小鼠眶下神经远端慢性缩窄性损伤可诱导自发行为改变（面部理毛活动增加）以及对触觉刺激的伤害性行为反应（对von Frey纤毛刺激的高反应性），这些表现是持续性疼痛和异常性疼痛的征象，可作为三叉神经病理性疼痛的模型。
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摘要
摘要
动物模型仍是研究神经病理性疼痛的必要工具。本文描述了一种用于研究小鼠三叉神经病理性疼痛的远端眶下神经慢性压迫损伤（DIoN-CCI）模型。内容包括实施慢性压迫损伤的手术操作，以及术后用于评估自发性和诱发性行为改变的行为学测试，这些行为变化是持续性疼痛和机械性异常性疼痛的标志。该方法及行为学检测指标与大鼠眶下神经慢性压迫损伤（IoN-CCI）模型相似。然而，将IoN-CCI模型应用于小鼠时，需进行若干重要改进。首先，将眶内入路改为更靠前的入路，切口位于眼睛与胡须垫之间，从而使眶下神经（IoN）在眶腔外更远端的位置被结扎。其次，由于小鼠的运动活性更高，不再允许其在小笼中自由活动，而是将小鼠置于专门设计和制作的限制性装置中。在DIoN结扎后，小鼠表现出与IoN-CCI大鼠类似的行为变化，即自发性行为改变以及对von Frey纤毛刺激的反应增强，具体表现为定向面部理毛行为增加和对IoN支配区域von Frey纤毛刺激的痛觉过敏。
引言
神经病理性疼痛源于躯体感觉神经系统的损伤，导致感觉信号向大脑的异常传递。躯体感觉神经损伤并不总是引起神经病理性疼痛，但其发生率随着临床神经病变严重程度的增加而升高1,2。神经病理性疼痛患者表现出特定症状，如自发性感觉（烧灼感、针刺感、电击感），以及对无害或有害刺激产生异常强烈或持久的疼痛，这些疼痛往往转为慢性，并对常规镇痛药物治疗产生抵抗3。神经病理性疼痛研究领域的重大进展源于一项发现：在大鼠坐骨神经周围施加轻度缩窄性结扎可引发类似人类神经病理性疼痛的行为表现4。这些动物对热、冷和机械刺激的阈值降低，并表现出伤害性防御行为。尽管人类与啮齿类动物在疼痛处理方面存在固有的生物学差异，动物模型仍是研究神经病理性疼痛发生机制以及检验新提出治疗策略的重要工具。
基于感觉反射的疼痛检测范式已在神经病理性疼痛模型中得到广泛应用，但对持续性疼痛或其他常见伴随症状（如睡眠障碍、抑郁、焦虑）的测量却未受到足够重视，尽管这些是影响生活质量的常见临床症状5,6,7,8。已有研究记录大鼠面部理毛行为，作为眶下神经（IoN）慢性压迫损伤（CCI）后自发性神经病理性疼痛的评估指标9,10。此外，大鼠在IoN支配区域对轻微触觉刺激还会出现反应性增强，提示存在机械性异常性疼痛（mechanical allodynia）。
与小鼠相比，由于大鼠体型较大，更适合进行手术损伤操作。然而，小鼠具有成本低、占用空间小的优势，且所需药物用量更少。此外，转基因技术的发展进一步推动了小鼠的应用11,12。因此，本实验的总体目标是在小鼠中实施类似于大鼠的眶下神经手术损伤，以诱导自发性和诱发性行为的改变，用于三叉神经病理性疼痛的研究。
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方案
动物的处理和护理遵循国际疼痛研究协会（International Association for the Study of PAIN）关于清醒动物疼痛研究的指南，以及佛兰德斯和欧洲动物研究法规和ARRIVE指南。该实验方案已获得机构伦理委员会的批准。
1. 动物
- 使用雄性和雌性 C57BL/6J 小鼠（Janvier，到达时 10 周龄）。
- 将雄性和雌性小鼠分别饲养在标准的实底鼠笼中，置于湿度为40%–60%、室温为21 ± 1 °C的动物饲养室中。
- 提供水和食物 随意摄取.
