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利用生物发光报告系统监测类器官中的昼夜节律振荡

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DOI：

10.3791/66381

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2024年2月16日

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Systems Physiology, University of Cincinnati College of Medicine

本文内容

摘要

昼夜节律存在于大多数生物体中，可调控生物过程的时间组织。3D类器官最近已成为一种生理相关性较强的模型系统 体外 模型。本方案描述了使用生物发光报告基因在类器官中观察昼夜节律的方法，从而实现 体外 多细胞系统中昼夜节律的研究

摘要

大多数生物体都具有昼夜节律，这是一种周期约为24小时的生物过程，调控着从睡眠-觉醒周期到代谢等多种细胞和生理活动。该生物钟机制依据环境变化使生物体实现同步化，并协调分子与生理事件的时间调控。以往研究表明，即使在单细胞水平，如NIH3T3成纤维细胞系中，也能维持自主的昼夜节律，这类细胞系在揭示昼夜节律机制方面发挥了重要作用。然而，这些细胞系属于同质化培养，缺乏多细胞性以及强大的细胞间通讯能力。在过去十年中，研究人员已对三维类器官的发育、特征鉴定与应用开展了大量工作，这些类器官 体外 类似于多细胞系统的结构 体内 形态结构与功能。本文描述了一种利用生物荧光报告基因在人肠道类器官中检测昼夜节律的实验方案，该方法可用于研究多细胞系统中的昼夜节律 体外.

引言

昼夜节律钟
所有生物，从细菌到哺乳动物，都与其环境保持着复杂而动态的关系。在这种关系中，适应环境变化对生物的生存至关重要。大多数生物都具有昼夜节律，使其能够适应并优化自身功能以匹配约24小时的昼夜周期。昼夜节律钟是由中枢和外周时钟组成的层级网络，通过协同作用维持生理稳态，并使生物体与每日环境变化保持同步1,2。在哺乳动物中，位于下丘脑视交叉上核（SCN）的中枢或主时钟接收外界线索（如光信号），并通过复杂的神经和体液信号通路将信息传递给外周时钟3。除了中枢时钟外，外周组织自身也具备细胞自主性的昼夜节律机制，该机制由转录-翻译负反馈环路（TTFL）维持，调控组织特异性的时钟控制基因（CCGs）4,5。这一分子机制在细胞和生理事件中产生约24小时的节律性，例如基因表达、信号通路、免疫反应和消化过程。昼夜节律存在于几乎所有的哺乳动物细胞中，已有研究表明，多达50%的基因表达模式呈现昼夜节律性6。鉴于时钟控制基因的广泛存在，该节律机制的紊乱可能导致严重的生理问题。因此，对昼夜节律的研究对于阐明基本的生物学机制以及开发新的治疗策略具有重要意义。

荧光素酶报告系统
在昼夜节律研究中，实时监测对于深入理解细胞行为和响应至关重要，因为它能够追踪基因表达和/或蛋白质水平的时间变化，从而揭示受昼夜节律钟调控的分子机制。此外，实时监测使研究人员能够研究环境变化对分子机制的影响7,8。目前已有多种可用于实时监测的技术，包括生物发光检测，该方法被广泛用于随时间追踪基因表达或蛋白质水平。生物发光检测是一种利用光信号作为读数来检测生物过程的方法。在此检测中，可将产生生物发光的氧化酶（例如荧光素酶）瞬时或稳定地转染至目标细胞中，并在底物（例如荧光素）存在的情况下随时间测量生物发光信号。例如，荧光素酶可在ATP存在下通过氧化底物荧光素产生生物发光9。由于其半衰期较短（约3–4小时）10，萤火虫荧光素酶在昼夜节律研究中是一种强有力的工具，可实现背景噪声极低的实时动态监测11,12,13。为了将带有荧光素酶标记的启动子或开放阅读框（ORF）的DNA插入细胞，慢病毒基因递送系统是一种可靠的方法，具有高效转导、稳定整合和低免疫原性的优点。生物发光报告基因的稳定转导可在分裂和非分裂细胞中实现强健的表达，为昼夜节律研究提供一致的数据14。

