本报告介绍了一种小鼠结扎线诱导种植体周围炎的实验模型。我们详细描述了所有手术步骤，包括动物的术前和术后管理、拔牙、种植体植入以及结扎线诱导的种植体周围炎的建立过程。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
牙种植体具有较高的成功率和存留率。然而，诸如种植体周围炎（PI）等并发症的治疗极具挑战性。PI 的特征是种植体周围组织发生炎症，并伴随支持骨进行性丧失。为了优化牙种植体在健康和功能方面的长期效果，深入了解种植体周围炎的病理生理机制至关重要。在这方面，研究中使用小鼠模型已被证实能够有效模拟临床情况，具有明显优势。本研究旨在描述一种在小鼠中通过结扎法诱导种植体周围炎的实验模型，并评估该方法在诱导疾病方面的有效性，依据为所观察到的骨组织和软组织变化。实验性种植体周围炎的诱导包括以下步骤：拔牙、种植体植入以及结扎诱导 PI。选取18只3周龄雄性C57BL/6J小鼠作为样本，分为两组：结扎组（N=9）和非结扎对照组（N=9）。对临床、影像学及组织学指标进行了评估。结扎组相较于非结扎组表现出显著更高的骨丧失水平、更明显的软组织水肿以及更显著的根尖上皮迁移。研究得出结论：该临床前模型可在小鼠中成功诱导种植体周围炎。
引言
种植牙作为一种理想的缺牙修复方式，其应用日益广泛1。据预测，到2026年，美国成年人群中种植牙的普及率将上升至23%2。根据Grand View Research（2022年）发布的市场分析报告，2022年全球种植牙市场规模预计达到约46亿美元。此外，预计该市场将以约10%的年均增长率稳步增长，直至2030年3。然而，种植牙的使用也可能引发并发症，例如种植体周围炎。种植体周围炎被定义为一种由生物膜引起的疾病，其特征是种植体周围黏膜发生炎症，并继而出现支持骨的进行性丧失4。
一项系统性综述发现，种植体周围炎在患者水平的平均患病率为19.53%（95%置信区间[CI]，12.87至26.19%），在种植体水平的患病率为12.53%（95% CI，11.67至13.39%）5。由于种植体失败率上升，进而导致高昂的治疗费用，种植体周围炎已成为日益严重的公共卫生问题6。
了解种植体周围炎的发病机制对于制定系统性策略以预防其发生和进展，并最大限度地延长种植体在美学和功能方面的使用寿命至关重要7,8。在此背景下，小鼠模型在牙科研究中的应用已被证明具有诸多优势，因为小鼠与人类共享超过95%的基因9,10，同时存在大量可获取的在线遗传数据库，并且能够模拟临床情况11。上述所有优势使得研究人员能够解析多种疾病的遗传机制12，便于动物的饲养与管理，拥有广泛可用的人类抗体检测面板，并且可利用基因修饰技术（如基因敲除和过表达）进行炎症组织评估和疾病图谱绘制13。尽管具有这些优势，目前针对小鼠种植体周围炎的研究报道仍较少，这主要归因于方法学上的挑战，其中包括微型种植体的获取困难或植入操作的复杂性。
为了在小鼠中建立种植体周围炎模型，已有多种方案被报道，例如结扎线诱导的种植体周围炎、细菌诱导的种植体周围炎14、脂多糖（LPS）诱导的种植体周围炎15，或LPS联合结扎线诱导的种植体周围炎16。本文将重点介绍结扎线模型，因为该方法是目前最广泛接受的诱导牙周炎的方法17,18,19，并且近年来也被广泛用于诱导种植体周围炎20,21。将结扎线置于种植体周围的黏膜下位置，可促进菌斑积聚，从而引发组织炎症。因此，该模型的建立基于一种具有可行成本效益的技术，适用于种植体周围疾病的临床前研究。本研究旨在描述一种在小鼠中通过结扎线诱导种植体周围炎的实验模型，并评估该模型是否能够有效诱导疾病，依据为所观察到的骨组织和软组织变化。
本文的总体目标是报道通过结扎法在小鼠中诱导种植体周围炎的实验方案，并通过组织学评估和种植体周围骨量丧失情况来观察该方法的有效性。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
涉及动物受试者的实验程序已获得加州大学洛杉矶分校校长动物研究委员会（ARC 协议编号 2002-125）以及《动物研究：体内实验报告》（ARRIVE）22 的批准。本方法共使用18只3周龄雄性C57BL/6J小鼠，进行牙齿拔除、种植体植入及种植体周围炎诱导。所有牙科操作均在10×显微镜放大条件下进行，并由经过培训且经过校准的操作人员完成（图1A）。
1. 提取前步骤
- 在符合所有生物安全与防护标准的手术室内进行操作。
- 使用70%异丙醇溶液对所有表面进行三次擦拭以实现无菌处理。
- 使用3%异氟烷对3周龄C57BL/6J雄性小鼠进行麻醉。通过轻触足垫检查其是否无反应，以确认达到足够的麻醉深度。
- 为避免干扰口腔内的操作，使用鼻罩维持异氟烷麻醉。
- 安排辅助操作人员固定动物并保持口腔张开（图1B）。
- 在开始拔牙前，涂抹眼用润滑剂以防止眼睛受到刺激。
图 1：手术装置改进：（A）显微放大装置。（B）改进的吸入式麻醉系统及张口固定装置。请点击此处查看该图的放大版本。
2. 拔牙
- 对于拔牙操作，将5号牙科探针插入第一与第二磨牙之间，通过沿近远中方向移动器械，开始进行牙齿挺出和脱位操作，直至牙齿在牙槽内松动图2A).
