MLH1 基因在结肠癌患者外周血中的表达及其与结肠癌的关联

摘要

本研究采用病例对照方法，探讨外周血中MLH1基因表达与结肠癌之间的关联，通过比较患者与匹配的健康对照者的基因表达水平。

摘要

MutL 同源物 1（MLH1）是异源二聚体复合物 MutLα 的一个组分，能够识别并修复由核苷酸错配引起的碱基-碱基错配和插入/缺失环。在缺乏 MLH1 蛋白的情况下，未修复错配的发生频率增加，从而导致器官癌变。本研究旨在定量分析结直肠癌（CRC）患者血液样本中MLH1基因的表达水平，并探讨其与肿瘤浸润（T）和淋巴结浸润（N）之间的关系。研究共采集了 36 例 CRC 患者的血液样本，提取 RNA 后使用试剂盒合成 cDNA。引物设计采用外显子-外显子连接区方法，利用实时聚合酶链反应（Real-Time PCR）对MLH1和β-actin基因进行三次重复检测。采用基因表达分析软件处理数据，并通过 t 检验分析MLH1基因表达水平及其与 T 和 N 变量的关系。本研究纳入的 36 例结直肠癌患者中，女性 15 例（41.6%），男性 21 例（58.4%），平均年龄为 57.35 ± 4.22 岁，年龄范围为 26 至 87 岁。结果显示，与健康个体相比，患者中MLH1基因表达水平降低，且在疾病不同阶段基因表达的下降具有显著性。本研究结果表明，MLH1基因表达的降低在结直肠癌的发生发展中具有重要作用。

引言

结直肠癌（CRC） 是最常见的癌症类型之一，是全球癌症相关死亡的第四大原因¹。结直肠癌在男性中的发病率高于女性，且在工业化国家的发病率是发展中国家的三到四倍。按年龄标化（全球）计算，每1×10⁵人口中的结直肠癌发病率在两性中为19.7，在男性中为23.6，在女性中为16.3²。流行病学研究显示，结直肠癌与环境因素和生活方式密切相关。肥胖、红肉/加工肉类摄入、吸烟、饮酒、雄激素剥夺治疗以及胆囊切除术均与结直肠癌风险的轻度升高相关^2,3。

染色体不稳定性、微卫星不稳定性以及CpG岛甲基化表型（CIMP）在结直肠癌（CRC）的肿瘤发生中起着重要作用⁴。根据以往研究，已在结直肠癌患者中鉴定出约250种不同的突变，相当于已知与DNA错配修复（MMR）基因相关的突变的约55%。错配修复蛋白的缺陷可由MSH6、MLH1、PMS2和MSH2基因的种系突变引起，其中大多数突变发生在MLH1和MSH2基因中^4,5。在错配修复系统中，通常参与结直肠癌发生的关键蛋白是MLH1。近期研究表明，MLH1表达的任何改变均可能增加结直肠癌的发病风险。MLH1基因的种系突变是林奇综合征（Lynch Syndrome）的致病原因，该综合征是一种遗传性结直肠癌。此外，约13%–15%的散发性结肠癌病例是由于MLH1启动子区域的体细胞高甲基化导致MLH1功能缺失所致^6,7,8。

MLH1 基因位于第3号染色体短臂的22.2位置，包含21个外显子⁹。由MLH1基因编码的蛋白质可与参与错配修复的内切酶PMS2相互作用，形成MutLα复合物，该复合物是MMR系统的一部分。MutLα主要参与碱基-碱基错配以及由于DNA复制不完全而产生的缺失和插入环的修复。此外，该编码蛋白还参与DNA损伤信号传导，并可与MLH3蛋白结合转化为ɣMutL形式，后者参与减数分裂过程中的DNA错配修复^10,11,12。研究表明，MLH1还参与其他重要的细胞活动，包括细胞周期检查点的调控、细胞凋亡、交换重组以及有丝分裂不相容性¹³。

MLH1 基因在DNA错配修复（MMR）系统中发挥关键作用。该基因功能缺陷可导致遗传性突变的累积，进而引发结直肠癌¹⁴。既往研究表明，在结直肠癌（CRC）患者中，约55%与MMR基因相关的突变与MLH1基因突变有关。此外，MLH1基因表达水平降低可导致林奇综合征（Lynch syndrome），这是一种遗传性结直肠癌^15,16。同时，在13%–15%的散发性结直肠癌病例中，已观察到由体细胞启动子高甲基化引起的MLH1基因缺陷¹⁷。这些科学证据表明，MLH1基因在结直肠癌中是一种重要的生物标志物，对其表达水平的分析可提供有关MMR通路功能及CRC遗传风险的有价值信息¹⁸。检测结肠癌患者外周血中MLH1的表达水平，可为MMR通路的功能状态提供重要信息，而该通路在结肠癌中常出现异常。该方法可用于预后评估，并有助于理解结肠癌的遗传易感性^19,20。一项关于中国患者MLH1 415位点G→C突变与散发性结直肠癌关系的研究发现，散发性CRC患者中MLH1 C/C基因型的频率显著高于对照组，提示中国人群中存在对散发性CRC的遗传易感性²¹。另一项研究比较了炎症性肠病（IBD）患者外周血与活检样本中CRC遗传生物标志物的基因表达，强调了外周血基因表达分析在理解结肠癌相关生物标志物方面的潜力²²。

