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方法文章

使用球囊导管在自主呼吸小鼠中远程触发左冠状动脉闭塞

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DOI：

10.3791/66386

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2024年3月22日

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1Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven, 2Biomedical MRI, Department of Imaging and Pathology, KU Leuven

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种独特的经胸闭合式小鼠心肌缺血-再灌注损伤（IRI）诱导技术。该方法可在小鼠自主呼吸的同时，远程诱导心肌缺血，从而便于对缺血与再灌注过程中的动态生理变化进行研究。 原位 并实时地 通过 非侵入性成像

摘要

急性心肌梗死（AMI）是一种常见且高死亡率的心血管疾病。尽管针对AMI的再血管化治疗策略已取得进展，但它常导致心肌缺血-再灌注损伤（IRI），从而加重心脏损害。小鼠模型是研究急性损伤和慢性心肌重构的体内重要工具。in vivo。本研究介绍了一种独特的闭胸式技术，可在小鼠体内远程诱导心肌IRI，从而利用MRI或PET等活体成像技术研究缺血与再灌注的极早期阶段。该方案采用远程阻断方法，可在胸腔关闭后精确控制缺血的启动时间。该技术减少了手术创伤，允许动物自主呼吸，并提高了实验的一致性。此技术的独特之处在于可在缺血与再灌注过程中同步进行无创成像，包括超声和磁共振成像（MRI）。这为几乎实时分析组织反应提供了独特机会，有助于深入理解缺血与再灌注期间的生物学过程。本研究对这一创新方法进行了广泛的系统性验证，检测了心肌坏死标志物以评估梗死程度，利用对比增强MRI测定风险区域，并在瘢痕成熟阶段对梗死区域进行染色。通过上述研究，重点强调了该技术工具在推动心肌缺血-再灌注损伤研究方法进步以及加速靶向干预措施开发方面的价值。本文展示了初步研究结果，证实了将该创新实验方案与无创成像技术相结合的可行性。这些初步结果凸显了使用专用动物固定装置在远程诱导心肌缺血的同时同步进行MRI扫描的优势。

引言

急性心肌梗死（AMI）是一种常见的全球性心血管疾病，与高死亡率和高发病率相关1。尽管技术进步已实现对AMI患者早期且有效的再灌注治疗，但患者在接受这些干预措施后仍会出现心肌缺血-再灌注损伤（IRI）2。因此，阐明其基本机制并制定减轻IRI的策略至关重要。IRI是一种复杂的病理生理状态，涉及多种复杂的生物学过程，包括程序性细胞死亡、氧化应激反应、炎症、伤口愈合、纤维化以及心室重构。动物模型（如小鼠）在IRI研究中具有重要意义，因其成本低、繁殖快，以及转基因模型可提供丰富的机制信息，已被广泛使用3。

本方案介绍了一种创新性技术 ，可在胸腔闭合且自主呼吸的小鼠中远程诱导缺血-再灌注损伤（IRI），更贴近人类疾病的病理过程。通过将球囊导管置于远离心肌的位置以阻断左前降支动脉（LAD），实现远程阻断。该方法可在阻断和再灌注的精确时刻持续接触跳动的心脏，便于同步进行多种成像检测，包括超声或磁共振成像（MRI）。这些非侵入性方法可在阻断和再灌注事件发生前、期间及之后，提供有关组织反应的关键信息。

存在多种外科技术可用于在小鼠模型中诱导缺血-再灌注损伤（IRI）。开胸冠状动脉结扎模型中的胸廓切开术所引起的手术创伤会触发免疫反应 ，进而影响与缺血和再灌注相关的多种机制。先天免疫系统的激活可能影响心肌梗死的程度4。本文提出的改良技术为研究心肌的预处理和后处理提供了一种潜在方法，并可能通过将开胸时间缩短至最多5分钟，减少在小鼠IRI研究中先天免疫系统对手术创伤的反应。此外，这种新开发的技术还可能有助于减轻由呼吸机相关性肺损伤引发的促炎性后遗症5。然而，这种新型闭胸方法的综合效应仍需进一步深入研究。