- 接下来，将#5探针引入第一磨牙的近中部位。通过将器械在近远中方向移动，直至牙齿在牙槽内松动。
- 抬高后，使用尖头镊子和打结镊子移除1st 摩尔
- 接下来，将牙科探针插入第2个nd 和 3rd 磨牙以挺出并松解第2颗牙nd 摩尔的图2B).
- 然后，使用尖端镊子和/或缝合打结镊子夹住牙齿，将其拔出并移出口腔。图2C).
- 拔牙后，使用无菌棉签确保完全止血图 2D）1 分钟（图2E，F).
- 提取后立即为所有动物给予镇痛药物（卡洛芬/Rimadyl，5 mg/kg），每24小时一次。通过皮下注射给药。
- 此外，将常规食物替换为软食。通过将抗生素（Amoxil 0.25 mg/mL）加入饮水中，经口给予。拔牙后持续给药四周。
图 2：初始拔牙步骤：（A、B）上颌区域的第一和第二磨牙，使用牙科探针进行抬高和松解。（C）使用尖牙钳和探针进行松解及拔除牙齿。（D）止血。（E、F）拔牙后牙槽窝的外观。请点击此处查看该图的放大版本。
3. 植入物放置
- 使用15c刀片，在先前牙齿对应区域的角化组织上做近中-远中向切口。以右侧上颌磨牙作为空间参照（图3A）。
- 使用#5牙科探针掀起颊侧和腭侧的全厚瓣，确保瓣完全抬高（图3B）。
- 使用连接至手用夹针器（手钻）的直径为0.3 mm的碳化钨微型手动钻头，顺时针旋转进行骨凿开术。在愈合后的拔牙窝内创建深度约为1 mm的种植窝（图3C）。
- 将定制设计的、表面光滑的螺钉形种植体（长1.0 mm，直径0.5 mm，由6AL4V钛棒制成）（图3D），每只动物一枚，通过顺时针旋入方式自攻植入左侧上颌第一和第二磨牙区域（图3E-I）。
- 种植体植入后立即通过皮下注射给予镇痛药物（卡洛芬/Rimadyl，5 mg/kg，每24小时一次）。
- 让种植体愈合四周，在此期间按前述方法给予抗生素并进行喂养。
- 在愈合期结束时，确认黏膜伤口已完全闭合，且呈淡粉色外观。
图3：种植体植入顺序：（A）使用安装在手柄上的15c刀片进行切口。（B）使用#5牙科探针形成全厚瓣。（C）使用安装在钢针夹持器上的0.3 mm碳化钨微型手钻进行骨凿开术。（D）钛合金牙科种植体。（E, F）种植体支撑装置和种植体夹持器。（G-I）通过顺时针旋转方式植入种植体。请点击此处查看该图的放大版本。
4. 种植体周围炎诱导
- 在每颗种植体头冠根方立即环绕一根丝线结扎线（6-0），沿种植体表面进行塑形，并用双结固定。保留结扎线两周，以诱导种植体周围炎的发生。
- 每两天检查一次结扎线，确保其仍然存在。若发现脱落，应立即更换新的结扎线。
图4：结扎诱导的种植体周围炎发展过程。（A-D）在种植体颈部周围放置丝线结扎线（6.0）。（E-G）打结固定。（H）剪断结扎线。（I）最终外观。临床图像来自麻醉状态下的活体动物。 请点击此处查看该图的放大版本。
5. 处死
- 在种植体周围炎诱导期（两周）结束后，使用高浓度吸入式异氟烷处死所有动物，随后采用辅助方法：将一根杆状物压入颅底并快速牵拉后肢，使颈椎与颅骨分离。
- 使用锐利器械（如手术剪）分离上颌骨，将动物的整个下颌从身体其余部分分离出来。
- 使用光学显微镜拍摄上颌骨图像，随后将其置于10%福尔马林中固定24小时，再转移至70%乙醇中保存。
6. 微型计算机断层扫描（µCT）
- 按照先前所述方法18,19，使用微型计算机断层扫描（micro-CT）对上颌骨进行扫描。
- 打开扫描仪和计算机，启动扫描软件，点击辐射标志，并等待15分钟以预热设备。
- 通过点击门图标打开设备门。
- 使用四分之一尺寸的旋转台。将上颌骨放置于一个15 ml锥形管上，并将该管固定在旋转台底座中，然后将旋转台安装至设备的螺纹接口上。
- 通过点击门图标关闭设备门。
- 开启X射线源。
- 点击抓取图像图标，确保骨骼位于视野范围内。
- 设置分辨率为10 µm像素大小，X射线能量为55 KVp和181 µA，滤波器为AI 0.5 mm，旋转步进为0.4，平均帧数为10。这些参数将产生约24分钟的预计扫描时间。
- 开始数据采集。
- 进行重建时，打开重建软件。使用20%的射束硬化校正，5%的环形伪影校正，动态范围设为0–0.13。取消选中标签 ON。点击 Preview，选择感兴趣区域的合适视图，并将其保存为TIFF格式。
- 使用数据查看与分析软件对所获得的图像进行定向，使种植体头部的长轴与矢状面和冠状面平行，与轴向面垂直。
- 将矢状面图像单独保存，用于线性骨分析。
- 将轴向切面图像作为数据集保存，用于体积骨分析。
- 使用数据分析软件进行线性骨分析。测量种植体头部与牙槽骨之间在矢状面和冠状面上的距离（单位为毫米），包括近中、远中、颊侧和腭侧位点。