鉴于MLH1基因的重要作用，以及近几十年来通过mRNA表达谱分析进行的研究，癌症的分类已变得更加准确。本研究旨在利用实时PCR定量检测结直肠癌（CRC）患者外周血样本中MLH1基因的表达水平，并探讨其与病理因素、肿瘤向肠壁各层浸润的程度（T分期）以及淋巴结转移程度（N分期）之间的关系。本研究共纳入36例结直肠癌患者，旨在探索基因表达的定量变化是否可作为利用外周血样本进行结直肠癌筛查、预后评估和诊断的生物标志物。

方案

一项病例对照研究于2021年4月至2023年5月在南通大学附属医院2院进行。与医院行政部门合作，建立研究框架。通过向南通大学伦理委员会提交研究方案获得伦理批准。遵循伦理准则，确保保密性和知情同意。

1. 患者招募与研究设计

1. 研究参与者的采样与纳入
   1. 检测36名结肠癌患者外周血中MLH1基因的表达情况，并设立对照组。制定明确的参与者纳入与排除标准。
   2. 招募经诊断患有特定类型结肠癌（包括直肠乙状结肠、盲肠、升结肠、横结肠和降结肠癌，均视为结直肠肿瘤）且已签署知情同意书的个体。
   3. 排除合并其他癌症诊断或可能干扰基因表达分析的疾病的个体。此外，排除在过去3个月内接受过输血、在过去6个月内接受过化疗或放疗、有药物或酒精滥用史，以及有自身免疫性疾病或炎症性肠病史的参与者。
2. 根据TNM（肿瘤、淋巴结、转移）分期系统对临床危险因素进行分类，考虑肿瘤体积、肿瘤大小及对邻近器官的侵犯情况^23,24。
   1. 根据现有的病理档案资料，将不同的癌症分期（0–4期）进行划分。
   2. 将肿瘤在肠壁各层中的生长和进展速率（T指数）分为四个不同组别（T1–4，T0–TX），并将淋巴结侵犯（N指数）分为四组（N1–3，N0–NX）。
3. 建立健康个体组成的对照组。
   1. 在年龄和性别方面使对照组与患者组相匹配。收集每位参与者的详细人口学资料，以确保组间可比性。
4. 知情同意流程
   1. 准备知情同意文件，说明研究的目的、流程及潜在风险。
   2. 与参与者充分沟通，给予其充足时间提出问题。在开始样本采集前，收集签署完毕的知情同意书。

