可量化且廉价的无细胞荧光方法，用于确认新型化合物螯合铁的能力

摘要

我们描述了一种荧光测定法，它可以快速且廉价地确认新型化合物螯合铁的能力。该测定法测量化合物超过弱铁螯合荧光探针钙黄绿素的铁结合活性的能力，从而导致螯合发生时荧光的可量化增加。

摘要

癌细胞需要大量的铁来维持其增殖。铁代谢被认为是癌症的标志，使铁成为抗癌方法的有效靶点。新化合物的开发和进一步修饰的先导化合物的鉴定需要进行机制验证分析。有许多测定方法可以评估对增殖的影响;然而，由于设备成本高昂，并且难以快速且可重复地量化螯合强度，因此螯合铁的能力是一个重要且有时被忽视的终点指标。在这里，我们描述了一种可量化且廉价的无细胞荧光方法，以确认新化合物螯合铁的能力。我们的检测依赖于市售的廉价荧光染料钙黄绿素，其荧光可以在大多数荧光微量滴定板读数仪上进行定量。钙黄绿素是一种弱铁螯合剂，其荧光在结合 Fe^2+/3+ 时被淬灭;当新型螯合剂在结合的 Fe^2+/3+ 上竞争钙黄绿素时，荧光会恢复。去除荧光淬灭和由此产生的荧光增加可以确定新型推定螯合剂的螯合能力。因此，我们提供了一种廉价、高通量的检测方法，可以快速筛选新的候选螯合剂化合物。

引言

通过一组常见的生物学能力改变与癌症发展相关的细胞表型变化现在通常被称为癌症的标志。其中包括能量代谢重编程引起的变化，这在癌细胞生物学中很普遍¹。这种代谢重编程包括对铁的需求增加，以支持快速增殖和肿瘤生长²。这种对铁的渴求导致铁代谢失调，这本身就被认为是癌症的标志 ^3,4，^失调发生在所有阶段⁵。Welch 和 Hurst 最近提出的转移标志包括铁⁶ 的作用，因为铁可以诱导氧化应激，这反过来又可以介导基因组、表观基因组和蛋白质组的变化，从而增加转移的可能性⁷。流行病学研究已证明铁水平与癌症发病率增加之间存在联系⁸。

由于癌细胞需要大量的铁，因此它们容易缺铁，因此容易发生铁螯合。我们最近发表了一篇综述文章，强调了铁螯合通过 NDRG1 破坏致癌信号通路逆转癌症几个特征的潜力⁹。然而，由于其毒性、半衰期短、代谢快和新兴的耐药机制，使用铁螯合作为独立的癌症治疗尚未在临床试验中产生积极结果。尽管如此，铁螯合剂在 体外 和 体内 研究中显示出前景，这表明需要更多的工作来开发用于癌症治疗的有效铁螯合剂。特异性铁螯合是抗癌药物发现中经过验证的策略，但迄今为止仅报道了几类¹⁰。

新型铁螯合剂的鉴定和表征需要能够测量它们对多个终点的影响。其中许多（如增殖、凋亡、活性氧形成）是常规测量的，并且已在文献中作为评估癌症特征的方法进行概述和审查¹¹。在评估新型铁螯合剂时，许多小组会定期检查其对抗增殖和氧化还原活性的影响，以及对铁内流或外流的影响。 计算机 预测技术¹² 进一步增加了可以筛选的铁螯合剂的数量。

铁螯合剂的 S开发需要能够测量它们对铁水平的影响，以此作为有效证明原理的手段。目前，最常见的方法是流式细胞术¹³，该方法成本高昂、耗时且难以量化。检测的选择通常基于实验设备的可用性、检测的速度和成本。因此，由于设备成本高昂，并且难以快速且可重现地量化螯合强度，因此螯合铁的能力可能是一个被忽视的终点指标。在这里，我们描述了一种可量化且廉价的无细胞荧光方法，以确认新型化合物螯合铁的能力。

方案

1. 储备液制备

1. 制备钙黄绿素储备液时，通过将溶液置于黑暗中来防止光降解。在 Dulbecco 的 PBS 中制备 1 mM 钙黄绿素溶液，不含镁或钙¹⁴。对于 5 mL 的 1 mM 钙黄绿素溶液，将 3.1 mg 钙黄绿素 （622.5 g/M） 添加到 5 mL 的 Dulbecco PBS 中。使用 1 mM 钙黄绿素袜，在微量离心管中制备 1 mL 等分试样的二级储备溶液，如 表 1 中所述。
2. 通过将 19 mg FAS 六水合物 （392.1 g/M） 溶解在 5 mL Dulbecco PBS 中，制备硫酸铁铵六水合物，以获得 10 mM 硫酸铁铵 （FAS） 溶液。通过稀释制备 FAS 的二级储备液。要制备 2 mM FAS （fA） 的原液，请用 PBS 和 800 μL Dulbecco 的 PBS 稀释 200 μL 的 10 mM FAS 原液。要制备 100 μM FAS （fB） 的原液，请用 950 μL Dulbecco PBS 稀释 50 μL 原液 fA。
3. 要制备 10 mM 去铁酮原液，请将 2.8 mg （139.15 g/M） 溶解在 2 mL Dulbecco PBS 中。用 800 μL Dulbecco PBS 稀释 200 μL 的 10 mM 原液，制备 2 mM 铁螯合剂的二级储备液。
   注:在该测定中，所选铁螯合剂应溶解在 Dulbecco 的 PBS 中，不含镁或钙。作为一个工作示例，我们使用了铁螯合剂 Deferiprone。

