我们描述了一种荧光检测方法，可快速且低成本地验证新化合物是否具有螯合铁的能力。该方法通过检测化合物能否竞争性地取代弱铁螯合荧光探针钙黄绿素（Calcein）与铁的结合，从而在发生螯合反应时产生可量化的荧光增强信号。
本文内容
摘要
摘要
癌细胞需要大量铁元素以维持其增殖。铁代谢被认为是癌症的一个重要特征，这使得铁成为抗癌策略中的有效靶点。新型化合物的开发以及先导分子的发现，需要通过机制验证实验来确认其作用。目前已有多种用于评估增殖影响的实验方法；然而，由于设备成本高昂，以及难以快速、可重复地量化螯合能力，化合物螯合铁的能力这一重要终点指标有时会被忽视。本文介绍一种可定量、低成本的无细胞荧光方法，用于验证新型化合物是否具有铁螯合能力。本实验方法依赖于 commercially available 的廉价荧光染料Calcein，其荧光信号可在大多数荧光酶标仪上进行定量检测。Calcein是一种弱铁螯合剂，当其与Fe2+/3+结合时，荧光会被淬灭；当新型螯合剂竞争性地取代Calcein所结合的Fe2+/3+时，荧光得以恢复。荧光淬灭的消除及随之而来的荧光增强，可用于判断新型潜在螯合剂的螯合能力。因此，我们提供了一种低成本、高通量的检测方法，可用于快速筛选新型候选螯合化合物。
引言
与癌症发展相关的细胞表型变化，通过一组共同的异常生物学能力体现，现通常被称为癌症的标志性特征。其中，能量代谢的重编程所导致的变化在癌细胞生物学中十分普遍1。这种代谢重编程包括对铁的需求增加，以支持快速增殖和肿瘤生长2。对铁的这种需求导致铁代谢失调，而铁代谢紊乱本身即被视为癌症的一个标志性特征3,4，且该失调现象存在于各个阶段5。Welch 和 Hurst 近期提出转移的标志性特征，其中也包括铁的作用6，因为铁可诱导氧化应激，进而介导基因组、表观基因组和蛋白质组的改变，从而增加转移的可能性7。流行病学研究已证实铁水平与癌症发生率升高之间存在关联8。
由于癌细胞需要大量铁元素，因此它们对铁缺乏以及铁螯合作用较为敏感。我们近期发表了一篇综述文章，强调了通过NDRG1破坏致癌信号通路，铁螯合在逆转多种癌症特征方面的潜力9。然而，铁螯合作为单一疗法在临床试验中并未取得积极成果，原因在于其毒性、半衰期短、代谢迅速以及逐渐出现的耐药机制。尽管如此，铁螯合剂在体外（in vitro）和体内（in vivo）研究中已显示出一定前景，表明仍需进一步研究以开发出有效的抗癌铁螯合剂。特异性铁螯合是抗癌药物研发中一种已被验证的策略，但迄今为止仅有少数几类化合物被报道具有此类作用10。
鉴定和表征新型铁螯合剂需要能够测量其对多个终点指标的影响。其中许多指标（如增殖、凋亡、活性氧生成）通常可被检测，并已在文献中被概述和综述为评估癌症特征的方法11。在评估新型铁螯合剂时，许多研究团队通常会考察其对抑制增殖和氧化还原活性的影响，以及对铁内流或外流的作用。In silico 预测技术12进一步扩大了可筛选的铁螯合剂数量。
S筛选铁螯合剂需要能够测量其对铁水平的影响，以有效证明其原理的可行性。目前，最常用的方法是流式细胞术。13 成本高、耗时长且难以准确定量。实验方法的选择通常取决于实验设备的可及性、检测速度和成本。因此，由于设备费用高昂以及难以快速、重复地量化螯合能力，铁螯合能力往往被忽视。本文介绍了一种可定量、低成本的无细胞荧光方法，用于验证新型化合物的铁螯合能力。
方案
1. 储备液的配制
- 配制钙黄绿素储备液时，应避光以防止光降解。用不含镁和钙的杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）配制1 mM的钙黄绿素溶液。14对于5 mL的1 mM Calcein溶液，将3.1 mg Calcein（622.5 g/mol）加入5 mL Dulbecco's PBS中。使用1 mM Calcein储备液，在微量离心管中配制1 mL的次级储备溶液，具体方法如下所述。 表1.