2. RNA 的提取与纯化

1. 外周血样本的采集
   1. 获取 commercially available 的 EDTA 抗凝管，确保其已通过临床或实验室使用认证。核对试管的有效期，并检查试管包装的完整性。
   2. 指导受试者舒适就座。使用无菌注射器从肘前静脉抽取 5 mL 血液。确保受试者处于放松状态，手臂伸直以充分暴露静脉。立即将血液样本转移至准备好的试管中，尽量减少与空气的接触。
   3. 在将样本运送至实验室的过程中，保持样本温度为 4 °C，以维持 RNA 的完整性。
2. 按照制造商说明书，使用 RNA 血液小型试剂盒（RNA blood mini kit）进行 RNA 提取。
   1. 简要步骤：将全血样本与 Buffer EL 在冰上孵育，以裂解红细胞。离心收集白细胞沉淀，并弃去上清液。使用 Buffer RLT 裂解白细胞，并通过 shredder 柱对裂解物进行均质化处理。
   2. 向均质化的裂解物中加入乙醇，转移至离心柱中。用 Buffer RW1 和 Buffer RPE 洗涤离心柱。通过向柱中加入无 RNase 水并离心，洗脱纯化的 RNA。
3. 评估 RNA 的含量与质量
   1. RNA 定量：使用分光光度计测定 RNA 浓度和纯度。打开连接计算机上的软件，在主菜单中选择“核酸”（Nucleic Acid）选项。取 1 µL RNA 样本滴加至检测区域。
   2. 检测 RNA 的纯度与完整性
      注：使用 RNA 血液小型试剂盒纯化的总 RNA 的完整性及大小分布可通过分光光度法和凝胶电泳进行检测。核糖体 RNA 应呈现清晰的条带或峰。28S rRNA 与 18S rRNA 的表观比值应约为 2:1。若特定样本的核糖体条带或峰不清晰，而是向小分子 RNA 方向弥散成 smear 状，则表明该样本在 RNA 纯化前或过程中可能已发生显著降解。
      1. 进行分光光度法测定时，放下仪器臂，点击 测量 以获得 A260/A280 比值。评估 RNA 样本纯度，理想 A260/A280 比值应在 1.8 至 2.0 之间。
      2. 按以下步骤进行 1% 琼脂糖凝胶电泳。
         1. 通过加热使琼脂糖粉末在 TAE 缓冲液中完全溶解，制备 1% 琼脂糖溶液。向琼脂糖溶液中加入溴化乙锭（ethidium bromide），使其终浓度为 0.5 µg/mL。将含溴化乙锭的琼脂糖溶液倒入制胶板中，静置使其凝固。
            注：溴化乙锭是一种荧光染料，可插入 RNA 分子中，使其在紫外光下可见。
         2. 将 RNA 样本与上样染料混合后，小心加入凝固凝胶的加样孔中。以 100 V 电压进行电泳约 30 分钟，按大小分离 RNA 片段。将凝胶置于紫外透射仪或成像系统上观察 RNA 条带，溴化乙锭染色的 RNA 将发出荧光。
4. 提取 RNA 的储存
   1. 取已提取的 RNA 样本，将其分装至无菌微量离心管中，每份体积为 10 µL。将 RNA 分装样本储存于 -80 °C 或更低温度条件下。
5. 将 RNA 反转录为 cDNA
   1. 按照反转录试剂盒说明书操作。将所需试剂在冰上和室温下解冻并准备就绪。
   2. 进行基因组 DNA 消除反应，以去除任何可能的基因组 DNA 污染。
   3. 在冰上配制反转录主混合液，其中包含除模板 RNA 外的所有组分。
   4. 将来自 DNA 消除步骤的模板 RNA 加入反转录主混合液中。将反转录反应在 42 °C 孵育 15 分钟。
   5. 在 95 °C 孵育 3 分钟以灭活反转录酶。可取部分完成的 cDNA 立即用于实时 PCR，或将 cDNA 储存于 -20 °C 以备后续使用。

3. 实时荧光定量 PCR 的引物设计

1. 选择目标基因和内参对照
   1. 选择MLH1基因作为定量目标，因其与结肠癌相关。选择β-actin作为内参对照，用于基因表达数据的标准化。
2. 引物设计过程
   1. 启动引物设计软件，并输入从Ensemble或UCSC基因组浏览器获取的MLH1基因序列。
   2. 设定引物的熔解温度（Tm）为58–60 °C，最佳GC含量为40%–60%，引物长度为18–24个核苷酸。
   3. 将设计好的引物序列输入NCBI BLAST数据库以确认特异性。
      1. 访问BLAST网站，选择Nucleotide BLAST。将引物序列粘贴至搜索框，然后点击BLAST。
      2. 分析结果，确保未预测到脱靶扩增。详见表1。

4. 实时荧光定量 PCR

1. 实时 PCR 反应体系的建立。详见表 2。
   1. 将试剂在 4 °C、10,000 × g 条件下离心 5 分钟，使管内液体沉降至管底。
   2. 根据商业试剂盒说明书配制预混液，其中包含 SYBR Green、缓冲液、dNTPs、MgCl₂ 和 Taq 聚合酶。
   3. 将预混液分装至已标记的 PCR 管中，确保各样品间体积一致。
   4. 向相应 PCR 管中加入适量体积的 MLH1 和 β-actin 正向与反向引物。
   5. 将 RNA 样品稀释至统一浓度（100 ng/µL），然后使用反转录试剂盒将其反转录为 cDNA。
2. 扩增与数据采集
   1. 将 PCR 管放入实时 PCR 仪中。
   2. 设置热循环程序，采用优化的循环条件：95 °C 变性 20 秒，54 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 30 秒。详见表 3。
   3. 设定仪器运行 45 个循环。
   4. 通过仪器的软件界面实时监测反应过程，观察各样品的扩增曲线。
   5. 设置不含 cDNA 的阴性对照以检测是否存在污染。每个样品重复检测 3 次，以确保数据的可靠性。
3. 数据分析
   1. 完成扩增循环后，使用仪器配套软件分析阈值循环（Ct）值，并将 Ct 值导出至电子表格软件进行进一步分析。
   2. 采用 2^-ΔΔCt 法²⁵ 计算相对基因表达量，以 β-actin 作为内参进行数据归一化。

