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方法文章

激光诱导冲击波在研究爆炸所致耳蜗损伤中的应用

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DOI：

10.3791/66396

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2024年3月1日

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1Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, National Defense Medical College, 2Division of Bioinformation and Therapeutic Systems, National Defense Medical College, 3Department of Biochemistry, National Defense Medical College

本文内容

摘要

本文描述了利用激光诱导冲击波（LISW）建立爆炸所致耳蜗损伤动物模型的实验方案。将颞骨暴露于LISW可重现爆炸引起的耳蜗病理生理变化。该动物模型可为阐明耳蜗病变机制及探索爆炸伤潜在治疗方法提供研究平台。

摘要

耳朵是对爆炸超压最敏感的器官，暴露于爆炸后常发生耳蜗损伤。爆炸暴露可导致感音神经性听力损失（SNHL），这是一种不可逆的听力损失，会严重影响生活质量。既往已有研究详细记录了由爆炸引起的耳蜗病理变化，例如毛细胞丧失、螺旋神经节神经元损伤、耳蜗突触丢失以及静纤毛结构紊乱等。然而，确定爆炸伤后耳蜗感音神经功能的退化具有挑战性，因为暴露于爆炸超压的动物通常会出现鼓膜穿孔（TMP），从而导致同时存在的传导性听力损失。为了评估纯粹的感音神经性耳蜗功能障碍，我们建立了一种基于激光诱导冲击波的爆炸性耳蜗损伤实验动物模型。该方法可避免鼓膜穿孔及伴随的全身性损伤，并能在激光诱导冲击波（LISW）暴露后以能量依赖的方式重现SNHL成分的功能性下降。该动物模型可为阐明爆炸所致耳蜗功能障碍的病理机制及探索潜在治疗方法提供研究平台。

引言

听力损失和耳鸣是最常见的残疾之一，在退伍军人中报告的比例高达62%1。已有研究表明，暴露于爆炸超压的个体可出现多种由爆炸引起的听觉并发症，包括感音神经性听力损失（SNHL）和鼓膜穿孔（TMP）2。此外，针对爆炸暴露人群的研究表明，即使听力阈值处于正常范围，爆炸暴露也常导致听觉时间分辨能力缺陷，这种现象被称为"隐性听力损失（HHL）"3。已有充分证据表明，在与爆炸相关的耳蜗病理中，内毛细胞（IHCs）与听觉神经元（ANs）之间的耳蜗突触存在显著丢失4。突触退化会导致听觉处理功能受损，并是HHL发生的主要因素之一5。因此，听觉器官是包含复杂且高度有序结构的脆弱组织。然而，冲击波在细胞水平上影响内耳的确切机制仍不明确。这主要是由于在实验室环境中难以精确模拟爆炸损伤的临床和力学复杂性，以及爆炸所致耳蜗病理的复杂性所致。

爆炸伤的主要成分为冲击波（SW），其特征是峰值压力迅速且显著升高6。爆炸伤的复杂性已在大量回顾性研究中得到广泛探讨7,8,9。目前存在多种用于产生爆炸的装置，例如压缩气体装置10、冲击管11和小当量炸药12，可在不同压力水平下工作。近年来开发的装置所产生的冲击波压力波形已非常接近真实爆炸的情况。建立爆炸所致感音神经性听力损失动物模型的一个重要原则是尽量减少除听觉损伤以外的并发损伤，以降低动物死亡率。因此，研究人员已开发出微型化冲击管装置，其输出可精确控制，使暴露动物极少死亡。然而，尽管这些动物模型通常会出现鼓膜穿孔（TMP）等并发症，但由于同时存在传导性听力损失，耳蜗功能的评估变得困难2。我们先前曾开展过使用耳塞进行耳部保护的爆炸伤动物研究，结果未发现TMP的发生13。耳塞可部分减轻严重的耳蜗损伤，但无法阻止中枢听觉神经退变或耳鸣的发生。因此，耳塞既能保护耳蜗，也能保护鼓膜。然而，为了研究爆炸伤引起的耳蜗病理生理变化，仍需要建立一种不伴随鼓膜穿孔的纯耳蜗损伤动物模型。

