水和一个磁力搅拌子（用于配制 0 mM NaCl 培养基）
      2. 在一个瓶中加入 3 g NaCl、2.5 g 蛋白胨、17 g 琼脂、975 mL 蒸馏水和一个磁力搅拌子（用于配制 50 mM NaCl 培养基）
      3. 在一个瓶中加入 6 g NaCl、2.5 g 蛋白胨、17 g 琼脂、975 mL 蒸馏水和一个磁力搅拌子（用于配制 100 mM NaCl 培养基）
    2. 将三个瓶子在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟，然后在水浴中于 55 °C 冷却 30 分钟。
    3. 同时，在 Y 型培养皿（一个被内部隔墙分为三个区域的 90 mm × 10 mm 培养皿）底部的每个区域标记将要倒入的培养基对应的 NaCl 浓度。在培养皿中心（即三面隔墙交汇处）画一个半径为 5 mm 的圆（图 1）。
      注意：该圆圈内部区域以及隔墙本身在计数时视为排除区域：计数期间位于这些区域内的线虫不计入任何区域的总数。
    4. 将瓶子（每次一个）放在加热磁力搅拌器上。向每个瓶子中加入 25 mL 1 M KPO4（室温下 pH = 6.0）。充分混合 2 分钟后，再加入 1 mL 1 M CaCl2、1 mL 浓度为 5 mg/mL 的乙醇胆固醇溶液和 1 mL 1 M MgSO4（所有溶液均需无菌）。通过磁力搅拌充分混匀。
    5. 将 0 mM 培养基分装至 Y 型培养皿的一个区域，直至培养基达到内部隔墙顶部，静置约 5 分钟使其凝固。
    6. 将 100 mM 培养基分装至 Y 型培养皿的第二个区域，直至培养基接触到相邻已凝固的 0 mM NaCl 区域。为避免溢入相邻空区域，先将 100 mM 区域填充至 Y 形内墙顶端，然后使用无菌 10 µL 移液枪头沿 Y 形隔墙打破培养基表面张力，使其与 0 mM NaCl 区域连接，随后静置约 5 分钟使其凝固。
    7. 将 50 mM 培养基分装至 Y 型培养皿剩余的空区域，直至培养基同时接触到相邻已凝固的 0 mM NaCl 和 100 mM NaCl 区域。注意避免培养基溢入相邻区域，随后静置约 5 分钟使其凝固。
    8. 将平板置于 20 °C 培养箱中过夜保存。
      注意：采用此方法可制备约 50 个检测平板。
  3. 制备 1 L 无菌 M9 缓冲液14。

4. 秀丽隐杆线虫（C. elegans）关联学习实验（此处由8个小组平行进行）

  1. 用移液器将 1 mL 无菌 M9 缓冲液加入 GP 上，轻轻旋转培养皿，使线虫（主要为 1 日龄成虫）从 OP50 菌苔和琼脂上脱离，形成悬浮液。
  2. 倾斜培养皿，用 1 mL 塑料移液枪头收集含有线虫的 M9 缓冲液悬浮液，并转移至 1.5 mL 微量离心管中。
    注意：可使用剪刀剪去移液枪头顶端部分，以增大开口直径；这可以减少线虫通过枪头时所受的剪切应力和物理损伤，尤其在使用 200 µL 移液枪头时更为有效。实验开始前，应确保线虫不会粘附于所用离心管类型，可通过在体视显微镜下观察移除悬浮液后的离心管来确认。
  3. 对所有 GP 重复上述操作，然后让线虫在微量离心管底部静置约 60 秒，形成沉淀。
  4. 使用 1 mL 移液器小心吸除上清液/过量 M9 缓冲液，注意不要扰动沉淀。
  5. 再用 1 mL 无菌 M9 缓冲液清洗沉淀两次，以去除残留的 OP50 菌。每次清洗之间让沉淀静置约 60 秒。清洗完成后，用 M9 缓冲液将沉淀重悬至 300 µL。
  6. 缓慢将 50 µL 线虫悬浮液（约含 200–300 条线虫）转移至每块条件化培养皿（CP0-、CP0+、CP50-、CP50+、CP100- 和 CP100+）。每次分装前应轻轻涡旋悬浮液，以保持线虫均匀悬浮。对于接种了 OP50 菌的培养皿，应将线虫液滴置于细菌菌苔之外。让悬浮液充分渗入琼脂中。
  7. 将培养皿倒置于 20 °C 恒温培养箱中孵育约 4 小时，使线虫自由活动。
    注意：为适应本科生课程时间安排，条件化步骤可缩短至 2 小时。
  8. 用移液器将 1 mL 无菌 M9 缓冲液加入 CP 上，轻轻旋转培养皿，使线虫脱离，形成悬浮液。
  9. 倾斜培养皿，用 1 mL 塑料移液枪头收集 M9-线虫悬浮液，并转移至 1.5 mL 微量离心管中。
  10. 让线虫在微量离心管底部静置约 60 秒，形成沉淀。
  11. 使用 1 mL 移液器小心吸除上清液/过量 M9 缓冲液，注意不要扰动线虫沉淀。
  12. 再用 1 mL 无菌 M9 缓冲液清洗线虫两次。每次清洗之间让沉淀静置约 60 秒。
  13. 用 M9 缓冲液加至微量离心管 1 mL 刻度线处，静置约 60 秒使线虫沉淀沉降。
  14. 使用 1 mL 移液器小心吸除 960 µL 上清液，注意不要扰动沉淀。
  15. 轻轻涡旋或震荡微量离心管以重悬线虫，然后使用 20 µL 移液器将 20 µL 线虫沉淀（约含 100–150 条线虫）转移至 AP 中心位置，即 Y 形隔墙各分支交汇处。对其他 AP 重复此步骤。
  16. 在 20 °C 下让线虫自由活动 30 分钟，然后在体视显微镜下计数 AP 各区域中的线虫数量（分别为 0 mM NaCl、50 mM NaCl 和 100 mM NaCl 区域）。排除位于任一区域中心 5 mm 范围内或区域边界上的线虫（图 1）。
  17. 继续在 20 °C 下让线虫自由活动 30 分钟，再次计数 AP 各区域中的线虫数量。排除位于任一区域中心 5 mm 范围内的线虫。
  18. 根据以下公式计算每个时间点每块培养皿的趋化指数（CI）15,16：
    竞争指数公式；用于线虫分布研究分析的数学方程。