- 将小鼠置于正常的12小时光照/12小时黑暗循环条件下（光照开启时间为08:00）。
2. 手术
- 每只小鼠准备一段约6 cm长的铬制肠线（6-0），并将其置于无菌生理盐水中，以防止干燥变硬变脆。
- 用氯胺酮/赛拉嗪（75/15 mg/kg，腹腔注射，注射体积为10 mL/kg）对小鼠进行麻醉。通过轻捏脚趾间皮肤检查麻醉深度，确保小鼠腿部无屈曲反应。如有必要，等待动物完全麻醉和/或追加氯胺酮/赛拉嗪。
注意：不应给予辅助镇痛药物，以避免产生预先镇痛效应，从而干扰三叉神经病理性疼痛的发展。 - 轻轻剃除眶下孔前方约4 mm处眼睑与胡须垫之间的颊部毛发，以进行切口。注意避免损伤胡须，以免影响后续行为学测试。
- 将小鼠头部固定于立体定位仪框架中或其他方式固定头部。将小鼠置于加热垫上，或采取其他措施维持其体温。
- 在双眼涂抹药膏以防止干燥。先用酒精擦拭剃毛的头部区域，再用碘伏擦拭。铺上手术巾，暴露剃毛的头部区域。
- 在步骤 2.7 至 2.14 中使用显微镜。
- 在胡须垫边缘与眼睛之间约中点处，于眶下孔稍前方，沿眼睛中心与胡须垫中心连线为基准，做一长度为4 mm、垂直于中线的皮肤切口。
- 通过钝性分离浅层结缔组织暴露眶下神经（IoN）。操作时应注意尽量减少肌肉组织损伤，并避免损伤运动神经纤维。确保在颅骨出口处与分支至须垫之间的区域，眶下神经主干（直径1-1.5 mm）位于约3 mm深度处可及图1).
- 使用旋转动作，将带钩的结扎辅助工具的头部滑入眶下神经（IoN）下方，注意避免损伤神经。
- 将铬制肠线穿过结扎辅助工具尖端的孔洞，并回拉结扎辅助工具，使结扎线保持在下牙槽神经（IoN）下方，且结扎线的两端与IoN的距离大致相等。
- 打结 "滑结" 从结扎线的两端打结，并将结滑向下齿槽神经（IoN），确保滑结操作顺畅，以便精确控制压迫程度。继续滑动结并压迫下齿槽神经，使神经直径略微减小，以可察觉的程度为宜。4在切口结上方打一个单结，以防止其滑动。
- 结扎时保留结扎线两端约1.5 mm的自由端，以防止结松脱。
- 按照步骤 2.2–2.8 进行假手术操作。
- 使用合成可吸收缝线（6-0）缝合皮肤切口，并将动物置于加热垫或红外加热灯下恢复。
3. 行为学测试
- 在术前测试前，将小鼠在饲养环境中适应至少8天。
- 在术前测试前，每天至少一次让小鼠适应测试程序，持续3天。
- 在正常光照条件下进行测试。如有必要，提供背景噪音以减少外界噪音的干扰。
- 面部理毛行为的观察
- 将单只小鼠放入一个无垫料的带盖塑料笼中，从饲养区转移至测试室。运输过程中避免外部刺激。
- 将小鼠置于一个无垫料的带盖透明塑料笼中（长×宽×高：12 cm × 12 cm × 17 cm），并放置在摄像机前方。当小鼠背部朝向摄像机时，使用镜子观察其面部。
- 记录小鼠行为10分钟。记录期间，实验人员不得在房间内。
- 记录下一只动物前，清洁观察笼。
- 由对小鼠实验条件不知情的观察者分析录制的行为视频。
- 在分析10分钟录像时，记录每次面部理毛事件。面部理毛是指动物将前爪接触面部区域的动作模式。
- 区分孤立的面部理毛与身体理毛过程中的面部理毛行为9。如果某一行为序列前后均无身体理毛，则标记为孤立的面部理毛。身体理毛定义为将爪子、舌头或门齿接触除面部或前爪以外身体区域的动作模式。如果面部理毛序列前后存在身体理毛，则该事件标记为身体理毛过程中的面部理毛。
- 采用4秒截断标准确定面部理毛事件的次数。两次理毛动作之间间隔少于4秒定义为单次事件内的暂停；间隔超过4秒定义为两个事件之间的完全中断。
- 机械刺激测试
- 将最多6只小鼠放入带垫料的带盖笼中，从饲养区转移至测试室。同样需注意避免外部刺激。
- 将小鼠逐一放置于桌面上。
- 将小鼠尾巴放入柔软的硅胶夹具中，并通过磁力将夹具固定在桌面上的金属板上。硅胶材料可防止尾巴滑脱，同时尽量减少对尾巴的压力。
- 将一个三面围挡的塑料固定器（65 mm × 25 mm × 23 mm）罩在动物身上，使仅小鼠头部露出容器外。固定器尺寸允许头部和前爪活动，但防止动物在其中转身。最后，在固定器顶部放置重物以保持其位置稳定（图2）。
- 使用一组四种不同强度的von Frey纤维丝。使其弯曲所需的力量分别为0.02 g、0.16 g、0.4 g和1.0 g。
- 让小鼠适应固定器及伸展动作10分钟。每30秒对每只动物进行一次伸展动作。