- 通过将19 mg硫酸铁铵六水合物（392.1 g/mol）溶解于5 mL杜尔贝科磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）中，配制硫酸铁铵六水合物储备液，得到10 mM硫酸铁铵（FAS）溶液。通过稀释制备FAS的次级储备液。配制2 mM FAS（fA）储备液时，取200 µL 10 mM FAS储备液，加入800 µL杜尔贝科磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）稀释。配制100 µM FAS（fB）储备液时，取50 µL fA储备液，加入950 µL杜尔贝科磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）稀释。
- 配制10 mM去铁酮储备液：将2.8 mg（139.15 g/mol）溶解于2 mL杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）中。通过将10 mM储备液200 µL与800 µL杜氏磷酸盐缓冲液混合，配制2 mM铁螯合剂的次级储备液。
注意：本实验所选用的铁螯合剂应溶于不含镁和钙的杜尔贝科磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）中。以工作示例为例，我们使用了铁螯合剂去铁酮（Deferiprone）。
2. 通过测定钙黄绿素荧光的线性范围进行检测方法验证
- 按照储备液配制表（见表1）配制一系列浓度为1 mM至1 µM的Calcein储备液。将储备液避光保存，以防止光化学降解。
- 使用单通道手动移液器或多通道手动移液器，向96孔板的A至H行、1至12列各孔中加入90 µL磷酸盐缓冲液（PBS）。
- 使用单通道手动移液器，向96孔板第12列A至H行各孔中加入10 µL的1 mM Calcein储备液。
- 使用单通道手动移液器，向96孔板第11列A至H行各孔中加入10 µL预先配制的800 µM Calcein储备液（表1）。
- 按照表1中的储备液依次进行加样，使第10列各孔加入10 µL 400 µM储备液，第9列各孔加入10 µL 200 µM储备液，依此类推，逐步进行至第2列各孔加入10 µL 1 µM储备液。
注意：由于进行了1:10稀释，每孔中Calcein的最终浓度比储备液浓度低10倍。 - 向第1列A至E行各孔中加入10 µL PBS。
- 室温孵育30分钟，并将微孔板检测仪设置为激发波长490 nm、发射波长530 nm（或适用于Calcein荧光检测的滤光片组合）。
3. 通过 Fe2+ 离子淬灭降低钙黄绿素荧光进行检测验证
- 配制10 µM的钙黄绿素（cB）储备液和2 mM的FAS储备液（fA）（参见材料表）。钙黄绿素储备液需避光保存，以防止光降解。
- 使用单通道手动移液器或多通道手动移液器，向96孔板的第2至第10列、A至E行的各孔中加入50 µL PBS。第11列不加PBS。
- 使用单通道手动移液器，向96孔板第11列（A至E行）各孔中加入100 µL 2 mM的FAS储备液（fA）。
- 使用多通道手动移液器，从第11列中吸取50 µL fA溶液，加入已含PBS的第10列各孔中，并通过反复吹打充分混匀。
- 继续在96孔板的第9至第2列、A至E行之间进行逐级双倍稀释操作，并通过移液吹打混匀。
- 从第2列各孔中吸取50 µL溶液并弃入废液容器中。
- 向所有已含溶液的孔（第2至第12列，A至E行）中各加入40 µL PBS。
