MLH1 基因在结肠癌患者外周血中的表达及其与结肠癌的关联

摘要

本研究采用病例对照方法，探讨外周血中MLH1基因表达与结肠癌之间的关联，通过比较患者与匹配的健康对照者的基因表达水平。

摘要

MutL 同源物 1（MLH1）是异源二聚体复合物 MutLα 的一个组分，能够识别并修复由核苷酸错配引起的碱基-碱基错配和插入/缺失环。在缺乏 MLH1 蛋白的情况下，未修复错配的发生频率增加，从而导致器官癌变。本研究旨在定量分析结直肠癌（CRC）患者血液样本中MLH1基因的表达水平，并探讨其与肿瘤浸润（T）和淋巴结浸润（N）之间的关系。研究共采集了 36 例 CRC 患者的血液样本，提取 RNA 后使用试剂盒合成 cDNA。引物设计采用外显子-外显子连接区方法，利用实时聚合酶链反应（Real-Time PCR）对MLH1和β-actin基因进行三次重复检测。采用基因表达分析软件处理数据，并通过 t 检验分析MLH1基因表达水平及其与 T 和 N 变量的关系。本研究纳入的 36 例结直肠癌患者中，女性 15 例（41.6%），男性 21 例（58.4%），平均年龄为 57.35 ± 4.22 岁，年龄范围为 26 至 87 岁。结果显示，与健康个体相比，患者中MLH1基因表达水平降低，且在疾病不同阶段基因表达的下降具有显著性。本研究结果表明，MLH1基因表达的降低在结直肠癌的发生发展中具有重要作用。

引言

结直肠癌（CRC） 是最常见的癌症类型之一，是全球癌症相关死亡的第四大原因¹。结直肠癌在男性中的发病率高于女性，且在工业化国家的发病率是发展中国家的三到四倍。按年龄标化（全球）计算，每1×10⁵人口中的结直肠癌发病率在两性中为19.7，在男性中为23.6，在女性中为16.3²。流行病学研究显示，结直肠癌与环境因素和生活方式密切相关。肥胖、红肉/加工肉类摄入、吸烟、饮酒、雄激素剥夺治疗以及胆囊切除术均与结直肠癌风险的轻度升高相关^2,3。

染色体不稳定性、微卫星不稳定性以及CpG岛甲基化表型（CIMP）在结直肠癌（CRC）的肿瘤发生中起着重要作用⁴。根据以往研究，已在结直肠癌患者中鉴定出约250种不同的突变，相当于已知与DNA错配修复（MMR）基因相关的突变的约55%。错配修复蛋白的缺陷可由MSH6、MLH1、PMS2和MSH2基因的种系突变引起，其中大多数突变发生在MLH1和MSH2基因中^4,5<....

方案

一项病例对照研究于2021年4月至2023年5月在南通大学附属医院2院进行。与医院行政部门合作，建立研究框架。通过向南通大学伦理委员会提交研究方案获得伦理批准。遵循伦理准则，确保保密性和知情同意。

1. 患者招募与研究设计

1. 研究参与者的采样与纳入
   1. 检测36名结肠癌患者外周血中MLH1基因的表达情况，并设立对照组。制定明确的参与者纳入与排除标准。
   2. 招募经诊断患有特定类型结肠癌（包括直肠乙状结肠、盲肠、升结肠、横结肠和降结肠癌，均视为结直肠肿瘤）且已签署知情同意书的个体。
   3. 排除合并其他癌症诊断或可能干扰基因表达分析的疾病的个体。此外，排除在过去3个月内接受过输血、在过去6个月内接受过化疗或放疗、有药物或酒精滥用史，以及有自身免疫性疾病或炎症性肠病史的参与者。
2. 根据TNM（肿瘤、淋巴结、转移）分期系统对临床危险因素进行分类，考虑肿瘤体积、肿瘤大小及对邻近器官的侵犯情况^23,24。
   1. 根据现有的病理档案资料，将不同的癌症分期（0–4期）进行划分。
   2. 将肿瘤在肠壁各层中的生长和进展速率（T指数）分为四个不同组别（T1–4，T0–TX），并将....

结果

本研究对36例结肠癌患者的外周血中MLH1基因表达水平及其与结肠癌的关系进行了分析。人口学特征分析显示，女性患者15例（41.6%），男性患者21例（58.4%）。患者平均年龄为57.35 ± 4.22岁，年龄范围为26至87岁。患者体重指数（BMI）情况显示，14例患者（38.8%）BMI处于正常范围（18.5至24.9 kg/m²），22例患者（61.2%）BMI不在正常范围内（低于18.5或高于24.9 kg/m²）。结直肠癌病例的组织病理学特征如下：肿瘤分级依据WHO分级系统²⁶，其中12例（33.3%）为高分化，18例（50%）为中分化，6例（16.7%）为低分化。14例（38.9%）存在淋巴血管侵犯，9例（25%）存在神经周围侵犯。所有患者的手术切缘均清晰。肿瘤部位变量的检测结果显示，20个肿瘤（55.5%）位于结肠，16个（45.5%）位于直肠。所有肿瘤中，4个肿瘤（11.1%）直径小于10 mm，32个肿瘤（88.9%）直径大于10 mm（表4）。

讨论

本研究旨在探讨MLH1基因的表达情况。研究结果显示，与健康人相比，患病个体中MLH1基因的表达水平有所降低。根据倍数变化分析表明，与健康人相比，患病个体在II期、III期和IV期时MLH1基因的表达均显著下降。

结直肠癌由于其高发病率和生存率低，已成为全球癌症防治领域的重要问题^3,27。考虑到部分结直肠癌患者的预期寿命甚至不足5年，且癌症患者在诊断后的不同年份中需求各不相同，因此对结直肠癌进行全面研究是一项迫切的需要^28,29。

与此同时，结合临床症状开展完全特异性的分子诊断检测，可有效帮助诊断结直肠癌高风险人群，甚至无临床症状的个体^30,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖凝胶电泳设备	Bio-Rad	Mini-Sub Cell GT Systems	用于检测 RNA 质量
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma-Aldrich	E9884	用作血液样本的抗凝剂
NanoDrop	ThermoFisher Scientific	ND-2000	分光光度计，用于测定 RNA 纯度
实时 PCR 仪	Applied Biosystems	A34322	用于 RT-PCR 反应
RNA 提取试剂盒	Intron Biotechnology Co	#Cat 17061	用于从血液样本中提取 RNA
SYBR Green PCR 试剂盒	Thermo Fisher Scientific	4309155	RT-PCR 实验所用试剂