我们先前利用激光诱导冲击波（LISW）建立了大鼠和小鼠内耳的局部爆炸损伤模型14,15。该方法可在标准实验室条件下安全、简便地实施，并已被用于构建肺部和头部爆炸损伤模型16,17。通过改变激光类型和功率，可调节LISW的能量，从而控制耳蜗损伤的程度。LISW诱导的耳蜗损伤模型对于研究爆炸伤所致感音神经性听力损失（SNHL）的机制以及探索潜在治疗方法具有重要价值。在本研究中，我们详细描述了使用LISW建立小鼠爆炸性耳蜗损伤模型的实验方案，并展示了LISW暴露后小鼠耳蜗的退行性变化，包括毛细胞（HCs）、耳蜗突触以及螺旋神经节神经元（SGNs）的丢失，且这些损伤呈能量依赖性。

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方案

所有实验程序均经国防医学院机构动物护理和使用委员会批准（批准号：18050），并依照美国国立卫生研究院及日本文部科学省的指导方针进行。所有努力均旨在尽量减少实验动物数量及其所受痛苦。

1. 动物

  1. 使用8周龄的雄性CBA/J小鼠进行本实验方案。实验前，对小鼠进行听力功能检测及鼓膜内窥镜观察，以确认其听力和鼓膜状态正常。
  2. 将27只CBA/J小鼠分为三组：（1）2.0 J/cm2照射组（n = 9只小鼠）；（2）2.25 J/cm2照射组（n = 9只小鼠）；（3）2.5 J/cm2照射组（n = 9只小鼠）。在LISW照射后1个月，取所有小鼠耳组织进行评估。

LISW 暴露的实验设置

  1. 激光靶标为黑色天然橡胶圆盘，直径10 mm，厚度0.5 mm。为增强LISW冲量，使用丙烯酸树脂焊接胶将一片厚度为1.0 mm的透明聚对苯二甲酸乙二醇酯膜（PET）粘附于靶区顶部。照射532 nm调Q Nd:YAG激光，在靶标后方产生LISW（图1A）。
  2. 使用平凸透镜将激光脉冲聚焦至激光靶标上直径为3.0 mm的光斑。
  3. 利用LISW辐照在两种材料的粘合界面处产生等离子体，并使橡胶汽化（等离子体介导消融），在空腔内留下汽化的橡胶物质。
  4. 使用水听器在水下1.0 mm处测量LISW的压力波，而非在活体组织中测量。将直径0.25 mm的光纤水听器置于黑色橡胶下方、水面以下1.0 mm处，记录LISW压力波形，并通过数字示波器进行测量。
    注意：压力波形表现出稳定特征，其最大压力和冲量相似，如图1B所示。
  5. 所有动物实验均在全身麻醉下进行，腹腔注射盐酸美托咪啶1 mg/kg和氯胺酮75 mg/kg。对小鼠双眼涂抹眼用软膏以防止干燥，并提供保温支持。
  6. 仔细剃除耳后区域毛发，避免毛发中残留空气。将小鼠固定于平板上，并使耳后区域朝垂直向上的方向置于LISW的焦点区域。
  7. 将黑色橡胶靶标经皮贴附于小鼠耳部耳后区域。为确保声阻抗匹配，在激光靶标与皮肤表面之间使用超声耦合凝胶。
  8. 通过颞骨向耳蜗施加单次LISW脉冲。将激光脉冲输出设定为三种能量密度：2.0 J/cm2、2.25 J/cm2和2.5 J/cm2。

3. 耳蜗功能检测

注意：听觉脑干反应（ABR）测试按照先前报道的方法进行14,15。

  1. 在LISW暴露前1天以及暴露后1天和1个月进行ABR测量。
  2. ABR是一种对听觉刺激产生的听觉诱发电位，常用于评估四个频率（12.0 kHz、16.0 kHz、20.0 kHz和24.0 kHz）下的听力阈值。
  3. 通过小型耳机给予刺激声，并使用置于耳机附近的微型麦克风测量小鼠鼓膜附近的声压级。由声源发生器以37 cycles/s输出脉冲刺激，将声压从20 dB声压级（SPL）逐步增加至80 dB SPL，步长为5 dB SPL。
  4. 将不锈钢针电极插入耳道下方及耳部额区用于脑电图记录，并将接地电极插入尾部远端区域。
  5. 通过测量ABR波I（P1）的振幅来评估耳蜗功能。使用ABR峰分析软件，按照先前报道的方法18，自动分析ABR波形的听力阈值和ABR P1振幅。
  6. 通过减去暴露前获得的阈值来计算ABR阈值偏移量。将三个暴露组的ABR阈值偏移量与未暴露的对侧耳（对照组）进行比较。在80 dB SPL刺激期间，利用ABR波形测量ABR振幅。

