股骨内注射可将少量造血干细胞和祖细胞（HSPCs）直接植入骨髓腔，从而实现细胞的移植。本文介绍了一种将人HSPCs通过股骨内注射移植到免疫缺陷小鼠体内的实验方案。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
造血干细胞（HSCs）因其终生产生所有血细胞类型的能力而被定义。这一特性通常通过将含有HSCs的细胞群体移植到同系或免疫缺陷小鼠体内来进行功能验证。随后通过流式细胞术，随时间测量移植物的大小及其多谱系组成。传统上，将含有HSCs的细胞群注入动物血液循环中，之后HSCs会归巢至骨髓，在其中定植并开始造血。 Alternatively，造血干细胞和/或祖细胞（HSPCs）也可直接植入骨髓腔内。
本文介绍了一种将人源造血干细胞（HSPCs）注射到免疫缺陷小鼠股骨内的实验方案。简言之，对预处理后的小鼠进行麻醉，随后使用针头在膝关节处钻一个小孔，穿透至股骨。接着，利用更细的胰岛素针头，将细胞直接注入由第一根针头所形成的通道中。该移植方法可应用于多种实验设计，供体细胞可为人源或鼠源细胞。该技术最广泛应用于异种移植实验，因为在该背景下，其被认为相较于静脉注射可提高细胞植入效率，从而提升统计效能并减少所需使用的小鼠数量。
引言
血液是人体中再生速度最快的组织之一，每天可产生 1 × 1012 成人人体骨髓中每天的细胞数1造血干细胞（HSCs）通过造血过程维持终生的血液生成，其定义特征是能够产生所有类型的血细胞（多能性），同时保持自身的持续存在（自我更新）。传统上，检测HSC功能的金标准始终依赖于移植实验，即检测供体细胞群体在长期（通常定义为至少20周）内重建小鼠全部血液谱系的能力。2几十年来大量的功能研究表明，造血干细胞（HSC） compartment 在谱系输出和长期重建能力方面均具有异质性。研究造血作用的工具箱近年来显著扩展，涌现出许多新技术，包括 体外 单细胞功能检测、单细胞组学方法和谱系示踪3后者已明确证实，造血干细胞（HSC）和多能祖细胞在天然造血过程与移植所施加的压力条件下，其贡献存在显著差异。这些技术均是对移植实验的有力补充，而移植实验仍是评估HSC长期重建造血能力的重要手段。在人类造血研究背景下，异种移植是目前唯一可在整体生物环境中实验性评估自我更新能力的方法。
造血干细胞（HSCs）的异种移植通常通过将细胞静脉注射到免疫缺陷小鼠体内来完成。然而，HSCs非常稀有4，且含HSCs的人类样本来源有限。2003年，John Dick团队改进了一项骨髓穿刺方案，并将Lin−CD34+脐带血（CB）细胞经股骨内注射至非肥胖型糖尿病/严重联合免疫缺陷（NOD-SCID）小鼠体内5。据我们所知，目前尚无关于静脉注射与股骨内注射在长期及连续移植效果方面的正式比较报道。然而，与静脉注射相比，股骨内注射在移植相同数量细胞的情况下可获得更大的移植物规模6，至少在短期内如此。此外，使用更少数量的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）即可检测到植入效果。这被认为是因为股骨内注射绕过了HSCs归巢至骨髓的过程，而在异种移植背景下，由于多种受体和细胞因子缺乏跨物种反应性，归巢过程是受限的。Notta及其同事利用股骨内注射方法首次成功移植了单个人类HSC7，尽管如其方法所述，该操作需要额外注意。股骨内注射HSPCs也存在局限性。注射操作本身会破坏并损伤部分骨髓，因此不适用于研究HSCs与其骨髓微环境之间相互作用的实验。此外，可注射细胞的最大数量受限于骨腔容积，可能不足以满足某些实验需求。与所有技术一样，其在特定实验中的应用需根据技术的优缺点以及所研究的科学问题进行权衡。在异种移植背景下，如果实验目的是测试少量人类HSPCs的植入能力，且无需评估微环境影响，则通常优先选择股骨内注射而非静脉注射。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本研究中所有动物实验均遵循《1986年动物（科学程序）法案2012年修正条例》，并在剑桥大学动物福利与伦理审查委员会（AWERB）进行伦理审查并获得批准后开展。实验使用12至16周龄（约21–30 g）的雌性NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）小鼠，小鼠为本单位繁育，饲养于特定病原体阴性动物设施中，用于股骨内注射。去标识化的脐带血样本由剑桥血液与干细胞生物样本库（CBSB）根据剑桥郡地区研究伦理委员会（18/EE/0199）批准的规范程序，在健康供体知情同意后采集。