类器官作为模型
传统的永生化二维细胞系在生物学研究中发挥了重要作用，从揭示昼夜节律的基本分子机制到药物筛选均有应用。尽管均质化细胞系使用方便，但缺乏多细胞结构和细胞间相互作用。相比之下，类器官具有 体外 三维多细胞 "类器官" 在培养皿中通过表现出与器官结构相似性而模拟器官结构的构造 体内 组织结构与多细胞性，包括干细胞、祖细胞和分化细胞类型15,16具有自组织性、多细胞性和功能性特征的类器官是一种卓越的模型 体外 模拟真实组织中发生的细胞和生理过程的模型17. 可通过定向分化多能干细胞或从多种器官（包括小肠、脑、肝、肺和肾）中分离的成体干细胞来获得不同类型的类器官18,19由于类器官结构具有真实的组织样结构和功能，包含多细胞性及动态的细胞间相互作用，因此在研究细胞事件方面优于均质化的细胞系 体内 组织。类器官也易于操作，并可在受控条件下培养，因此适用于昼夜节律研究20.

本研究的主要目的是介绍一种利用生物发光检测技术进行实时监测的方法，该方法专门针对多细胞三维类器官中的昼夜节律研究而设计。尽管生物发光检测技术已被广泛用于实时监测细胞事件，但以往的研究多集中于缺乏真实组织中多细胞复杂性及细胞间通讯的二维细胞培养体系。三维类器官为研究多细胞系统中昼夜节律的功能提供了独特的机会。 体外例如，可以研究细胞组成改变的类器官或源自患者病变组织的类器官中的昼夜节律。本方案支持利用生物发光检测法，在更接近生理条件的情况下研究昼夜节律的不同方面 体外 模型、类器官，将有助于我们更深入地理解昼夜节律在外周器官中的作用。

方案

使用人体组织生成类器官的所有实验均经辛辛那提儿童医院医疗中心（CCHMC）机构审查委员会批准（IRB#2014-0427）。有关本方案中使用的所有材料的详细信息，请参见材料表。

注意：为了说明本方案中所述的操作流程，我们使用了Bmal1-luc人肠道类器官（HIEs）。这些类器官通过慢病毒稳定转导22携带pABpuro-BluF报告质粒，该质粒包含与荧光素酶融合的Bmal1启动子，可反映Bmal1启动子的活性21。

1. 慢病毒转导

  1. 在肠道类器官（HIEs）的干细胞富集条件下进行慢病毒转导22。具体而言，在肠道生长培养基中传代后3-4天内，确保HIEs形成球状体，以建立干细胞富集的条件。
  2. 慢病毒转导22后，使用2 µg/mL嘌呤霉素进行抗生素筛选，回收嘌呤霉素抗性的HIEs，并以相对较高的密度（即1孔传至2孔）传代2-3次。若HIEs生长速度较慢，可在肠道类器官生长培养基中添加10 µM ROCK抑制剂（Y-27632）和10 µM GSK-3抑制剂（CHIR-99021）。