- 使用数据分析软件进行体积骨分析。通过在所有对应骨吸收的切片上绘制感兴趣区域，追踪种植体周围骨量的丢失情况。
7. 统计学分析
- 测量线性和体积微计算机断层扫描骨量丢失，并通过将每个值除以对照组的平均值来对这些数值进行归一化处理。以均值 ± 均值标准误（SEM）的形式展示各组的平均值。
- 采用双因素方差分析（ANOVA）进行显著性比较，随后进行Tukey检验，置信区间为95%（Prism 5）。显著性水平定义如下：p≤0.01**，p≤0.001****。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本方法使用了18只3周龄的C57BL/6J雄性小鼠，进行牙齿拔除、种植体植入及种植体周围炎诱导。每组9只动物，根据线性骨吸收指标，设定统计功效为80%，标准差（σ）为15%，置信区间95%（α=0.05），样本量具有统计学意义。小鼠饲喂软质饮食。 随意摄取 实验过程中，九只小鼠接受结扎（结扎诱导的种植体周围炎-实验组），九只小鼠未接受结扎（对照组）。
种植体骨结合的成功率
遵循四周的愈合周期并观察临床稳定性，本研究中的种植体具有较高的存留率和100%的成功率，因为所有植入的种植体均未发生脱落。未观察到其他不良事件。
临床评估
采用光学显微镜，在处死小鼠后立即通过肉眼观察和临床照片进行临床评估（图5）。与对照组相比，种植体周围炎组在种植体周围观察到炎症、牙周袋形成以及软组织水肿加重的现象。未观察到严重临床表型并发症的证据。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本方案介绍了一种利用小鼠结扎模型诱导种植体周围炎的手术操作的描述性报告。使用小鼠具有多种优势，例如成本较低，且由于存在多种遗传背景，可获得丰富的基因工具资源23，以及其他诸多优点24,25。多年来，已有大量研究在医学和牙科领域成功应用小鼠模型，包括种植体周围炎的研究26,27,28。
不可避免地，应考虑一些缺点，例如体型有限以及上颌/牙齿尺寸较小。在本实验方案中，关键步骤与动物体型相关。尽管这些动物易于获取、操作和维持，但由于其体型较小，实施实验步骤可能给操作者带来一定挑战。为克服这一局限，必须配备两名操作者：一人负责打开动物口腔并固定其身体，另一人同时进行手术操作。
另一个重要...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院/国家牙科与颅面研究所（NIH/NIDCR）项目DE031431资助。我们感谢加州大学洛杉矶分校（UCLA）转化病理学核心实验室在制备脱钙组织切片过程中提供的帮助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| #5 牙科探针 | Hu-Friedy，芝加哥，伊利诺伊州 | 392-0911 | 牙脱位 |
| 15c 刀片和手术刀 | Henry Schein 公司，梅尔维尔，纽约州 | 1126186 | 组织切开 |
| 6-0 丝线结扎线 | Fisher Scientific，新罕布什尔州汉普顿 | NC9201232 | 结扎 |
| 阿莫西林 50μg/mL | 硕腾，加利福尼亚州圣地亚哥 | TS/DRUGS/57/2003 | 口服混悬液 |
| Bacon软质饮食 | Bio Serve®，美国新泽西州弗伦奇敦 | 14-726-701 | - |
| C57BL/6J 雄性小鼠 | 美国缅因州巴港杰克逊实验室 | 000664 | 年龄：3周龄 |
| CTAn 软件 | V.1.16 Bruker，马萨诸塞州比勒里卡 | - | 体积分析 |
| Dolphin 软件 | Navantis，多伦多，加拿大 | - | 线性骨分析 |
| 植入载体 &和提示 | D. P. Machining 公司，La Verne，加利福尼亚州 | 独特产品 | 植入物夹持器 |
| 种植体支持 | D. P. Machining 公司，La Verne，加利福尼亚州 | 独特产品 | 植入物捕获 |
| 异氟烷 | Vet One，爱达荷州博伊西 | NDC13985-528-60 | 吸入性麻醉药 |
| 微型CT扫描 1172 | SkyScan，比利时孔蒂赫 | - | μCT扫描 |
| Nrecon 软件 | Bruker Corporation，马萨诸塞州比勒里卡 | - | 图像重建 |
| Ø 0.3毫米 - 长2.5毫米 微型钻头 | Sphinx，美国伊利诺伊州霍夫曼庄园 | ART. 50699 | 截骨术 |
