股骨内注射可将少量造血干细胞和祖细胞（HSPCs）直接植入骨髓腔，从而实现细胞的移植。本文介绍了一种将人HSPCs通过股骨内注射移植到免疫缺陷小鼠体内的实验方案。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
造血干细胞（HSCs）因其终生产生所有血细胞类型的能力而被定义。这一特性通常通过将含有HSCs的细胞群体移植到同系或免疫缺陷小鼠体内来进行功能验证。随后通过流式细胞术，随时间测量移植物的大小及其多谱系组成。传统上，将含有HSCs的细胞群注入动物血液循环中，之后HSCs会归巢至骨髓，在其中定植并开始造血。 Alternatively，造血干细胞和/或祖细胞（HSPCs）也可直接植入骨髓腔内。
本文介绍了一种将人源造血干细胞（HSPCs）注射到免疫缺陷小鼠股骨内的实验方案。简言之，对预处理后的小鼠进行麻醉，随后使用针头在膝关节处钻一个小孔，穿透至股骨。接着，利用更细的胰岛素针头，将细胞直接注入由第一根针头所形成的通道中。该移植方法可应用于多种实验设计，供体细胞可为人源或鼠源细胞。该技术最广泛应用于异种移植实验，因为在该背景下，其被认为相较于静脉注射可提高细胞植入效率，从而提升统计效能并减少所需使用的小鼠数量。
引言
血液是人体中再生速度最快的组织之一，每天可产生 1 × 1012 成人人体骨髓中每天的细胞数1造血干细胞（HSCs）通过造血过程维持终生的血液生成，其定义特征是能够产生所有类型的血细胞（多能性），同时保持自身的持续存在（自我更新）。传统上，检测HSC功能的金标准始终依赖于移植实验，即检测供体细胞群体在长期（通常定义为至少20周）内重建小鼠全部血液谱系的能力。2几十年来大量的功能研究表明，造血干细胞（HSC） compartment 在谱系输出和长期重建能力方面均具有异质性。研究造血作用的工具箱近年来显著扩展，涌现出许多新技术，包括 体外 单细胞功能检测、单细胞组学方法和谱系示踪3后者已明确证实，造血干细胞（HSC）和多能祖细胞在天然造血过程与移植所施加的压力条件下，其贡献存在显著差异。这些技术均是对移植实验的有力补充，而移植实验仍是评估HSC长期重建造血能力的重要手段。在人类造血研究背景下，异种移植是目前唯一可在整体生物环境中实验性评估自我更新能力的方法。
造血干细胞（HSCs）的异种移植通常通过将细胞静脉注射到免疫缺陷小鼠体内来完成。然而，HSCs非常稀有4，且含HSCs的人类样本来源有限。2003年，John Dick团队改进了一项骨髓穿刺方案....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本研究中所有动物实验均遵循《1986年动物（科学程序）法案2012年修正条例》，并在剑桥大学动物福利与伦理审查委员会（AWERB）进行伦理审查并获得批准后开展。实验使用12至16周龄（约21–30 g）的雌性NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）小鼠，小鼠为本单位繁育，饲养于特定病原体阴性动物设施中，用于股骨内注射。去标识化的脐带血样本由剑桥血液与干细胞生物样本库（CBSB）根据剑桥郡地区研究伦理委员会（18/EE/0199）批准的规范程序，在健康供体知情同意后采集。
1. 小鼠的准备
- 照射前，对小鼠耳朵进行缺口标记以用于识别，并称重以获取基础体重。
- 细胞移植前24小时，使用2.4 Gy辐射对小鼠进行亚致死性照射。
2. 细胞的制备
注意：这些注射可使用新鲜或冻存的样本细胞。可通过流式细胞术分选特定的细胞亚群。或者，可在移植前将细胞在所需的条件下进行培养。在本实验中，我们使用冻存的脐带血 CD34+ 细胞。
- 在50 mL离心管中，通过逐滴加入预热的IMDM培养基（含50%胎牛血清（FBS）和0.1 mg/mL....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
自注射后24小时起，可根据实验设计在任意时间点评估经股骨注射细胞的植入情况。在实验终点时，可采集股骨（IF）、骨髓（BM）、外周血（PB）和脾脏。这些样本经处理后，可通过流式细胞术评估植入水平。为了可靠地检测即使处于低水平的人源细胞植入，我们使用了两种不同的抗人CD45抗体（克隆号HI30和克隆号2D1）进行染色。仅当细胞对两种抗体均呈阳性（CD45++）时，才认定其来源于人类。植入阈值设定如下：（% CD45++ + % GlyA+）≥ 0.01%，且在两个门控中均至少检测到30个细胞（图1）7,8。人源细胞向未注射侧骨骼的迁移通常存在延迟。因此，若在8周前处死动物取骨，股骨（IF）中的植入水平很可能高于骨髓（BM）（图2A）。该差异通常在8周后趋于一致（图2B.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
当仅有少量造血干细胞（HSPCs）可用时，股骨内注射在异种移植中是一种有效的工具，与静脉注射相比可提高细胞植入效率。然而，该技术需要较高的操作技巧和训练。在练习过程中，我们建议使用体重范围合适的新生小鼠尸体（见下文），并注射有色染料（如台盼蓝），以便在解剖时能够清楚判断注射是否准确进入股骨且局限于股骨内部（肌肉中不应观察到染料）。在该操作中，有两个关键步骤：体位固定和感知第二根针头在骨髓腔内的正确插入。关于体位固定，尽管本文推荐了一种方法，但具体如何稳定小鼠腿部仍需操作者根据个人习惯优化。例如，我们团队中有一位成员更倾向于从身体对侧固定腿部。在任何情况下，关键在于确保腿部（从而股骨）稳固不动。文中所述用于确认第二根针头是否正确进入股骨的“刮擦感”，类似于触碰到粗糙表面的感觉，但仅通过文字难以进一步描述。大多数操作者在成功练习后通常能非常清晰地感受到这一触感。