1. 小鼠的准备
- 照射前，对小鼠耳朵进行缺口标记以用于识别，并称重以获取基础体重。
- 细胞移植前24小时，使用2.4 Gy辐射对小鼠进行亚致死性照射。
2. 细胞的制备
注意：这些注射可使用新鲜或冻存的样本细胞。可通过流式细胞术分选特定的细胞亚群。或者，可在移植前将细胞在所需的条件下进行培养。在本实验中，我们使用冻存的脐带血 CD34+ 细胞。
- 在50 mL离心管中，通过逐滴加入预热的IMDM培养基（含50%胎牛血清（FBS）和0.1 mg/mL DNase），体积为细胞原体积的10倍，同时手动轻轻摇动离心管以解冻细胞。随后在500 × g 条件下离心5分钟。
- 将细胞重悬于每只小鼠20–40 µL（理想体积为25 µL）的磷酸盐缓冲液（PBS）加青霉素-链霉素溶液（10 U/mL或0.1%）中。若可能，在将细胞吸入注射器时应额外预留部分细胞以补偿死体积。细胞置于冰上保存直至注射。每次注射的细胞数量最多不超过400万个。
3. 动物实验室内股骨内注射的准备工作
- 准备本实验所需的以下三根针头：
- 准备一个带有27 G 1/2"针头的3 mL注射器。
- 准备一个带有29 G x 12.7 mm针头的0.5 mL胰岛素注射器，内含细胞悬液。
- 准备一个带有29 G x 0.5"针头的1 mL胰岛素注射器，内含0.1 mg/kg的丁丙诺啡（100 µL）。
- 将小鼠置于麻醉箱中进行麻醉（通过吸入2% (v/v) 异氟烷和2 L/min氧气）。将小鼠转移至鼻罩，并通过脚趾夹捏法确认其已进入适宜的麻醉状态。在眼睛上涂抹眼用软膏以防止干燥。
注意：本操作在生物安全二级防护罩内进行，并采用无菌条件。
4. 股骨内注射
- 将小鼠仰卧放置，使其后肢屈曲。用非优势手固定后肢，拇指按住足部，中指置于髋部，食指放在股骨外侧。
- 轻轻剃除或拔去膝盖骨周围毛发，并用酒精棉片擦拭该区域。
- 使用带有27 G 1/2"针头的3 mL注射器，对准膝盖骨内上角，轻柔地将针头穿过皮肤朝向股骨钻孔。虽然开始时可来回旋转针头，但一旦进入骨组织，仅使用顺时针方向旋转，直至整个针头进入骨内。
注意：此步骤的目的是建立细胞输送通道。（可选）为确认针头是否正确进入骨内，可松开后肢并左右旋转注射器；若针头位置正确，整个后肢会随注射器一同转动。继续操作前，重新用非优势手固定后肢，拇指按住足部，中指置于髋部，食指放在股骨外侧。若插入错误，针头可能位于肌肉或肌腱内，后肢不会随注射器转动，且可在皮下感觉到针头的存在。 - 以逆时针方向旋转退出针头，直至退出一半。此时，用酒精棉片擦拭针头周围区域（可能有少量血液渗出），然后继续逆时针旋转，完全拔出针头。
- 通过同一通道，将装有细胞的0.5 mL胰岛素注射器插入股骨干内。当针头进入后，应注意感受到一种刮擦感，表明位置正确。此时可松开对后肢的抓握，但需小心避免将针头从肢体中移出。随后，缓慢将25 µL细胞悬液注入股骨，然后拔出针头。
注意：所述“刮擦感”类似于触碰到粗糙表面；若针头进入过程异常顺滑而无粗糙感，则表明未到达正确位置。大多数操作者在成功实践后能清晰理解这一感觉。
5. 注射后护理
- 将小鼠放回笼中并监测其从麻醉中恢复之前，先对其进行皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg，100 µL）。
注意：在小鼠恢复足够意识以维持胸卧位之前，不得使其无人看管；在完全恢复之前，不得将其与其他动物放在一起。小鼠通常不太可能出现股骨内注射相关的不良反应；然而，股骨内注射可能导致手术部位活动减少和疼痛。 - 评估操作后踝关节肿胀、疼痛及活动能力。
注意：小鼠应在注射后24小时内恢复正常的肢体活动能力。
6. 数据分析
- 通过颈椎脱位法或任何批准的方法处死小鼠，可在注射后的任意时间点进行，例如归巢实验在24–48小时，短期造血干细胞活性检测在4–12周。 >18周以进行长期植入。若计划分析外周血（PB），则在处死小鼠前采用任一经批准的方法采血，理想情况下获得50–100 μL血液（不超过总血容量的10%）。按照标准解剖方案摘取后肢骨骼和脾脏。
- 对于骨髓：
- 将注射侧股骨（IF）与未注射的骨骼（后肢胫骨及未注射侧股骨，称为BM）分开。使用1 mL IMDM + 5% FBS及36 G × ¾"针头冲洗骨骼，随后以500 × g离心5分钟。 g.