- 向第1列（A至E行）各孔中加入90 µL PBS。这些孔作为阳性对照，含1 µM钙黄绿素和0 µM FAS。
- 向所有含溶液的孔（第1至第12列，A至E行）中各加入10 µL 10 µM的钙黄绿素储备液（cB）。最终第11列FAS的起始浓度为1000 µM，第10、9、8至第2列的FAS浓度依次减半。各孔最终均含1 µM钙黄绿素和不同浓度的FAS稀释液。
- 向第1至第5列的F行孔中各加入100 µL PBS，作为空白对照；向第6至第10列的F行孔中各加入100 µL 2 mM FAS，作为FAS单独对照。避光、室温孵育10分钟。
- 使用酶标仪检测，设定激发波长为490 nm，发射波长为530 nm（或适用于钙黄绿素荧光检测的滤光片组合）。
4. 铁螯合剂竞争弱螯合剂钙黄绿素结合 Fe2+ 离子能力的定量检测方法
- 按照表1中的说明，配制10 µM的钙黄绿素储备液（cB）、100 µM的FAS储备液（fB）以及2 mM的铁螯合剂储备液。将钙黄绿素储备液避光保存，防止光降解。
- 使用单通道手动移液器或多通道手动移液器，向96孔板的第2至第10列、A至E行各孔中加入50 µL PBS。第11列不加PBS。
- 使用单通道手动移液器，向96孔板第11列A至E行各孔中加入100 µL 2 mM的铁螯合剂储备液（fA）。
- 使用多通道手动移液器，从第11列中吸取50 µL fA，加入至第10列A至E行含有PBS的孔中，并通过反复吹打充分混匀。
- 继续在板上第9至第2列、A至E行进行逐级倍比稀释操作，每步均通过吹打混匀各孔溶液。从第2列中移除50 µL液体并弃去。此步骤确保铁螯合剂（去铁酮）在96孔板第11至第2列、A至E行形成倍比稀释，起始浓度为2 mM。
- 向所有含有溶液的孔（例如第2至第11列、A至E行）中各加入30 µL PBS。
- 使用多通道移液器，向第2至第12列、A至E行各孔中加入10 µL 100 µM FAS储备液（fB）。最终每孔中钙黄绿素浓度为1 µM，FAS浓度为10 µM，螯合剂呈倍比稀释，浓度从第11列至第2列逐列减半，第11列A至E行螯合剂最高浓度为1000 µM。
- 使用多通道移液器，向第2至第12列、A至E行各孔中加入10 µL 10 µM钙黄绿素储备液（cB）。
- 使用移液器向第1列A至E行各孔中加入80 µL PBS、10 µL钙黄绿素储备液（cB）和10 µL FAS储备液（fB），并通过吹打混匀。此组为对照组，含1 µM钙黄绿素和10 µM FAS，不含螯合剂。
- 向F行第1至第5列各孔中加入100 µL PBS。此组为PBS阴性对照。
- 向F行第6至第10列各孔中加入100 µL 2 mM铁螯合剂（去铁酮）。此组为螯合剂单独对照。
- 避光室温孵育10分钟。使用多功能微孔板检测仪进行分析，设定激发波长为490 nm，发射波长为530 nm（或适用于钙黄绿素荧光检测的滤光片组合）。
5. 数据分析
- 通过测定钙黄绿素荧光的线性范围进行检测方法验证的分析。
- 计算96孔板中各列不同钙黄绿素浓度下A-H行的平均相对荧光单位（RFU），并将其对浓度作图。以钙黄绿素浓度为横坐标，平均RFU为纵坐标绘制折线图，并采用线性回归拟合最佳直线。
- 通过将第2至11列的钙黄绿素浓度与第1列A至E行PBS对照组进行比较，量化统计学显著性。进行方差分析（ANOVA），并采用最小显著差异法（LSD）进行事后检验，显著性阈值设为 p <0.001，以确定统计学差异（在图1中以**表示）。
- 通过Fe2+离子淬灭钙黄绿素荧光进行检测方法验证的分析。