4. 组织学评估

注意：组织学评估按先前所述方法进行14,15。

  1. 毛细胞与耳蜗突触
    1. 在LISW暴露后1个月进行耳蜗的病理学检查。
    2. 灌注前通过脚趾夹捏确认麻醉深度。用乳酸林格液进行血液灌注后，以每克体重1 mL的4%多聚甲醛（PFA）进行经心灌注。断头后取出耳蜗，并直接用4% PFA灌注，随后在4 °C下固定过夜。
    3. 固定后，在0.5 mol/L乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中振荡脱钙2天。
    4. 将脱钙后的耳蜗分为四段。每段耳蜗在干冰上冷冻10分钟，随后在室温下用含0.3% Triton X的5%正常马血清封闭1小时，以实现通透化。
    5. 使用抗肌球蛋白7a（Myo7A）、抗C末端结合蛋白（CtBP2）和抗神经丝蛋白（NF）抗体作为一抗，在37 °C孵育过夜。分别使用Myo7A、CtBP2和NF抗体评估毛细胞、突触前带状结构和耳蜗神经纤维。
    6. 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤5次，每次3分钟，去除未结合的一抗。将样本在37 °C下与适当的二抗孵育2小时。染色后，用PBS洗涤3次，每次5分钟，并将样本置于载玻片上，用水溶性封片剂加盖盖玻片封片。
    7. 为进行评估，在10倍放大倍数下获取整个耳蜗（分为四段）的图像，并使用参考的ImageJ软件插件计算耳蜗频率图，以精确定位12.0 kHz、16.0 kHz、20.0 kHz和24.0 kHz频率对应的特定耳蜗区域。
    8. 计算各频率下的毛细胞存活率及突触数量。
      1. 为计算毛细胞存活率，统计各频率下每200 µm长度内存活和缺失的毛细胞数量，并利用以下公式（1）计算毛细胞存活率：
        毛细胞存活率 (%) = (存活毛细胞数 / 存活与缺失毛细胞总数) × 100  (1)
      2. 为计算突触数量，使用油浸物镜（63×）、3.1倍数字放大和0.25 µm步长，在共聚焦荧光显微镜下获取内毛细胞区域的高分辨率z轴层扫图像。将图像序列导入ImageJ软件，自动统计每张图像序列中50 µm范围内每个内毛细胞的CtBP2斑点数量。使用公式（2）计算突触带状结构的存活率：
        ​突触带状结构存活率 (%) = (LISW暴露耳的突触带状结构数量 / 对照耳的突触带状结构数量) × 100  (2)
    9. 对于扫描电子显微镜（SEM）分析，按前述方法取出耳蜗，然后在4 °C下用2% PFA和2.5%戊二醛联合固定过夜。在4 °C下用0.5 mol/L EDTA溶液振荡脱钙7天后，将耳蜗解剖为四段，用于整体封片制备。
    10. 在4 °C下用1%四氧化锇固定组织30分钟，室温下依次用50%、70%、80%、95%和100%乙醇各脱水10分钟，进行锇喷镀，然后在5.0 kV电压下用电子显微镜观察，方法如先前报道14。
    11. 利用SEM图像，通过计算各能量组中外毛细胞（OHC）中受损静纤毛的比例（受损OHC静纤毛数量 / 总OHC静纤毛数量），定量分析静纤毛束的破坏情况14。在16.0 kHz和24.0 kHz区域中心每100 µm统计静纤毛数量。将一个或多个排的OHC纤毛束向侧方弯曲、缠结或缺失基部的情况定义为受损。
  2. 螺旋神经节神经元（SGNs）
    1. 为在LISW暴露后1个月定量评估SGN数量，进行4% PBS经心灌注，断头后取出耳蜗，并在上述相同条件下进行后固定。在0.5 M EDTA中脱钙1周。
    2. 脱钙后，将耳蜗在30%蔗糖中浸泡过夜，包埋于冷冻切片包埋剂中，用液氮冷冻，制备厚度为15 µm的近Rosenthal管区域切片，经苏木精-伊红染色后在光学显微镜下观察14。
    3. 为测量SGN密度，统计Rosenthal管中回转区域的SGN数量，并计算相对于对照组的SGN存活率。