通过与传统方法进行比较，对所提出的技术进行了充分验证。传统方法包括通过外科胸部分离暴露左前降支（LAD），并采用结扎诱导阻塞30分钟。两种技术的结果均进行了比较，包括反映心肌梗死面积的肌钙蛋白检测、利用钆对比增强磁共振成像（MRI）评估风险区域、组织学三苯基四氮唑氯化物（TTC）染色，以及最终瘢痕大小的测定。 通过 偏振红（SR）染色。结果表明，所提出的方法在研究小鼠模型缺血-再灌注损伤方面具有良好的稳健性和有效性。

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方案

本动物实验方案已获得鲁汶天主教大学动物实验伦理委员会（ECD）的批准，并符合该委员会制定的指南和规定。当地ECD制定的所有政策均遵循欧盟关于实验动物福利的法规，即2010/63/EU指令。以下描述的所有实验均在8至12周龄（体重 = 20–23 g）的雄性C57BL/6小鼠上进行。急性实验指动物在手术后立即被处死；生存实验则包括为期四周的随访，期间进行肌钙蛋白检测、磁共振成像（MRI）以及SR染色。

1. 麻醉与气管插管

  1. 使用氯胺酮（7.5 mg/kg；Nimatek 100 mg/mL）、赛拉嗪（1 mg/kg；Rompun, 20 mg/mL）和乙酰丙嗪（0.1 mg/kg；Placivet, 10 mg/mL）混合液（KXA）进行麻醉前给药（参见 材料表用0.9%生理盐水稀释剂进行腹腔注射。这有助于实现更顺畅且侵入性更小的插管操作。
  2. 将小鼠放入诱导室（参见 材料表) 并使用1 L/min流速的纯氧混合2.5%异氟烷诱导麻醉，直至动物失去翻正反射和趾夹反射。
  3. 将动物转移至加热垫（±38 °C）上，仰卧位放置，头部朝向手术者。用胶带固定尾巴和前肢，确保前肢不过度拉伸，以免影响呼吸。
  4. 放置一根2-0丝线缝合线（参见 材料表) 围绕上切牙打结，并将缝线固定在垫片边缘，以拉紧小鼠。必要时，使用持针器维持缝线张力。通过鼻罩以1 L/min的流速给予含2%异氟烷的100%氧气，维持动物麻醉状态。
  5. 将光源置于胸骨前侧稍靠前的位置，取下鼻罩，将异氟烷供给连接至呼吸机。使用镊子提起小鼠舌头，用自制喉镜抬高舌根部以进一步暴露声带，从而进行气管插管。
  6. 使用18 G套管针穿刺钝针，在声门之间置入自制气管插管。将套管向上推进，取出钝针，然后将插管连接至小鼠呼吸机（参见 材料表).
  7. 使用改良的Y型连接器（参见 材料表将插管连接至呼吸机。通过观察胸部扩张是否对称，可确认气管插管位置是否正确。
  8. 将潮气量（mL）设定为体重（BW）（g）× 7，通气频率设定为 53.5 ×（BW（g）-0.26每分钟 strokes 数，并根据需要调整至特定小鼠的体重6 （例如，对于一只25 g的小鼠，潮气量为175 mL，呼吸频率为每分钟140次）。
  9. 将异氟烷浓度在100%氧气中降低至1%，因为动物因预麻醉用药仍会保持麻醉状态。然而，需定期通过夹捏脚趾评估麻醉深度，并根据麻醉深度调整异氟烷浓度。
  10. 涂抹眼用软膏以防止麻醉期间角膜干燥。