- 计算第2至11列中各FAS浓度下A至E行的平均相对荧光单位（RFU）。以各FAS浓度对应的平均RFU为纵坐标作图；横坐标采用Log2 尺度绘制FAS浓度，以便更均匀地分布数据点。使用线性回归拟合最佳拟合直线。
- 通过将每列的平均值与对照组（第1列A至E行，含PBS、1 µM钙黄绿素和0 µM FAS）的平均RFU进行比较，量化统计学显著性。进行方差分析（ANOVA），并采用LSD事后检验，显著性阈值设为 p <0.001，以确定统计学差异。
- 检测分析：量化铁螯合剂竞争弱螯合剂钙黄绿素结合Fe2+离子的能力。
- 计算第2至11列中各螯合剂浓度下A至E行的平均相对荧光单位（RFU）。以各螯合剂浓度对应的平均RFU为纵坐标作图；横坐标采用Log2尺度绘制螯合剂浓度，以便更均匀地分布数据点。
- 通过将每列的平均值与对照组（第1列A至E行，含PBS、1 µM钙黄绿素和10 µM FAS）的平均RFU进行比较，量化统计学显著性。进行方差分析（ANOVA），并采用LSD事后检验，显著性阈值设为 p <0.001，以确定统计学差异。
结果
对于步骤2所示的方法，本首次实验（图1）确定了微量荧光酶标仪在检测钙黄绿素（Calcein）荧光发射时的线性范围。我们具有代表性的实验结果表明，钙黄绿素荧光在0–100 µM范围内具有较宽的线性响应。方差分析（ANOVA）结合LSD事后检验显示，所有钙黄绿素浓度的平均相对荧光单位（RFU）与0 µM钙黄绿素的对照组相比，均存在统计学上的显著差异。在后续实验中，选用1 µM钙黄绿素（步骤3和4），因其相对于0 µM对照组具有统计学显著差异，且处于钙黄绿素乙酰甲酯（Calcein AM）在流式细胞术中常用于细胞染色的典型浓度范围之内13。
对于步骤3所示的方法，我们证明，当以硫酸亚铁铵（FAS）形式添加0–1000 µM范围内的Fe2+至1 µM的钙黄绿素（Calcein）时，Fe2+离子导致钙黄绿素荧光强度（相对荧光单位，RFU）呈线性下降。这可以用于观察基于Fe2+的钙黄绿素荧光淬灭现象。钙黄绿素作为一种弱铁螯合剂，能够结合铁离子，从而降低其荧光信号输出。在图2中，与单独使用1 µM钙黄绿素相比，8.9 µM FAS及以上浓度均显示出钙黄绿素荧光显著降低（p<0.001）。使用8.9 µM FAS时，钙黄绿素荧光强度（平均RFU）下降了33%。在后续实验（步骤4）中，选用10 µM FAS，因其处于钙黄绿素荧光淬灭的有效浓度范围内。
在步骤4所示的方法中，可从图3观察到铁螯合剂对Calcein与Fe2+离子结合的竞争作用。以Fe2+形式存在的铁会降低1 µM对照组中Calcein的荧光强度，而铁螯合剂去铁酮可使荧光增强至峰值，释放铁对Calcein的荧光猝灭效应，从而提高荧光信号（平均相对荧光单位，RFU）。使用去铁酮（作为示例）在0.97–512 µM浓度范围内，经ANOVA分析及LSD事后检验，荧光强度的升高具有统计学显著性（p<0.001）。最大倍数变化出现在螯合剂浓度为62.5 µM时，与1 µM Calcein AM和10 µM FAS的对照组相比，平均RFU升高了3倍。当去铁酮浓度超过512 µM时，螯合剂组与1 µM Calcein和10 µM FAS对照组之间的荧光差异不再具有统计学显著性。
图 1：使用荧光酶标仪测定的钙黄绿素浓度与荧光强度（RFU）。 本图显示了0–100 µM钙黄绿素在30分钟孵育后的荧光强度（RFU）测定结果。数据表示每次实验8个重复的平均值，并包含三次独立实验的结果，误差线表示均值的95%置信区间。统计学显著性以 ** 表示，即通过ANOVA分析及LSD事后检验（使用GraphPad Prism软件计算）得出的p<0.001。各浓度下的平均钙黄绿素RFU值均与PBS对照组及0 µM钙黄绿素组进行比较。请点击此处查看该图的高清版本。