在人类造血干细胞（HSC）移植的背景下，经过对四种免疫缺陷小鼠的比较，NSG小鼠是该技术最常用的模型9。然而，自2010年该文章发表以来，已开发出其他可用于股骨内注射的免疫缺陷小.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢 John Dick 博士团队在此方法早期研究中的贡献，以及 Monica Doedens 提供的培训。我们衷心感谢剑桥血液与干细胞生物样本库（Cambridge Blood and Stem Cell Biobank, CBSB），特别是 Joanna Baxter 博士及 CBSB 护理团队在脐带血样本的知情同意与采集工作中给予的支持；感谢我们的样本捐赠者；感谢剑桥大学生物医学服务中心，特别是 Nicolas Lumley 及安妮·麦克莱伦大楼（The Anne McLaren Building）的工作人员，他们为我们小鼠品系的维护和实验提供了支持 体内 实验；Shaaezmeen Basheer 对手稿的编辑。
E.L. 获得惠康信托基金和英国皇家学会联合资助的塞勒·亨利·戴尔研究员项目（107630/Z/15/A）的支持。L.M. 获得Sofinter - HR福利计划的支持。本研究由惠康信托基金（203151/Z/16/Z、203151/A/16/Z、215116/Z/18/Z）和英国研究与创新署医学研究理事会（MC_PC_17230）全额或部分资助。为实现开放获取，作者已对本投稿所产生的任何作者接受手稿版本应用了CC BY公共版权许可。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 mL 胰岛素注射器，带 29 G x 12.7 mm 针头 | BD | 324892 | |
| 1 mL 胰岛素注射器，带 29 G x 0.5" 针头 | BD | 324827 | |
| 1.5 mL 管 | Fisherbrand | 509-GRD-PFB | |
| 3 mL 注射器 | HENKE SASS WOLF GMBH | 4020.000V0 | |
| 5 mL 圆底聚苯乙烯试管，带细胞滤网盖，12 x 75 mm | Falcon | 352235 | FACS 管 |
| 5 mL 圆底聚苯乙烯试管，带 snap 盖，12 x 75 mm | Falcon | 352058 | FACS 管 |
| 27 G 1/2" 针头 | BD | 300635 | |
| 用于 50 mL 管的 40 µm 细胞滤网 | Greiner Bio-one | 542040 | |
| 50 mL 管 | Sarstedt Ltd | 62.547.254 | |
| 96 孔圆底板 | Falcon | 351177 | |
| 酒精棉片 | VITREX MEDICAL A/S | 520213 | |
| BD LSR Fortessa X-20 细胞分析仪 | BD | 流式细胞仪 | |
| 布托啡诺 | Animalcare | XVD190 | |
| CD14/PECy7（克隆 M5E2） | biolegend | 301814 | 使用稀释比例为 1:1000 |
| CD19/Alexa 700（克隆 HIB19） | biolegend | 302226 | 使用稀释比例为 1:300 |
| CD19/FITC（克隆 HIB19） | biolegend | 302206 | 使用稀释比例为 1:200 |
| CD3/APCCy7 （克隆 HIT3a） | biolegend | 300318 | 使用稀释比例为 1:100 |
| CD33/APC（克隆 P67.6） | BD | 345800 | 使用稀释比例为 1:200 |
| CD45/BV510（克隆 HI30） | biolegend | 304036 | 使用稀释比例为 1:500 |
| CD45/PECy5（克隆 2D1） | biolegend | 368526 | 使用稀释比例为 1:300 |
| CompBeads Anti-Mouse Ig，κ/阴性对照补偿微粒套装 | BD | 552843 | |
| 脱氧核糖核酸酶 1（Dnase 1） | Worthington Biochemical | LS002139 | |
| 胎牛血清（FBS） | PAN-Biotech | P40-37500 | |
| 血型糖蛋白 A（GlyA）/PE（克隆 GA-R2） | BD | 340947 | 使用稀释比例为 1:1000 |
| 伊氏改良杜尔贝科培养基（IMDM） | PAN-Biotech | P04-20250 | |
| 异氟烷（IsoFlo 100% w/w 吸入用蒸气，液体） | Zoetis | 115095 | |
| Microvette 300 锂肝素 LH，300 µL | Sarstedt Ltd | 20.1309 | 小鼠血液采集管 |
| NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）小鼠 | Charles River | ||
| 人 Pancoll，密度：1.077 g/mL | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Gibco | 14190169 |
参考文献
- Dancey, J. T., Deubelbeiss, K. A., Harker, L. A., Finch, C. A. Neutrophil kinetics in man. J Clin Invest. 58 (3), 705-715 (1976).
- Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).
- Laurenti, E., Göttgens, B.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
