热塑性微流控通道的制备

摘要

本文演示了如何采用热压印和热封接技术制备热塑性微流控芯片。随后，我们展示了如何通过已封接的芯片进行原位光引导表面接枝与聚合，以形成复合固相柱。

摘要

在本实验室中，我们已成功利用聚合物/纳米颗粒复合微尺度裂解与固相萃取柱，直接从微量及亚微升级别人类血液、尿液和粪便样本中分离出核酸。所获得的样品浓度高、体积小，可直接用于PCR扩增，无需额外纯化步骤。本文中，我们演示如何通过热压印和热封接技术制备热塑性微流控芯片；随后演示如何在密封芯片内通过原位光引导表面接枝与聚合反应，形成复合型固相萃取柱。我们展示了碳纳米管/聚合物复合柱用于细菌细胞裂解的接枝与聚合过程；接着展示在芯片上利用二氧化硅/聚合物复合柱对样本进行裂解及后续核酸的固相萃取。附带的实验方案包含制备裂解柱和固相萃取柱的详细操作步骤。 关键词：核酸提取，微流控芯片，热压印，热封接，原位光引导接枝，聚合反应，碳纳米管/聚合物复合材料，二氧化硅/聚合物复合材料，固相萃取，细胞裂解，微量样本，血液，尿液，粪便，PCR

方案

微流控通道由环状聚烯烃材料（Zeonex® 690R，Zeon Chemical Inc.，Louisville，KY）制成。Zeonex 的玻璃化转变温度（T_g）为 136°C，且具有紫外透明性，这对于多孔整体材料形成过程中所采用的光导向化学反应至关重要。微通道通过微热压印技术制备，使用的是具有微流控平台负形（逆向结构）特征的镍钴电铸主模具。热压印过程操作如下：

1. 将模具和聚合物基底置于两个平行的金属压板之间。
2. 将压板加热至压印温度（166°C），该温度高于Zeonex玻璃化转变温度（T_g）30ºC。
3. 随后将压板压合约5分钟，并保持压力为250 psi。
4. 将模具和基底从加热的压板中取出，冷却1-2分钟后，手动将其彼此分离。
5. 在通道末端钻出直径为1.5 mm的孔，用于样品引入和收集。
6. 将压印后的塑料基底与另一片Zeonex通过热键合形成封闭的微流控通道。在热键合前，可对压印基底和盖片进行紫外-臭氧或等离子体处理，以提高密封效率并确保封闭通道结构的保真度（Bhattacharyya和Klapperich，2007）。

在塑料微流控通道内制备固相萃取（SPE）柱

固相的制备是一个两步过程。首先，对制备好的微通道进行表面修饰，以增强SPE柱与塑料装置之间的粘附性。通过表面光聚合的方法对聚合物微通道的内壁进行功能化修饰。

嫁接操作步骤如下：

1. 微通道中填充由乙二醇二丙烯酸酯（EDA）和甲基丙烯酸甲酯（MMA）按1:1比例混合的溶液，其中含3%的二苯甲酮（一种氢提取型光引发剂）。EDA、MMA和二苯甲酮均购自美国密苏里州圣路易斯市的Sigma-Aldrich公司。
2. 将芯片置于紫外曝光仪（CL-1000 UV Crosslinker，UPV Inc.，美国加利福尼亚州Upland）中，在254 nm波长、200 mJ/cm²能量条件下进行10分钟紫外照射。接枝反应通过氢提取聚合机制进行，形成表面锚定的聚合物链，这些聚合物链将被整合到第二步单一体制备所用的聚合混合物中。
3. 通过使用真空抽吸，以15 μL甲醇冲洗通道，去除未反应的过量单体。

光接枝反应后，微通道内形成一种微孔聚合物整体柱，可截留用于DNA提取的二氧化硅颗粒。 多孔整体柱 已制备 原位 如下所示：

1. 将表面修饰的通道填充单体前驱体混合物，该混合物由BuMA（15% 质量分数）、EDMA（10% 质量分数）、1-十二醇（52.5% 质量分数）、环己醇（22.5% 质量分数）、DMPAP（占单体总质量的1%）以及0.7 μm二氧化硅颗粒（占预聚物混合物体积的15%）组成。二氧化硅微球购自Polysciences, Inc.（Warrington, PA），单体和致孔溶剂购自Sigma-Aldrich, St. Louis, MO。
2. 将芯片置于紫外交联仪中，在200 mJ/cm²条件下照射1.1分钟以引发聚合反应，随后使用真空抽吸法以15 μL甲醇冲洗通道以去除未反应的单体。
3. 然后将流体连接件（NanoPorts^TM连接件，Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA）安装至微流控通道的进样口和收集口。
4. 再使用注射泵以100 mL/小时的流速，用甲醇对多孔整体柱进行至少30分钟的冲洗。