图 2：FAS 浓度增加导致 Calcein 荧光呈线性下降。 将 FAS 浓度从 0 增加至 1000 µM，结果在 PBS 中孵育 30 分钟后，1 µM Calcein 的荧光强度呈线性下降。图中数据为每次实验 5 个重复的平均值，并来自三次独立实验，误差线表示平均值的 95% 置信区间。统计学显著性以 ** 表示，即通过 ANOVA 及 LSD 事后检验（使用 GraphPad Prism 计算）确定的 p<0.001。每个 FAS 浓度下 1 µM Calcein 的平均 RFU 与 PBS 中 1 µM Calcein、0 µM FAS 的对照组进行比较。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：去铁酮浓度递增。 在PBS缓冲液中，去铁酮浓度从0增至1000 µM，同时孵育1 µM Calcein和10 µM FAS。 使用多功能微孔板读板仪检测荧光信号。图中数据为每次实验5个重复的均值，共进行三次独立实验，误差线表示均值的95%置信区间。统计学显著性以 ** 表示，p<0.001，通过ANOVA方差分析及LSD事后检验确定（使用Graph Pad Prism软件计算）。各组的平均相对荧光单位（RFU）均与含1 µM Calcein、10 µM FAS及0 µM去铁酮的PBS组进行比较。 请点击此处查看本图的高清版本。
| 浓度 (μm) | 取自 (1 mM 储备液) 的体积 | PBS 体积 | 总体积 |
| 800 | 800 µL | 200 µL | 1 mL |
| 400 | 400 µL | 600 µL | 1 mL |
| 200 | 200 µL | 800 µL | 1 mL |
| 100 | 100 µL | 900 µL | 1 mL |
| 50 | 50 µL | 950 µL | 1 mL |
| 25 | 25 µL | 975 µL | 1 mL |
| 10 | 10 µL | 990 µL | 1 mL |
| 6 | 6 µL | 994 µL | 1 mL |
| 2 | 2 µL | 998 µL | 1 mL |
| 1 | 1 µL | 999 µL | 1 mL |
表1：钙黄绿素次级储备液的配制。
讨论
癌症对铁的高度依赖使其代谢过程依赖于铁，这使得铁螯合作为治疗方案的补充具有潜在价值4。然而，目前尚缺乏快速筛选新型金属离子螯合剂与铁离子结合能力的有效方法。常用的、广泛可得的荧光探针钙黄绿素（Calcein）可作为弱铁螯合剂，其与铁离子结合后荧光会被淬灭。当使用更强的铁螯合剂与铁离子竞争结合时，荧光则可被恢复。钙黄绿素与铁结合导致荧光降低，而在更强螯合剂作用下荧光恢复，这一特性为快速、简便地筛选具有铁螯合潜力的新化合物提供了方法。尽管基于钙黄绿素的技术13已用于观察螯合剂在细胞内结合铁的能力，但这些技术需要昂贵的流式细胞仪，仅能实现半定量分析，且需要大量人员培训，并使用成本更高的细胞渗透性钙黄绿素形式——钙黄绿素乙酰甲酯（Calcein-AM）。此外，该方法重复性差，难以通过统计分析有效评估数据的显著性。因此，我们建立了一种简单且低成本的体外（in vitro）方法，可用于初步筛选新化合物的铁螯合能力。这种无细胞检测方法避免了在初步高通量筛选铁螯合能力时对昂贵细胞培养技术的依赖。
人们对筛选或开发新型铁螯合剂的兴趣日益增加，这些螯合剂可能通过靶向肿瘤对铁的依赖性来抑制其代谢适应过程2在本文中，我们描述了一种 体外 一种可用于确认新型化合物通过竞争弱螯合剂钙黄绿素而螯合铁的能力的技术。该方法可对新型化合物的铁螯合能力进行简单、定量且经济的筛选。