5. 统计分析

  1. 使用选定的软件进行统计分析。
  2. 采用双因素重复测量方差分析（ANOVA）["频率或耳蜗部位（顶回/中回/基底回）" × "动物组别"]，以及双因素方差分析（ANOVA），随后进行事后Tukey多重比较检验，分析ABR阈值偏移、毛细胞（HC）、螺旋神经节神经元（SGN）及突触计数的统计学差异。
  3. 所有数据均以均值 ± 标准误表示，统计学显著性水平设定为 p < 0.05。

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结果

LISW 波形
在 2.0 J/cm2 条件下，对 LISW 压力波形的可重复性进行了 5 次测量，结果如下。波形总体相似且稳定，表现为快速上升，其时间宽度、峰值压力和冲量分别为 0.43±0.4 µs、92.1 ± 6.8 MPa 和 14.1 ± 1.9 Pa∙s（中位数 ± 标准差），符合冲击波（SW）的特征（图 1B）。LISW 的特征包括快速上升时间、高峰值压力、持续时间短以及以正压为主。当应用于生物组织时，目标组织通过凝胶直接接触活体组织，可认为施加于组织的冲击波与实测的冲击波特性基本一致。暴露于 LISW 后，使用小型数字内窥镜评估鼓膜穿孔（TMP）的发生情况。在 LISW 能量组中，所有小鼠均未出现鼓膜穿孔（图 1C）。

听觉评估
通过听觉脑干反应（ABR）检查评估听觉功能。ABR 是对听觉通路中声音诱发电位的测量，其中 ABR P1 波代表耳...

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讨论

本研究旨在利用激光诱导冲击波（LISW）验证一种爆炸所致耳蜗损伤的小鼠模型。研究结果表明，通过颞骨施加LISW后，暴露的小鼠耳蜗出现了持续性的病理和生理功能下降，且这种损伤程度随LISW超压的增加而加重。这些结果提示，通过调节LISW输出参数，该小鼠模型适用于复制多种耳蜗病理改变。具体而言，这种由LISW诱导的耳蜗功能障碍小鼠模型因其可控性、可重复性和可量化性，以及能够在受控条件下再现耳蜗的病理生理学衰退过程，有望成为一种良好的耳蜗损伤模型。

我们之前的研究采用大鼠模型，观察到LISW诱导的耳蜗退行性变，包括听阈升高、突触小带丢失以及静纤毛束紊乱14。另一项研究利用两种具有不同特性的冲击波——以低频为主的爆管冲击和以高频为主的LISW——在小鼠中研究了爆炸伤后耳蜗的病理生理学退变过程15。研究确定，冲击波功率谱中的主导频率是决定耳蜗损伤区域的主要因素，这与先前报道一致15。据我们所知，本研究首次详细展示了LISW耳蜗暴露的技术方法，并揭示了...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本研究得到了日本学术振兴会（JSPS KAKENHI）两项基金的资助（基金编号 21K09573（K.M.）和 23K15901（T.K.））。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
532 nm 调Q Nd:YAG激光器 QuantelBrilliant b
ABR波峰分析软件Mass Eye and EarN/AEPL 耳蜗功能检测套件
丙烯酸树脂焊接胶黏剂 Acrysunday Co., LtdN/A
共聚焦荧光显微镜技术LeicaTCS SP8
冷冻切片包埋剂SakuraTissue-Tek O.C.T
CtBP2 抗体BD 转导#612044
多层介质镜SIGMAKOKI CO.,LTDTFMHP-50C08-532M1-M3
数字示波器TektronixDPO4104B
耳机CUICDMG15008-03A
水听器RP声学有限公司FOPH2000
Image J 软件插件美国国立卫生研究院测量线https://myfiles.meei.harvard.edu/xythoswfs/webui/_xy-e693768_1-t_wC4oKeBD
光学显微镜Keyence CorporationBZ-X700
肌球蛋白7A抗体Proteus Biosciences#25–6790 
神经丝抗体Sigma#AB5539
平凸透镜SIGMAKOKI CO.,LTDSLSQ-30-200PM
Prism 软件GraphPadN/Aver.8.2.1
扫描电子显微镜日本电子株式会社JSM-6340F
小型数字内窥镜AVS Co. LtdAE-C1
超声耦合剂日立阿洛卡医疗N/A
可变衰减器昭和欧普特龙有限公司N/A目前可提供的替代型号：KYOCERA SOC Corporation，RWH-532HP II
水溶性封装材料 Dako#S1964

参考文献

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