2. 发光检测法用类器官的制备

  1. 第1天：将HIE传代至35 mm圆形培养皿中。
    1. 简而言之，为了扩增HIE，将HIE与生长因子减少型（GFR）3D培养基质混合，并以每孔3滴、每滴10 µL 3D培养基质的形式接种至24孔板中。每孔加入350 µL HIE生长培养基，并每隔一天更换一次。
      注意：HIE在3D培养基质中的密度对类肠体的生长至关重要。每个液滴中的球状体数量应超过约50个。若数量过低，HIE的生长速率将受到负面影响。
    2. 当HIE生长充分后（传代后约7天），从四个孔中收集HIE至1.5 mL微量离心管中。
    3. 使用冷PBS洗涤HIE，利用台式小型离心机（2,000 × g）快速离心40秒，通过移液去除碎片和过量的3D培养基质。
    4. 向沉淀中加入0.5 mL冷PBS，并使用1 mL胰岛素注射器反复吹打最多10次，以物理方式解离HIE。
    5. 按照步骤2.1.3使用台式小型离心机离心解离后的HIE，轻柔地通过移液去除上清液。然后将含有HIE沉淀的微量离心管置于冰上冷却约3分钟。
    6. 向微量离心管中加入GFR 3D培养基质，并与HIE沉淀混合。
      注意：根据实验所用35 mm圆形培养皿的数量计算所需3D培养基质的用量。通常我们每个圆形培养皿接种30 µL的3D培养基质液滴。
    7. 将HIE与3D培养基质的混合物接种于35 mm圆形培养皿中央，并在37 °C下孵育20分钟，使3D培养基质凝固。
      注意：HIE接种密度应通过实验确定。根据生物发光强度，可在该过程中判断HIE的数量。
    8. 向每个培养皿中加入2 mL预热的肠道类器官生长培养基，并将培养皿置于CO2培养箱中，直至下一步操作。
  2. 第3天：启动分化
    1. 为启动HIE的分化，移除生长培养基，并加入2 mL预热的分化培养基。
      注意：HIE分化培养基的配方见表123。
  3. 第4天：无需额外操作。
  4. 第5天：用2 mL预热的分化培养基更换类肠体的培养基。
  5. 第6天：分子钟同步及生物发光记录
    1. 为同步类肠体的分子钟，向每孔中加入2 µL 100 µM地塞米松（Dex），使终浓度达到100 nM，随后将培养皿置于CO2培养箱（37 °C，5% CO2）中孵育1小时24。
    2. 在Dex重置期间，准备孵育型光度计。检查孵育型光度计的CO2浓度和温度，并分别设置为5%和37 °C。
      注意：建议每次使用仪器前后均用70%酒精擦拭孵育型光度计内部，以保持无菌状态。
    3. 完成时钟同步后，向类肠体补充3 mL含有200 µM D-荧光素酶底物（D-luciferin）的预热分化培养基。
      注意：由于荧光素对光敏感，含荧光素的培养基应用铝箔包裹，并在37 °C水浴中预热后再加入培养皿中。
    4. 将培养皿放入孵育型光度计的8孔样品架中，并盖上样品架盖子。在样品架顶部放置两个装有湿润纸巾或海绵的加湿室。此操作仅需进行一次。
      注意：实验开始后，应始终保持孵育型光度计的盖子关闭，直至实验结束。确保纸巾/海绵充分湿润。
    5. 关闭仪器盖子，并启动程序以设定所需的天数和分辨率进行生物发光检测。
      1. 在软件界面上，点击条件选项卡选择实验条件，并调整该面板中的设置：培养皿数量、测量时间、背景处理和滤光片类型。
        注意：本演示中，我们选择了从A到H的所有培养皿；测量时间采用软件根据培养皿数量自动确定的默认值；设置背景处理等待时间，以及滤光片类型F0。由于存在三种滤光片选项，可同时检测三种发光颜色。
      2. 根据实验需求输入所有合适设置后，点击确定保存设置。
      3. 启动实验运行，点击运行选项卡 | 开始按钮（绿色三角图标）。实验运行期间，在软件屏幕顶部通过适当选择查看原始数据、噪声滤波数据或去趋势数据。点击原始、噪声滤波或去趋势选项卡以查看选定数据。
      4. 持续观察信号最多5天。
        注意：在孵育型光度计中监测5天后，类肠体可能因培养基耗尽而开始死亡。为防止实验期间可能出现的昼夜节律干扰，实验全程不进行培养基更换。
      5. 实验结束时，点击停止按钮（蓝色方块图标）终止运行，进入文件选项卡，点击另存为。将数据保存为Kronos格式；在文件部分点击文件选项，然后选择导出为Excel格式，将数据导出至电子表格以便进一步分析。

结果

通过生物发光记录来评估人肠类器官（HIEs）在两种不同条件下的昼夜节律性：一种是使用肠类器官生长培养基的干细胞富集条件（图3），另一种是通过将肠类器官生长培养基替换为分化诱导培养基实现的分化诱导条件。在实验当天，我们采用100 nM地塞米松处理1小时，以同步昼夜节律钟。随后，将培养基更换为含200 µM D-荧光素的3 mL肠类器官生长培养基或分化培养基，并开始监测生物发光活性。经过4–5天的记录后，采用快速傅里叶变换（FFT）分析确定所观察到的昼夜节律的周期。图3展示了上述条件下Bmal1启动子活性的时间动态变化。在分化诱导条件下，Bmal1-luc生物发光表现出显著的昼夜节律振荡，平均周期为22.92 h；相比之下，在干细胞富集条件下，HIEs的昼夜节律明显紊乱（图3）。这些数据表明，在干细胞富集条件下培养的HIEs不表现出显著的昼夜节律振荡。换言之，在研究类器官中依赖于昼夜节律钟的功能之前，有必要先评估培养条件对昼夜节律的影响。