在塑料微流控通道内制备碳纳米管裂解整体柱

CNT（碳纳米管）裂解整体柱的制备分为两个步骤。首先，将制备好的微通道以与塑料装置中固相萃取柱相同的方式进行表面修饰（接枝）。

光接枝反应完成后，微通道内形成了一种含有多壁碳纳米管的微孔聚合物整体柱。 多孔整体柱 已制备 原位 如下所示：

1. 将多壁纳米管在环己醇中重悬，浓度为 2.27M。使用超声波细胞破碎仪（Branson Ultrasonic，美国丹伯里生产，Sonifier S-250D）在 50% 振幅和 50% 占空比条件下超声处理 30 分钟。该超声处理可有效形成稳定浓度为 0.5M 的碳纳米管悬浮液。碳纳米管购自 Nanolabs（美国马萨诸塞州布莱顿）。
2. 表面改性的通道中填充类似的单体前驱体混合物，但此时使用环己醇 + 碳纳米管的溶液。该单体混合物组成为：BuMA（15% 质量分数）、EDMA（10% 质量分数）、1-十二醇（52.5% 质量分数）和环己醇 + 碳纳米管（22.5% 质量分数）。向该溶液中加入光引发剂 DMPAP（占单体总质量的 1.13%）。单体、致孔溶剂和 DMPAP 均购自 Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。
3. 将芯片置于紫外交联仪中，在 120 mJ/cm² 条件下照射 0.9 分钟以引发聚合反应。随后将装置在交联仪中翻转 180 度，并在 120 mJ/cm² 条件下再次照射 0.9 分钟。通过真空抽吸，用 50 μL 甲醇冲洗通道以去除未反应的单体。
4. 将流体连接件（NanoPorts^TM 连接件，Upchurch Scientific，美国华盛顿州奥克港）安装至微流控通道的进样口和收集口。

用于CNT裂解整体柱的细菌样品制备

细菌样品的制备需在600 nm处测定光密度，以确保样品浓度不会过高，从而避免堵塞通道。

1. 使用分光光度计（Eppendorf BioPhotometer，Eppendorf Scientific, Inc.，Westbury, NY）在600 nm处测定菌液的光密度（OD）。将样品稀释至OD读数在0.18–0.25 A范围内。
2. 将样品以6,500 rpm离心5分钟，弃去上清液。

裂解

1. 将细菌重悬于 GuSCN* + 0.01% SDS + 4% 蛋白酶 K（0.8 mg/ml）溶液中。短暂涡旋振荡（培养基中的 1 ml 细菌应重悬于 1 ml GuSCN 溶液中）。添加蛋白酶 K 有助于变性与细菌 DNA 结合的蛋白质，并抑制 DNA 酶和 RNA 酶的活性。蛋白酶 K 的另一个优点是还能帮助降解细胞壁蛋白，这是有益的，因为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁均含有大量蛋白质（尽管革兰氏阴性菌通常含有更多的蛋白质）。变性剂缓冲液可辅助蛋白酶 K 变性蛋白质，而表面活性剂则破坏细胞壁。蛋白酶 K 和硫氰酸胍（GuSCN）购自 Qiagen Inc.（Valencia, CA）。SDS（十二烷基硫酸钠）购自 Pierce（Rockford, IL）。
2. 立即将样品装入连接至 PEEK 管路的注射器中。抽吸注射器，确保系统内无空气。将管路连接至纳米端口和通道。

使用 KDS100 注射泵（由美国马萨诸塞州霍利斯顿 KD Scientific 公司生产）进行实验，所有步骤的流速均为 450 μL/小时。以 450 μL/小时的流速流经样品裂解通道。

1. 采集样本，并通过固相萃取法（SPE）进行DNA提取（参见DNA提取方案）。注意：该细菌样本无需执行上样步骤2，因为其悬浮液为GuSCN*。

DNA 提取方案

提取过程包括以下3个步骤：

1. 上样。
2. 洗涤。
3. 洗脱。

实验中使用 KDS100 注射泵（由美国马萨诸塞州霍利斯顿 KD Scientific 公司生产），所有步骤的流速均为 300 μL/小时。

加载

1. 实验开始前，用变性剂缓冲液（GuSCN^*，硫氰酸胍）对通道进行1-2分钟的预处理。
2. 将样品与变性剂缓冲液按1:1比例混合。
3. 使样品混合物流经通道3分钟。

洗涤

1. 用70%乙醇冲洗通道2分钟。
2. 用100%乙醇冲洗通道2分钟。

洗脱

1. 用 Millipore 水洗脱提取的 DNA，持续 3 分钟。收集 15 μL 纯化后可直接用于 PCR 的 DNA。

*使用了Qiagen试剂盒中的硫氰酸胍（Buffer RLT）。