- 将沉淀重悬于500 μL PBS + 3% FBS中，然后转移50 μL至96孔圆底板的一个孔中用于染色。
- 将剩余的骨髓冷冻，并在液氮中保存以备后续使用 离体 或继发性 体内 实验。
- 对于PB：
- 用100 μL PBS + 3% FBS冲洗收集管，将血液转移至5 mL FACS管中，并用PBS + 3% FBS补足体积至2.5 mL。
- 小心地将1 mL Pancoll用移液器加入FACS管底部，500 × g离心25分钟 g 松开刹车。
- 收集棕黄层，转移至1.5 mL离心管中，用PBS + 3% FBS定容至1.5 mL。500 × 膳心5分钟 g.
- 将沉淀重悬于50 μL PBS + 3% FBS中，转移至96孔圆底板的一个孔中进行染色。
- 对于脾脏：
- 将脾脏置于放置在50 mL离心管上的细胞筛中，用3 mL注射器的推杆研磨破碎。
- 每次加入1毫升，共加入5毫升IMDM + 5% FBS洗涤细胞。取50 μL加入96孔圆底板的一个孔中用于染色。
- 配制抗体预混液；以下为10个样本的示例：
- 在1.5或2 mL离心管中分装550 μL PBS + 3% FBS（每样本50 μL + 额外10%）。
- 加入单个抗体，使其终浓度基于抗体滴定结果为2倍（例如，对于滴定度为1:100的抗体，加入11 μL）。
注意：选择能够评估所有目标血液谱系潜在分化情况的抗体组合，例如 CD19/FITC、GlyA/PE、CD45/PECy5、CD14/PECy7、CD33/APC、CD19/Alexa 700、CD45/BV510 和 CD3/APCCy7。
- 染色：向含有样本的96孔圆底板的每个孔中加入50 μL抗体混合液。室温避光染色20分钟，随后加入100 μL含3% FBS的PBS洗涤细胞，500 × g离心5分钟。 g去除上清液。
- 将沉淀重悬于200 μL PBS + 3% FBS中，每份样品均通过带有细胞滤网帽的FACS管过滤。对于骨髓和脾脏样品，再添加200 μL PBS + 3% FBS。
- 流式细胞术对照：使用补偿微珠制备单染对照，向流式管中加入100 μL PBS、1滴阳性微珠、1滴阴性微珠和1 μL抗体。室温孵育5分钟，然后加入300 μL PBS。取50 μL未染色的骨髓细胞，用PBS补至400 μL PBS + 3% FBS 作为未染色对照。
- 通过流式细胞术分析样品。
- 运行单染对照和未染色对照以进行补偿，具体操作请参照所用流式细胞仪的建议。按照以下方法设置门控： 图3A.