5. 免疫组织化学与遗传学分析

1. 对组织切片进行免疫组织化学染色，以关联MLH1蛋白表达与基因表达水平。
   1. 制备组织切片并加入抗MLH1抗体。
   2. 使用HRP标记的二抗及DAB（3,3'-二氨基联苯胺）底物试剂盒。按照试剂盒说明书进行显色，随后在光学显微镜下观察分析。
2. 进行甲基化特异性PCR及微卫星不稳定性检测，以区分林奇综合征与散发性结直肠癌。
   1. 使用商用DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书分别提取血液和肿瘤组织中的DNA。
   2. 使用亚硫酸氢盐转化试剂盒处理DNA，采用针对MLH1启动子区域设计的甲基化特异性引物进行PCR扩增，操作步骤遵循试剂盒说明书。
   3. 对PCR产物进行凝胶电泳，以观察甲基化状态。
   4. 对于微卫星不稳定性（MSI）检测，使用遗传分析仪进行毛细管电泳，通过分析荧光标记的PCR产物来比较微卫星序列长度。

6. 统计分析

1. 使用商业统计分析软件进行数据分析。
   1. 打开软件并为基因表达和人口统计学数据创建一个新的数据集。
   2. 将相对基因表达值及相应的人口统计学数据输入到数据集中。
   3. 使用 Kolmogorov-Smirnov 检验评估数据的正态性。
      1. 从顶部菜单选择 分析，选择 非参数检验，然后选择 旧对话框。
      2. 点击 Kolmogorov-Smirnov 检验，输入基因表达变量。执行检验并解读结果中分布正态性的显著性水平。
   4. 进行 T 检验以比较患者组与对照组之间 MLH1 基因的表达水平。
      1. 选择 分析，然后选择 比较均值，再选择 独立样本 T 检验。
      2. 将组别（患者或对照）设为分组变量，基因表达设为检验变量。运行检验并解读双尾显著性水平。
   5. 采用 2^-ΔΔCt 法计算基因表达的倍数变化²⁵。

结果

本研究对36例结肠癌患者的外周血中MLH1基因表达水平及其与结肠癌的关系进行了分析。人口学特征分析显示，女性患者15例（41.6%），男性患者21例（58.4%）。患者平均年龄为57.35 ± 4.22岁，年龄范围为26至87岁。患者体重指数（BMI）情况显示，14例患者（38.8%）BMI处于正常范围（18.5至24.9 kg/m²），22例患者（61.2%）BMI不在正常范围内（低于18.5或高于24.9 kg/m²）。结直肠癌病例的组织病理学特征如下：肿瘤分级依据WHO分级系统²⁶，其中12例（33.3%）为高分化，18例（50%）为中分化，6例（16.7%）为低分化。14例（38.9%）存在淋巴血管侵犯，9例（25%）存在神经周围侵犯。所有患者的手术切缘均清晰。肿瘤部位变量的检测结果显示，20个肿瘤（55.5%）位于结肠，16个（45.5%）位于直肠。所有肿瘤中，4个肿瘤（11.1%）直径小于10 mm，32个肿瘤（88.9%）直径大于10 mm（表4）。

讨论

本研究旨在探讨MLH1基因的表达情况。研究结果显示，与健康人相比，患病个体中MLH1基因的表达水平有所降低。根据倍数变化分析表明，与健康人相比，患病个体在II期、III期和IV期时MLH1基因的表达均显著下降。

结直肠癌由于其高发病率和生存率低，已成为全球癌症防治领域的重要问题^3,27。考虑到部分结直肠癌患者的预期寿命甚至不足5年，且癌症患者在诊断后的不同年份中需求各不相同，因此对结直肠癌进行全面研究是一项迫切的需要^28,29。

与此同时，结合临床症状开展完全特异性的分子诊断检测，可有效帮助诊断结直肠癌高风险人群，甚至无临床症状的个体^30,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖凝胶电泳设备	Bio-Rad	Mini-Sub Cell GT Systems	用于检测 RNA 质量
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma-Aldrich	E9884	用作血液样本的抗凝剂
NanoDrop	ThermoFisher Scientific	ND-2000	分光光度计，用于测定 RNA 纯度
实时 PCR 仪	Applied Biosystems	A34322	用于 RT-PCR 反应
RNA 提取试剂盒	Intron Biotechnology Co	#Cat 17061	用于从血液样本中提取 RNA
SYBR Green PCR 试剂盒	Thermo Fisher Scientific	4309155	RT-PCR 实验所用试剂