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结果

在含有不同浓度 NaCl（0 mM、50 mM、100 mM）的培养板上，有或无食物条件下驯化 4 小时，显著影响了野生型（N2）C. elegans 的行为。在检测板上放置 30 分钟后，经高 NaCl 浓度并有食物条件驯化的线虫（CP100+）以及经无 NaCl 且无食物条件驯化的线虫（CP0-）表现出正向趋化指数（CI），表明其偏好较高 NaCl 浓度（图 2、表 1、表 2 和 补充表 1）。相反，经高 NaCl 无食物（CP100-）、中等 NaCl 无食物（CP50-）以及无 NaCl 有食物（CP0+）条件驯化的线虫则表现出负向 CI，表明其偏好较低 NaCl 浓度（图 2、表 1）（p < 0.0001，采用 Tukey 多重比较检验的双因素重复测量方差分析）。根据这些数据，我们得出结论：经过 4 小时的驯化，线虫学会了 NaCl 浓度与食物存在...

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讨论

本文中，我们描述了对线虫关联学习能力的评估 秀丽隐杆线虫 以趋化性作为实验范式。在本示例中，我们采用了六种实验条件，具体为N2野生型 秀丽隐杆线虫 在低（0 mM）、中（50 mM）或高（100 mM）NaCl浓度的平板上培养，部分平板接种标准线虫食物E. coli OP50 菌株）或不接种细菌。然后， 秀丽隐杆线虫 允许线虫在未接种的检测平板上自由移动，该平板含有三种不同NaCl浓度的琼脂区域。通过从位于检测平板100 mM NaCl区域的线虫数量中减去位于0 mM NaCl区域的线虫数量，再除以检测平板上总的线虫数量，计算得到趋化指数（CI）。15,16该CI在-1到+1的量表上显示了 秀丽隐杆线虫 表现出对检测平板中低盐（0 mM NaCl，负趋化指数）或高盐（100 mM NaCl，正趋化指数）区域的偏好，具体取决于动物是否将特定盐浓度与食物关联。需要注意的是，尽管趋化指数（CI）能够标准化地总结动物的盐趋化行为，但如果动物...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本文献给约翰内斯·贝尔托尔德（Johannes Berthold）以表纪念。部分菌株由线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center，CGC）提供，该中心由美国国立卫生研究院研究基础设施项目办公室（NIH Office of Research Infrastructure Programs，P40 OD010440）资助。E.I.B. 感谢德国人民学术基金会（Studienstiftung des deutschen Volkes）提供的经济支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂Chemsolute9972-2KG
蛋白胨Gibco211677
CaCl2 1M 溶液 Merck2389
Caenorhabditis elegans 菌株秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）
胆固醇 Roth8866.1
E. coli OP50 液体培养物N/AN/A
乙醇Chemsolute22731000
KH2PO4 Roth P018.2
KPO4 (KH2PO4, K2HPO4) 1 M 溶液 Chemsolute16341000
MgSO4 1 M 溶液 RothT888.2
1.5 mL 微量离心管EppendorfN/A
Na2HPO4 RothT877.1
NaClChemsolute13671000
Y型培养皿 90 × 10 mmMoonlab4-0033

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