类器官分化方法；含发光检测的步骤；实验装置示意图
图1：实验方案示意图。 人肠道类器官（HIE）在第1天传代至35 mm培养皿中，并加入2 mL生长培养基培养至第3天。传代后第三天，更换为2 mL预温的分化培养基以启动类器官分化。第5天再次更换为2 mL预温的培养基，以防止营养耗尽。第6天，加入100 nM地塞米松处理1小时，以同步昼夜节律钟。1小时后，更换为含200 µM D-荧光素的3 mL培养基，将培养皿放入恒温发光检测仪中。持续记录4–5天的生物发光信号后，实验结束，所得数据以电子表格形式导出用于进一步分析。缩写：HIE = human intestinal enteroid（人肠道类器官）。 请点击此处查看该图的高清版本。

显微镜、细胞培养类球体、显微图像、细胞生长、形态学分析。
图 2：人肠类器官在生长培养基中的代表性图像。 图像由配备25倍物镜的宽场显微镜拍摄。比例尺 = 1 mm。缩写：HIE = human intestinal enteroid。 请点击此处查看此图的放大版本。

干细胞分化分析，Bmal1:luc 振荡图，时间序列，统计结果
图3来自干细胞富集条件和分化条件下人脑类器官的生物发光记录 (A）原始与（B去趋势化生物发光记录数据 Bmal1-luc 在干细胞富集条件（红色）和分化条件（黑色）下的HIEs。C) 时期 Bmal1-luc 在分化条件下的HIEs中振荡。周期通过FFT分析计算；n = 3 Bmal1-luc 干细胞富集条件下的HIEs，n = 4 Bmal1-luc 分化条件下的HIEs。误差线表示标准差。缩写：HIE = human intestinal enteroid；FFT = Fast Fourier Transform 请点击此处以查看该图的放大版本。

分化培养基配方
试剂名称公司目录编号终浓度备注
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634-028作为最后一个组分加入。若配制50 mL培养基，在加入所有其他组分后，最后用Advanced DMEM/F12补足至50 mL。
A 83-01Sigma AldrichSML0788500 nM
B-27 Supplement (50x)Gibco17504-0441x
Gastrin I HumanSigma AldrichG902010 nM
GlutaMAXGibco350500611x
HEPESGibco1563008010 mM
N-2 Supplement (100x)Gibco17502-0481x
N-Acetyl-L-cysteineSigma AldrichA91651 mM
NOGGIN 条件培养基5%实验室自制
Penicillin-StreptomycinGibco15140122100 U/mL
Recombinant murine EGFPeproTech315-0950 ng/mL
R-SPONDIN 条件培养基10%实验室自制

表1：HIE分化培养基的成分23。

讨论

生物发光检测在昼夜节律研究中具有多项优势，这类研究需要长期时间序列实验的数据采集。首先，该技术使研究人员能够在细胞运动和增殖过程中持续监测目标基因的表达或蛋白质变化。无需进行不必要的调整或干扰细胞功能，即可通过生物发光信号记录感兴趣的细胞事件或基因表达，从而获得可靠的实时数据。尤为重要的是，与荧光检测相比，生物发光检测在持续黑暗条件下进行，背景噪声极低25。此外，对于长期监测而言，生物发光检测更具优势，因为荧光检测在连续数天的激发过程中可能引发显著的光毒性和荧光淬灭。然而，由于无需光激发，生物发光信号强度较荧光蛋白弱26。荧光素酶的半衰期较短，因此更适合用于昼夜节律研究，且可通过添加额外的去稳定序列进一步缩短其半衰期12。

尽管活细胞监测中的生物发光检测具有多项优势，但也存在一些局限性。虽然生物发光检测能够对细胞群体中基因表达或蛋白质动态变化提供可靠的信号读出，但其空间分辨率有限，因此在需要获取单个细胞蛋白质定位数据的实验中应用较为困难。综合考虑其优缺点，生物发光检测在昼夜节律研究中优于其他方法，因其具有较低的毒性及高灵敏度，非常适合长期监测。