2. IRI 工具的安装

注意：移除所有胶带，将动物放置在专用IRI工具的底板上。有关IRI工具特性的详细信息见补充文件1。

  1. 将定制的远程IRI工具底座固定在术者前方的侧向位置。用胶带固定尾巴和足部。使用2-0丝线缝合上切牙以固定头部，防止意外移动（图1）。
  2. 插入直肠温控探头（见材料表）以监测体温，并在动物上方使用红外加热灯维持体温在约37 °C。注意动物与灯之间保持足够距离，避免过热。
  3. 将心电图针状电极插入四肢足部，以观察和记录心率及心电图波形。用胶带将直肠探头和心电图电极固定在平台上。
  4. 在胸部左侧涂抹脱毛膏以去除毛发，建立清晰的手术视野。
    注意：控制脱毛膏作用时间，并注意彻底清除脱毛膏，防止化学灼伤。

3. 开胸术

  1. 使用聚维酮碘溶液对皮肤进行无菌准备，随后在左侧胸壁放置手术巾，以确保无菌环境。使用灭菌器械进行操作。在胸大肌中段做一垂直皮肤切口，长约1 cm，距离左胸骨边缘约 2 mm。
  2. 分离胸大肌以暴露其下方的肋骨。避免意外损伤血管。若发生出血，使用棉签止血。
  3. 观察肋骨并透过薄而半透明的胸壁观察肺部膨胀情况，以识别肋间隙。使用手术剪在第三肋间隙处做一 6–8 mm 的切口，打开胸腔。确保切口距离胸骨边缘至少 2 mm，以避开位于此处的胸廓内动脉。
  4. 将一个小鼠用开睑器（见材料表）插入肋间隙，用作肋骨牵开器（图 1A）。
  5. 用弯头镊子轻轻提起心包并将其拉开。
  6. 将一小块棉球置于肺表面，轻轻向下按压。

4. LAD 准备

  1. 左前降支（LAD）呈鲜红色，从主动脉起始，沿左心耳下方走向心尖。结扎线的理想位置位于左心耳尖端下方约 2 mm 处。以肺动脉干作为标志，帮助识别左心耳，并通过调节入射光优化左前降支的可视化效果（图 2）。
  2. 使用锥形针将一根 7-0 聚丙烯缝合线环绕左前降支。进针不宜过深，以免刺入左心室；也不宜过浅，以免损伤左前降支。
  3. 移除棉片，并检查左肺是否仍保持通气。
  4. 取出肋骨牵开器。
  5. 确保缝合线两端长度均不少于 15 cm。剪除针头。
  6. 将一段 1 mm 的 PE-50 管套在一截 15 mm 的 PE-10 管上（见材料表）。将缝合线的两端穿过 PE-10 管，并将 PE 套管较粗的一端推向心脏。

5. 关闭胸腔与拔管

  1. 在开放的肋间间隙处涂抹适量夫西地酸凝胶，并通过短暂阻断呼吸机的呼气通路，使胸腔内残余气体缓慢排出。可在胸腔引流管外部再添加一些夫西地酸凝胶，以防止空气进入胸腔。
  2. 使用5-0聚丙烯缝线在胸腔引流管上下方作X形缝合，关闭胸肌，并确保引流管的加厚部分位于肌肉层下方。
  3. 在胸腔引流管上方和下方各使用两针5-0聚丙烯缝线作X形缝合，关闭皮肤（图1B 和 图3）。
  4. 胸腔闭合后，动物可恢复自主呼吸。通过逐步降低潮气量和呼吸频率，使动物脱离呼吸机。当动物开始自主呼吸时，小心断开呼吸机管路，但仍将其保留在原位，直至观察到稳定的呼吸节律。
  5. 将异氟烷供气装置连接至鼻罩，并将鼻罩置于动物鼻部上方，固定于底板上。