- 当动物处于放松状态时，缓慢将最轻的von Frey纤维丝施加于眶下神经（IoN）支配区域，靠近须垫中心位置，直至纤维丝弯曲。确保刺激持续时间不超过1秒。
- 根据动物对刺激的反应，将其归入以下反应类别之一进行评分。
- 无反应时评分为0。
- 检测反应评分为1，即小鼠将头转向刺激物并探索该刺激物。
- 回避反应评分为2，即施加刺激时小鼠轻轻将头转离或迅速向后抽动；有时会出现一次同侧面部擦拭动作。
- 攻击反应评分为3，即小鼠攻击刺激物，做出啃咬和/或抓取动作。
- 不对称面部理毛评分为4，即小鼠对受刺激的面部区域连续进行至少三次无中断的洗脸动作。
- 对每只小鼠，按强度递增顺序使用von Frey纤维丝，并随机刺激同侧和对侧区域。每种刺激强度在每侧各施加一次。
- 计算每只小鼠对四种von Frey纤维丝反应得分的平均值。分别计算同侧和对侧的得分。
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结果
DIoN-CCI 小鼠在术后表现出明显的孤立面部理毛时间增加以及孤立面部理毛次数增多（图3）。这种增加在术后第一周最为显著，随后几周逐渐减弱，但在至少6周内仍显著高于术前水平。而在全身理毛过程中的面部理毛行为则基本不受影响。
在DioN-CCI术后第一周内，DIoN-CCI小鼠对同侧IoN区域的同侧机械刺激几乎完全无反应（图4）。在随后的数周内，这种低反应性逐渐转变为高反应性，并持续至少6周。此外，对对侧机械刺激的反应性也可能出现轻微增加。
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讨论
在大鼠中，先前有研究认为，考虑到完整的精细肌肉对控制复杂的触须运动模式在触须触觉分辨中的重要性，以及中线切口与皮肤下眶下神经区域之间的相对距离，经眶入路至眶下神经（IoN）更为可取10。另有研究指出，通过胡须垫后方毛发皮肤处做切口进行远端入路具有多项优势13,14。从外科操作角度看，该技术更为简便且创伤较小；无需使用立体定位仪，手术耗时也更短。两种方法在术后诱发性和非诱发性疼痛行为方面均产生相似的行为学效应。此外，该方法可避免术中移位眶内内容物可能引起的眼部不适，以及神经结扎与眼部之间潜在的刺激性接触。在小鼠中，由于其体型较小，我们发现经眶入路作为常规操作过于困难。因此，本实验旨在采用远端入路方式，在小鼠中手术诱导眶下神经损伤，从而引发自发性和诱发性疼痛行为，用于三叉神经病理性疼痛的研究。
与其它神经结扎诱导的慢性疼痛动物模型一样，应用该模型的关键步骤之一是在眶下神经周围以适当的结扎力度放置结扎线
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披露
作者声明无利益冲突。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 铬制肠线（6-0） | Dynek | CG602D | 结扎线 |
| 棉签棒 | 药房 | ||
| 数码摄像机 | Sony | HDR-CX330E | |
| Dumont #5 镊子 | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont 镊子 - 微钝头尖端 (#5/45) | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| Duratears | Alcon | 0037-820 | 眼科软膏 |
| 钩状结扎辅助工具 | Fine Science Tools | 18062-12 | |
| Ketalar | Pfizer | 氯胺酮（50 mg/mL） | |
| 手术显微镜 | Kaps | SOM 62 | |
| 精密棉签 | Qosina | 10225 | |
| 精密修剪器 | Philips | HP6392/00 | |
| Rompun | Bayer | 赛拉嗪（2%） | |
| 剪刀 - 钝头尖端 | Fine Science Tools | 14574-09 | |
| Semmes-Weinstein Von Frey 感觉测定仪套装 | Stoelting | 58011 | |
| Vicryl Rapide | Ethicon | MPVR489H | 缝合线 |
参考文献
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