| Ø 0.5毫米 - 长1.0毫米 钛种植体 | D. P. Machining 公司，La Verne，加利福尼亚州 | 独特产品 | - |
| 眼科润滑剂 | 安大略省阿佩克萨，加拿大 | NDC13985-600-03 | 人工泪液 |
| 手摇钻夹 | 通用工具，Secaucus，新泽西州 | 90 | 截骨术 |
| Rimadyl 50mg/ml | 硕腾，加利福尼亚州圣地亚哥 | 4019449 | 抗炎 |
| 无菌棉签 | Dynarex，Glendale，AZ | 4304-1 | 止血 |
| 尖端镊子 | Fine Science Tools，美国加利福尼亚州福斯特城 | 11071-10 | 拔牙 |
| 持针器 | Fine Science Tools，加利福尼亚州福斯特市 | 18025-10 | 结扎位置 |
参考文献
- Ho, K., et al. A cross-sectional survey of patient's perception and knowledge of dental implants in japan. Int J Implant Dent. 8 (1), 14(2022).
- Elani, H. W., Starr, J. R., Da Silva, J. D., Gallucci, G. O. Trends in dental implant use in the u.S., 1999-2016, and projections to 2026. J Dent Res. 97 (13), 1424-1430 (2018).
- Grand view research. , Available from: grandviewresearch.com/industry-analysis/dental-implants-market (2022).
- Renvert, S., Persson, G. R., Pirih, F. Q., Camargo, P. M. Peri-implant health, peri-implant mucositis, and peri-implantitis: Case definitions and diagnostic considerations. J Clin Periodontol. 45, Suppl 20 S278-S285 (2018).
- Diaz, P., Gonzalo, E., Villagra, L. J. G., Miegimolle, B., Suarez, M. J. What is the prevalence of peri-implantitis? A systematic review and meta-analysis. BMC Oral Health. 22 (1), 449(2022).
- Herrera, D., et al. Prevention and treatment of peri-implant diseases-the efp s3 level clinical practice guideline. J Clin Periodontol. 50, Suppl 26 4-76 (2023).
- Graziani, F., Figuero, E., Herrera, D. Systematic review of quality of reporting, outcome measurements and methods to study efficacy of preventive and therapeutic approaches to peri-implant diseases. J Clin Periodontol. 39, Suppl 12 224-244 (2012).
- Schwarz, F., Derks, J., Monje, A., Wang, H. L. Peri-implantitis. J Periodontol. 89, Suppl 1 S267-S290 (2018).
- Bryda, E. C. The mighty mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research. Mo Med. 110 (3), 207-211 (2013).
- Mouse Genome Sequencing, C. Et al. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 420 (6915), 520-562 (2002).