6. 远程红外工具的组装

  1. 将垂直侧部件插入底板的切口内，固定在底板上。
  2. 使用细钩取出两条缝合线末端，并将其从侧部件后方气囊中央的孔中穿过（参见材料表）。
  3. 将其中一条缝合线末端从气囊上方绕过，另一条缝合线末端则从气囊下方绕过。涂抹夫西地酸软膏以使缝合线引导更顺畅。
  4. 将缝合线末端从侧部件顶部的切口穿出。在缝合线的远端各悬挂2.1 g的重物，以固定每根缝合线末端（图1C 和 图4）。
    注意：合适的配重配置可能需要调整，必须事先进行测试。具体细节请参见补充图1和补充文件1。远程IRI工具的设计详见补充图2。

7. 缺血与再灌注的诱导

  1. 使用血管球囊泵迅速将球囊充气至2 bar以诱导缺血。锁定泵体。目视检查球囊是否已充气且重物是否已被提起（图4）。
  2. 通过观察心电图（ECG）波形的变化来确认缺血状态。
  3. 根据具体研究方案设定的时间保持球囊充气状态（本实验中为30分钟）。
  4. 通过简单解锁泵体来终止阻塞。小心地使球囊放气。目视检查球囊是否已放气且重物是否已下降。

8. 远程红外工具的拆卸

  1. 剪断动物与侧部之间的缝线和导管，小心移除侧部。
  2. 在导管插入胸腔的部位涂抹夫西地酸凝胶。使用弯头镊子轻轻将皮肤推向导管，并用另一把镊子抽出导管。剪除靠近皮肤处残留的缝线。
  3. 在导管出口处额外使用5-0聚丙烯缝线闭合切口，以降低空气进入胸腔的风险。

9. 麻醉结束与恢复

  1. 停止异氟烷供应，让动物在安静、温暖且富氧的环境中苏醒。
  2. 通过观察动物直至完全恢复，确认小鼠无任何呼吸困难。为防止脱水，经腹腔注射0.3 mL无菌生理盐水（体温条件下）。
  3. 术后镇痛应在动物能够自主活动前皮下注射阿片类镇痛药（布托啡诺，0.1 mg/kg）。在给予布托啡诺后的24-48小时内，每4-6小时检查小鼠一次，以确保小鼠对止痛药物有反应，并判断是否需要追加止痛药物。术后应将标准推荐的支持性护理饮食凝胶或糊状食物置于笼底，以提供额外支持。

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结果

通过四项测试验证了诱导缺血的能力：三苯基四氮唑氯化物（TTC）和天狼星红（SR）染色、心肌肌钙蛋白I测定以及延迟钆增强（LGE）磁共振成像。由于样本量有限，采用Mann-Whitney非参数检验评估统计学显著性，以p < 0.05为具有统计学显著性。

急性实验（TTC 染色，n = 15）无技术失败，所有动物均被纳入分析。这些急性实验包括即刻随访实验（心肌肌钙蛋白 I、LGE MRI、天狼星红染色，n = 12），在为期 4 周的观察期间，远端阻断技术和标准阻断技术的存活率分别为 85% 和 80%。

氯化三苯基四氮唑染色
在心肌缺血-再灌注损伤的小鼠模型中，氯化三苯基四氮唑（TTC）染色通过显示脱氢酶活性的丧失，宏观地测量心肌存活性现象。该染色方法有助于区分心脏中仍具存活性（存活）的区域与因缺血而失去活性的区域。存活的心肌组织经TTC染色后呈红色，而缺血区域由于脱氢酶已失去功能，保持苍白或不着色。这为缺血发生后早期评估组织损伤范围提供了重要信息。染色在标准缺血...

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讨论

本研究介绍的新型远程闭塞技术为缺血-再灌注损伤建模领域的研究提供了独特的平台，该技术避免了初始手术过程中对血管的直接操作，并允许对早期再灌注心肌进行同步多模态成像。综合表征结果，包括肌钙蛋白I检测、延迟增强对比磁共振成像（LGE-MRI）、氯化三苯基四氮唑（TTC）染色和磺酰罗丹明（SR）染色显示，该技术与当前的金标准相当即， 开胸LAD结扎9.