该实验方案中的一个关键步骤是确定荧光酶标仪的线性范围（图1）。钙黄绿素具有较宽的荧光激发和发射光谱，其激发峰约为501 nm，发射峰在521 nm左右。然而，钙黄绿素的线性范围可能取决于用于激发和检测钙黄绿素荧光发射的滤光片，同时检测所用光电倍增管的线性范围也会部分决定整体的线性检测范围。因此，首先确定钙黄绿素荧光信号呈线性关系的浓度范围至关重要，以确保本实验在荧光酶标仪上对钙黄绿素的检测处于其线性范围内。由于我们观察到钙黄绿素在0至100 mM浓度范围内具有良好的线性关系，表明钙黄绿素具有较宽的线性检测范围。此外，常见的荧光酶标仪通常配备可检测钙黄绿素荧光的滤光片组，因为其光谱特性与一些最常用的绿色荧光染料相似。因此，该检测方法适用于广泛的用户群体。
优先使用FAS作为铁离子供体，因为它提供的是细胞内不稳定铁池中的主要铁离子形式Fe2+。然而，使用提供Fe3+的氯化高铁铵（FAC）也可获得与本文所示相似的结果（图2），相关数据未展示。因此，该检测方法适用于两种氧化还原状态的铁离子，从而拓宽了其在偏好不同氧化还原态铁离子的螯合剂研究中的应用范围。
本研究中，我们提供了铁螯合剂去铁酮（Deferiprone）的数据，但我们也利用该检测方法评估了其他铁螯合剂（包括含羞草氨酸，Mimosine）在与钙黄绿素竞争结合铁离子方面的能力（数据未显示）。该检测方法的一个局限性在于，当去铁酮浓度高于512 mM时，与对照组（1 µM 钙黄绿素和10 µM FAS）相比，荧光强度未出现具有统计学意义的升高。目前尚不清楚为何螯合剂浓度更高时并未导致荧光增强，尽管其他螯合剂也观察到了类似现象（数据未显示）。然而，理想的先导治疗化合物应在<100 µM浓度下发挥作用，因此本检测方法所采用的浓度范围符合先导化合物有效性评估的要求。
因此，该检测可用于快速筛选任何潜在的铁螯合剂是否具有螯合铁的能力，以验证其作用机制。这是在进行昂贵且费时的细胞实验或体内实验之前筛选新型螯合剂的重要第一步。该检测的一个局限性在于其使用水相溶剂进行，因此要求螯合剂必须可溶于水性缓冲液。然而，鉴于本研究中使用的最高浓度为10 mM的去铁酮（Deferiprone），而该物质是一种小分子脂溶性铁螯合剂15，因此仍可对水溶性有限的螯合剂进行测试。
综上所述，本文所述的检测方法可能在新型铁螯合剂的筛选中具有重要价值，而铁螯合剂的开发是当前癌症治疗研究持续关注的重点方向。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢诺森比亚大学提供的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 六水合硫酸亚铁铵 | Sigma-Aldrich | 215406 | 又称FAS |
| 钙黄绿素 | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| 去铁酮 | Sigma-Aldrich | 379409 | |
| Dulbecco′磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | D5652 | 无镁无钙 |
| Greiner CELLSTAR 96孔板 | Sigma-Aldrich | M0812 | 任何光学透明的96孔板均可使用 |
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