在实验准备阶段，必须考虑若干关键因素。首先，慢病毒转导过程中采用合适的筛选策略至关重要；在本实验中，我们使用 2 µg/mL 嘌呤霉素进行为期 2 周的筛选。若筛选操作不当，可能导致携带报告质粒的肠类器官数量不足，从而产生不一致的荧光素酶表达水平。接种密度同样重要；密度过高可能在生物发光记录开始后引发营养物质过早耗尽，因为此阶段不再更换培养基。相反，人肠类器官（HIEs）密度过低可能导致生物发光信号减弱，从而影响检测结果的可靠性。在监测期间为肠类器官提供适宜的环境，是确保实验结果可靠性的基础。维持包括 CO2 浓度、温度和湿度在内的最佳条件，对维持 HIEs 的稳定性至关重要，有助于保障肠类器官内细胞过程的稳健性。偏离最佳温度或 CO2 水平可能影响细胞代谢和信号通路，进而可能干扰昼夜节律。适当的湿度水平同样关键，可防止类器官脱水并维持其结构完整性。因此，对环境条件的精细控制对于肠类器官实验模型的准确性及昼夜节律研究至关重要。

生物钟同步对于昼夜节律研究至关重要，因为它能够使单个细胞的内在生物钟保持一致，确保它们处于统一且协调的状态。这种同步对于在整体培养水平上精确观察和分析昼夜节律性是必要的。在本实验方案中，我们使用100 nM地塞米松（Dexamethasone, Dex）进行生物钟同步。有人可能担心Dex对细胞结构或功能的影响。早期研究表明，皮质类固醇可增强类肠体中的上皮屏障功能27。然而需要强调的是，该表型是在使用10 µM泼尼松龙处理类肠体12小时后观察到的。我们预计，仅用1小时的地塞米松处理不会对类肠体中细胞的结构和功能引起显著变化。

与同源的单细胞培养相比，对类器官培养物的生物发光活性进行监测具有独特优势。首先，类器官培养物中多种细胞类型之间的相互作用与体内情况相似。 体内 组织，而传统的二维细胞培养则是在仅包含单一细胞类型的孤立环境中监测目标基因的表达。类器官培养通过多细胞间的相互作用和信号通路，能够提供更为真实的结果。细胞间的相互作用至关重要，尤其是在细胞分化和细胞间通路研究中，这些研究需要异质性细胞共培养。28我们的结果表明，在分化条件下，HIEs 表现出显著的昼夜节律振荡，而在富集干细胞的条件下昼夜节律则受到破坏。这些数据提示，从成体干细胞向分化细胞转变过程中，昼夜节律钟机制可能发生重构。总之，携带昼夜节律生物荧光报告系统的类器官可实现对多细胞环境中昼夜节律的研究 体外 系统以更符合生理相关性的方式揭示昼夜节律的功能。

披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

人肠道类器官由辛辛那提儿童医院医学中心（CCHMC）Michael Helmrath 博士实验室提供。本研究得到 R01 DK11005（CIH）以及辛辛那提大学癌症中心试点基金的资助。我们感谢辛辛那提大学活体显微成像核心设施（NIH S10OD030402）在成像方面的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
35 x 10 Falcon 组织培养皿费舍尔科学公司08-772A
A 83-01西格玛-奥德里奇SML0788
高级 DMEM/F12 培养基生命技术公司12634-028
B-27 补充剂（50 倍浓缩）吉布科17504-044
BD Micro-Fine IV 胰岛素注射器费舍尔科学公司14-829-1Bb制造商编号：BD 329424
CHIR99021凯曼化学公司13122GSK-3 抑制剂
地塞米松西格玛-奥德里奇D4902-500MG
D-荧光素（钾盐）凯曼化学公司14681
人胃泌素 I西格玛-奥德里奇G9020
GlutaMAX吉布科35050061
生长因子减少型（GFR）Matrigel康宁公司CB-40230C
HEPES吉布科15630080
IntestiCult 类器官生长培养基（人源）干细胞技术公司06010包含 IntestiCult OGM 人源基础培养基 50 mL 和类器官补充剂 50 mL。使用时按 1:1 比例混合，作为肠道类器官生长培养基
Kronos Dio 发光仪阿托株式会社AB-2550
N-2 补充剂（100 倍浓缩）吉布科17502-048
N-乙酰-L-半胱氨酸西格玛-奥德里奇A9165
pABpuro-BluF 报告质粒Addgene46824
不含钙和镁的 PBS康宁公司21-040-CV
青霉素-链霉素吉布科15140122
重组小鼠 EGFPeproTech315-09
Y-27632R&D Systems1254/10ROCK 抑制剂

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