- Pirih, F. Q., et al. Ligature-induced peri-implantitis in mice. J Periodontal Res. 50 (4), 519-524 (2015).
- Rau, C. D., et al. High-density genotypes of inbred mouse strains: Improved power and precision of association mapping. G3. 5 (10), Bethesda. 2021-2026 (2015).
- Schwarz, F., Sculean, A., Engebretson, S. P., Becker, J., Sager, M. Animal models for peri-implant mucositis and peri-implantitis. Periodontol 2000. 68 (1), 168-181 (2015).
- Varon-Shahar, E., et al. Peri-implant alveolar bone resorption in an innovative peri-implantitis murine model: Effect of implant surface and onset of infection. Clin Implant Dent Relat Res. 21 (4), 723-733 (2019).
- Pirih, F. Q., et al. A murine model of lipopolysaccharide-induced peri-implant mucositis and peri-implantitis. J Oral Implantol. 41 (5), e158-e164 (2015).
- Schwarz, F., et al. Influence of antiresorptive/antiangiogenic therapy on the extension of experimentally induced peri-implantitis lesions. Clin Oral Investig. 27 (6), 3009-3019 (2023).
- Wong, R. L., et al. Comparing the healing potential of late-stage periodontitis and peri-implantitis. J Oral Implantol. 43 (6), 437-445 (2017).
- Wong, R. L., et al. Early intervention of peri-implantitis and periodontitis using a mouse model. J Periodontol. 89 (6), 669-679 (2018).
- Hiyari, S., et al. Ligature-induced peri-implantitis and periodontitis in mice. J Clin Periodontol. 45 (1), 89-99 (2018).
- Nguyen Vo, T. N., et al. Ligature induced peri-implantitis: Tissue destruction and inflammatory progression in a murine model. Clin Oral Implants Res. 28 (2), 129-136 (2017).
- Yuan, S., et al. Comparative transcriptome analysis of gingival immune-mediated inflammation in peri-implantitis and periodontitis within the same host environment. J Inflamm Res. 15, 3119-3133 (2022).
- Berglundh, T., et al. Peri-implant diseases and conditions: Consensus report of workgroup 4 of the 2017 world workshop on the classification of periodontal and peri-implant diseases and conditions. J Periodontol. 89, Suppl 1 S313-S318 (2018).
- Hiyari, S., et al. Genomewide association study identifies cxcl family members as partial mediators of lps-induced periodontitis. J Bone Miner Res. 33 (8), 1450-1463 (2018).
- Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. Animal models for periodontal regeneration and peri-implant responses. Periodontol 2000. 68 (1), 66-82 (2015).
- Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: A review. Open Dent J. 4, 37-47 (2010).
- Erata, E., et al. Cnksr2 loss in mice leads to increased neural activity and behavioral phenotypes of epilepsy-aphasia syndrome. J Neurosci. 41 (46), 9633-9649 (2021).
- Fakih, D., Guerrero-Moreno, A., Baudouin, C., Reaux-Le Goazigo, A., Parsadaniantz, S. M. Capsazepine decreases corneal pain syndrome in severe dry eye disease. J Neuroinflammation. 18 (1), 111(2021).
- Douam, F., Ploss, A. The use of humanized mice for studies of viral pathogenesis and immunity. Curr Opin Virol. 29, 62-71 (2018).
- Lin, P., et al. Application of ligature-induced periodontitis in mice to explore the molecular mechanism of periodontal disease. Int J Mol Sci. 22 (16), (2021).
- Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nat Protoc. 13 (10), 2247-2267 (2018).
- Silva, D. N. A., et al. Probiotic lactobacillus rhamnosus em1107 prevents hyperglycemia, alveolar bone loss, and inflammation in a rat model of diabetes and periodontitis. J Periodontol. 94 (3), 376-388 (2023).
- Kim, Y. G., et al. 6-shogaol, an active ingredient of ginger, inhibits osteoclastogenesis and alveolar bone resorption in ligature-induced periodontitis in mice. J Periodontol. 91 (6), 809-818 (2020).
- Fine, N., et al. Periodontal inflammation primes the systemic innate immune response. J Dent Res. 100 (3), 318-325 (2021).
- Yu, X., et al. Role of toll-like receptor 2 in inflammation and alveolar bone loss in experimental peri-implantitis versus periodontitis. J Periodontal Res. 53 (1), 98-106 (2018).
- Reinedahl, D., Chrcanovic, B., Albrektsson, T., Tengvall, P., Wennerberg, A. Ligature-induced experimental peri-implantitis-a systematic review. J Clin Med. 7 (12), (2018).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