与传统的“开放”LAD结扎方法相比，该建议的技术具有多种优势。首先，它将手术期间开胸的时间缩短至仅15分钟，而传统方法则需要缺血阻断时间（30–60分钟）加上手术时间（15分钟）。这种最小化的心脏开胸手术可能减轻组织损伤和炎症反应，但尚需进一步研究证实。此外，早期关闭胸腔可实现呼吸机撤离，从而在缺血-再灌注实验期间允许动物在异氟烷麻醉下自主呼吸。这种方法有望降低呼吸机相关性肺损伤及其引发的炎症反应，同时还能更真实地反映心肌缺血与再灌注的生理学反应10。

此外，远程阻断技术...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

实验在鲁汶大学核心设施“分子小型动物影像中心”（MoSAIC）进行。作者谨此感谢Katarzyna Błażejczyk提供的技术协助。本研究获得了鲁汶大学（C14/20/095）以及弗拉芒研究基金会（FWO G0A7722N）研究资助的支持。M. Algolet由弗拉芒研究基金会 - 弗拉芒研究基金会博士后奖学金（FWO 11A2423N）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-0 丝线缝合线Sharpoint ProductsDC-2515N
5-0 聚丙烯缝合线Ethicon8710H
7-0 聚丙烯缝合线Ethicon8206H
ACCLARENT 球囊扩张装置Johnson&Johnson MedTechBID30
乙酰丙嗪（Acepromazine）Kela
BD Vialon 18 GBD381347
BD Vialon 20 GBD381334
聚维酮碘溶液Purdue Pharma25655-41-8
丁丙诺啡（Buprenex 注射剂）Reckitt Benkiser HealthcareNDC 12496-0757-1
Carp Zoom Styl Knijplood 2.1 g（铅制钓鱼坠）Visdeal.nl
Dumont #3 镊子Fine Science Tools11231-30
Dumont #5 镊子Fine Science Tools11251-30
精细剪刀Fine Science Tools14040-10
夫西地酸凝胶Leo Pharma
异氟烷AbbottNDC 5260-04-05
KD 小鼠/大鼠眼睑撑开器World Precision Instruments501897
KD 小鼠/大鼠眼睑撑开器World Precision Instruments501897
氯胺酮Dechra
光源ZeissKL 1500 LCD
MRI 系统 Bruker BioSpin, Ettlingen, GermanyBioSpec 70/30
0.9% 氯化钠溶液Baxter
夜间红外加热灯Zoo Med Laboratories, Inc.RS-75
ParaVision 软件 Bruker BioSpin版本 6.0.1 
聚乙烯导管 PE-10SAI Infusion technologiesPE-10
聚乙烯导管 PE-50SAI Infusion technologiesPE-50
远程 IRI 工具（PMMA 材质）自制
啮齿类动物手术监护仪Indus instruments
Segment v4.0Medviso, segment.heiberg.seR12067
自门控梯度回波序列 Bruker BioSpin, Ettlingen, GermanyIntraGate, ParaVision 6.0.1
细长型持针器Fine Science Tools12005-15
Sure-Seal 小鼠/大鼠麻醉诱导室World Precision InstrumentsEZ-178
导管连接器，聚乙烯材质，Y 型Westlab072025-0001
Ultraverse 035 PTA 扩张导管：5 mm × 40 mm，17 ATM RBP 球囊，导管长度 130 cmBard Peripheral Vascular, Inc.00801741092671
Veet（脱毛膏）Reckitt Benkiser Healthcare
呼吸机，MiniVent Model 845Hugo Sachs73-0043
VidisicBAUSCH & LOMB PHARMA685313
赛拉嗪Bayer

参考文献

  1. Bryda, E. C. The mighty mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research. Mo Med. 110 (3), 207-211 (2013).
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  12. Kumar, D., et al. Distinct mouse coronary anatomy and myocardial infarction consequent to ligation. Coron Artery Dis. 16 (1), 41-44 (2005).
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