- 对于外周血，需检测所有细胞；对于骨髓和脾脏，根据人源细胞植入水平，每样本至少检测50,000个事件。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
自注射后24小时起，可根据实验设计在任意时间点评估经股骨注射细胞的植入情况。在实验终点时，可采集股骨（IF）、骨髓（BM）、外周血（PB）和脾脏。这些样本经处理后，可通过流式细胞术评估植入水平。为了可靠地检测即使处于低水平的人源细胞植入，我们使用了两种不同的抗人CD45抗体（克隆号HI30和克隆号2D1）进行染色。仅当细胞对两种抗体均呈阳性（CD45++）时，才认定其来源于人类。植入阈值设定如下：（% CD45++ + % GlyA+）≥ 0.01%，且在两个门控中均至少检测到30个细胞（图1）7,8。人源细胞向未注射侧骨骼的迁移通常存在延迟。因此，若在8周前处死动物取骨，股骨（IF）中的植入水平很可能高于骨髓（BM）（图2A）。该差异通常在8周后趋于一致（图2B...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
当仅有少量造血干细胞（HSPCs）可用时，股骨内注射在异种移植中是一种有效的工具，与静脉注射相比可提高细胞植入效率。然而，该技术需要较高的操作技巧和训练。在练习过程中，我们建议使用体重范围合适的新生小鼠尸体（见下文），并注射有色染料（如台盼蓝），以便在解剖时能够清楚判断注射是否准确进入股骨且局限于股骨内部（肌肉中不应观察到染料）。在该操作中，有两个关键步骤：体位固定和感知第二根针头在骨髓腔内的正确插入。关于体位固定，尽管本文推荐了一种方法，但具体如何稳定小鼠腿部仍需操作者根据个人习惯优化。例如，我们团队中有一位成员更倾向于从身体对侧固定腿部。在任何情况下，关键在于确保腿部（从而股骨）稳固不动。文中所述用于确认第二根针头是否正确进入股骨的“刮擦感”，类似于触碰到粗糙表面的感觉，但仅通过文字难以进一步描述。大多数操作者在成功练习后通常能非常清晰地感受到这一触感。
在人类造血干细胞（HSC）移植的背景下，经过对四种免疫缺陷小鼠的比较，NSG小鼠是该技术最常用的模型9。然而，自2010年该文章发表以来，已开发出其他可用于股骨内注射的免疫缺陷小...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢 John Dick 博士团队在此方法早期研究中的贡献，以及 Monica Doedens 提供的培训。我们衷心感谢剑桥血液与干细胞生物样本库（Cambridge Blood and Stem Cell Biobank, CBSB），特别是 Joanna Baxter 博士及 CBSB 护理团队在脐带血样本的知情同意与采集工作中给予的支持；感谢我们的样本捐赠者；感谢剑桥大学生物医学服务中心，特别是 Nicolas Lumley 及安妮·麦克莱伦大楼（The Anne McLaren Building）的工作人员，他们为我们小鼠品系的维护和实验提供了支持 体内 实验；Shaaezmeen Basheer 对手稿的编辑。
E.L. 获得惠康信托基金和英国皇家学会联合资助的塞勒·亨利·戴尔研究员项目（107630/Z/15/A）的支持。L.M. 获得Sofinter - HR福利计划的支持。本研究由惠康信托基金（203151/Z/16/Z、203151/A/16/Z、215116/Z/18/Z）和英国研究与创新署医学研究理事会（MC_PC_17230）全额或部分资助。为实现开放获取，作者已对本投稿所产生的任何作者接受手稿版本应用了CC BY公共版权许可。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 mL 胰岛素注射器，带 29 G x 12.7 mm 针头 | BD | 324892 | |
| 1 mL 胰岛素注射器，带 29 G x 0.5" 针头 | BD | 324827 | |
| 1.5 mL 管 | Fisherbrand | 509-GRD-PFB | |
| 3 mL 注射器 | HENKE SASS WOLF GMBH | 4020.000V0 | |
| 5 mL 圆底聚苯乙烯试管，带细胞滤网盖，12 x 75 mm | Falcon | 352235 | FACS 管 |
| 5 mL 圆底聚苯乙烯试管，带 snap 盖，12 x 75 mm | Falcon | 352058 | FACS 管 |
| 27 G 1/2" 针头 | BD | 300635 | |
| 用于 50 mL 管的 40 µm 细胞滤网 | Greiner Bio-one | 542040 | |
| 50 mL 管 | Sarstedt Ltd | 62.547.254 | |
| 96 孔圆底板 | Falcon | 351177 | |
| 酒精棉片 | VITREX MEDICAL A/S | 520213 | |
| BD LSR Fortessa X-20 细胞分析仪 | BD | 流式细胞仪 | |
| 布托啡诺 | Animalcare | XVD190 | |
| CD14/PECy7（克隆 M5E2） | biolegend | 301814 | 使用稀释比例为 1:1000 |
| CD19/Alexa 700（克隆 HIB19） | biolegend | 302226 | 使用稀释比例为 1:300 |
| CD19/FITC（克隆 HIB19） | biolegend | 302206 | 使用稀释比例为 1:200 |
| CD3/APCCy7 （克隆 HIT3a） | biolegend | 300318 | 使用稀释比例为 1:100 |
| CD33/APC（克隆 P67.6） | BD | 345800 | 使用稀释比例为 1:200 |
| CD45/BV510（克隆 HI30） | biolegend | 304036 | 使用稀释比例为 1:500 |
| CD45/PECy5（克隆 2D1） | biolegend | 368526 | 使用稀释比例为 1:300 |
| CompBeads Anti-Mouse Ig，κ/阴性对照补偿微粒套装 | BD | 552843 | |
| 脱氧核糖核酸酶 1（Dnase 1） | Worthington Biochemical | LS002139 | |
| 胎牛血清（FBS） | PAN-Biotech | P40-37500 | |
| 血型糖蛋白 A（GlyA）/PE（克隆 GA-R2） | BD | 340947 | 使用稀释比例为 1:1000 |
| 伊氏改良杜尔贝科培养基（IMDM） | PAN-Biotech | P04-20250 | |
| 异氟烷（IsoFlo 100% w/w 吸入用蒸气，液体） | Zoetis | 115095 | |
| Microvette 300 锂肝素 LH，300 µL | Sarstedt Ltd | 20.1309 | 小鼠血液采集管 |
| NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）小鼠 | Charles River | ||
| 人 Pancoll，密度：1.077 g/mL | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Gibco | 14190169 |
参考文献
- Dancey, J. T., Deubelbeiss, K. A., Harker, L. A., Finch, C. A. Neutrophil kinetics in man. J Clin Invest. 58 (3), 705-715 (1976).
- Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).
- Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Cosgrove, J., Hustin, L. S. P., de Boer, R. J., Perié, L. Hematopoiesis in numbers. Trends Immunol. 42 (12), 1100-1112 (2021).
- Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nat Med. 9 (7), 959-963 (2003).
- McKenzie, J. L., Gan, O. I., Doedens, M., Dick, J. E. Human short-term repopulating stem cells are efficiently detected following intrafemoral transplantation into NOD/SCID recipients depleted of CD122+ cells. Blood. 106 (4), 1259-1261 (2005).
- Notta, F., et al. Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment. Science. 333 (6039), 218-221 (2011).
- Belluschi, S., et al. Myelo-lymphoid lineage restriction occurs in the human haematopoietic stem cell compartment before lymphoid-primed multipotent progenitors. Nat Commun. 9 (1), 4100(2018).
- McDermott, S. P., Eppert, K., Lechman, E. R., Doedens, M., Dick, J. E. Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains. Blood. 116 (2), 193-200 (2010).
- Billerbeck, E., et al. Development of human CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human stem cell factor-, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-, and interleukin-3-expressing NOD-SCID IL2Rγ(null) humanized mice. Blood. 117 (11), 3076-3086 (2011).
- Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nat Biotechnol. 32 (4), 364-372 (2014).
- McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rγ−/− KitW41/W41 (NBSGW) Mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
- Notta, F., Doulatov, S., Dick, J. E. Engraftment of human hematopoietic stem cells is more efficient in female NOD/SCID/IL-2Rgc-null recipients. Blood. 115 (18), 3704-3707 (2010).
- Futrega, K., Lott, W. B., Doran, M. R. Direct bone marrow HSC transplantation enhances local engraftment at the expense of systemic engraftment in NSG mice. Sci Rep. 6, 23886(2016).
- Mende, N., et al. Unique molecular and functional features of extramedullary hematopoietic stem and progenitor cell reservoirs in humans. Blood. 139 (23), 3387-3401 (2022).
- Medyouf, H., et al. Myelodysplastic cells in patients reprogram mesenchymal stromal cells to establish a transplantable stem cell niche disease unit. Cell Stem Cell. 14 (6), 824-837 (2014).
- Eppert, K., et al. Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia. Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).
- Sanchez, P. V., et al. A robust xenotransplantation model for acute myeloid leukemia. Leukemia. 23 (11), 2109-2117 (2009).
- Li, J., Chen, H., Zhao, S., Wen, D., Bi, L. Patient-derived intrafemoral orthotopic xenografts of peripheral blood or bone marrow from acute myeloid and acute lymphoblastic leukemia patients: clinical characterization, methodology, and validation. Clin Exp Med. 23 (4), 1293-1306 (2023).
- Dobson, S. M., et al. Relapse-fated latent diagnosis subclones in acute B lineage leukemia are drug tolerant and possess distinct metabolic programs. Cancer Discov. 10 (4), 568-587 (2020).
- Marktel, S., et al. Intrabone hematopoietic stem cell gene therapy for adult and pediatric patients affected by transfusion-dependent ß-thalassemia. Nat Med. 25 (2), 234-241 (2019).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