2. 通过测定钙黄绿素荧光的线性范围进行检测验证

1. 如储备溶液表所述，制备一系列 1 mM 至 1 μM 的钙黄绿素储备液（见 表 1）。将储备溶液保存在黑暗中以防止光化学降解。
2. 使用单通道手动移液器或多通道手动移液器，将 90 μL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 移液到 96 孔板的 A 至 H 孔和 1 至 12 孔板中。
3. 使用单通道手动移液器将 10 μL 1 mM 钙黄绿素储备液添加到 96 孔板的第 12 列 A 至 H 行中。
4. 使用单通道手动移液器，将 10 μL 预先制备的 800 μM 钙黄绿素原液（表 1）添加到第 11 列 A 至 H 行的 96 孔板中。
5. 对 表 1 中的储备液重复添加程序，使第 10 列含有 10 μL 的 400 μM 储备液，第 9 列含有 10 μL 的 200 μM 储备液，依此类推。在色谱柱上继续此逐步程序，直到色谱柱 2 含有 10 μL 的 1 μM 储备液。
   注:由于 1:10 稀释，每个孔中钙黄绿素的最终浓度比储备液低 10 倍。
6. 向第 1 列的 A 至 E 行中加入 10 μL PBS。
7. 在室温下孵育 30 分钟，并将酶标仪上的分析仪设置为 490 nm 激发和 530 nm 检测（或适合 Calcien 荧光的滤光片组）。

3. 通过 Fe²⁺ 离子淬灭进行检测验证，以减少钙黄绿素荧光

1. 制备 10 μM 的钙黄绿素 （cB） 储备液和 2 mM 的 FAS 储备液 （fA）（参见 材料表）。将钙黄绿素原液置于黑暗中以防止光降解。
2. 使用单通道手动移液器或多通道手动移液器，将 50 μL PBS 添加到第 2 列至第 10 列的 A 行至 E 行中。不要将 PBS 添加到第 11 列中。
3. 使用单通道手动移液器将 100 μL 2 mM 的 FAS （fA） 储备液加入第 11 列（A 行至 E）的 96 孔板中。
4. 使用多通道手动移液器从第 11 列中去除 50 μL fA，并将其移液到第 10 列中已有的 PBS 中，通过移液充分混合。
5. 在 96 孔板的第 9-2 列、A 至 E 行继续此逐步双重稀释程序，并通过移液混合。
6. 从第 2 列中移液取出 50 μL 溶液，并将溶液丢弃至废液中。
7. 将 40 μL PBS 加入所有含有溶液的孔中，第 2-12 列，A 至 E 行。
8. 将 90 μL PBS 添加到孔第 1 列的 A-E 行中。这些孔充当 1 μM 钙黄绿素和 0 μM FAS 的阳性对照。
9. 向每个孔中加入 10 μL 10 μM 钙黄绿素原液 （cB），其中有溶液（第 1 列至第 12 列，A 行至 E 行）。这导致第 11 列中的最高浓度为 1000 μM FAS，第 10、9、8 列到第 2 列中的 FAS 浓度减半。来自色谱柱的每个所得孔都含有 1 μM 钙黄绿素和 FAS 稀释液。
10. 将 100 μL PBS 添加到第 1 列至第 5 列的 F 行中，用于单独的 PBS 对照。将 100 μL 2 mM FAS 添加到第 6 列至第 10 列的 F 行中，用于单独对照 FAS。在室温下避光孵育 10 分钟。
11. 在设置为 490 nm 激发和 530 nm 检测的酶标仪上进行分析（或适用于钙黄绿素荧光的滤光片组）。

4. 定量铁螯合剂在 Fe 2+ 离子中胜过弱螯合剂钙黄绿素的能力的测定

1. 如 表 1 所示，制备 10 μM 的钙黄绿素原液 （cB）、100 μM 的 FAS 原液 （fB） 和 2 mM 的铁螯合剂原液。将钙黄绿素原液置于黑暗中以防止光降解。
2. 使用单通道手动移液器或多通道手动移液器，将 50 μL PBS 添加到 96 孔板的第 2 列至第 10 列 A 至 E 行中。不要将 PBS 添加到第 11 列中。
3. 使用单通道手动移液器将 100 μL 的 2 mM 铁螯合剂原液 （fA） 加入第 11 列 A 至 E 行的 96 孔板中。
4. 使用多通道手动移液器从第 11 列中去除 50 μL fA，并将其移液到第 10 列 A 行至 E 行的 PBS 中，通过移液充分混合。
5. 在板的剩余第 9-2 列、A 至 E 行继续此逐步双重稀释程序，通过移液将每个孔混合。从色谱柱 2 中取出 50 μL 并弃去。这确保了 2 mM 铁螯合剂（去铁酮）在 96 孔板列 11 至 2、A 至 E 行中双重稀释。
6. 将 30 μL PBS 移液到所有含有溶液的孔中（例如，第 2-11 列 A 至 E 行）。
7. 使用多通道移液器，将 10 μL 100 μM FAS 原液 （fB） 添加到第 2-12 列的 A 至 E 行中。这导致每个孔中的浓度为 1 μM 钙黄绿素和 10 μM FAS，并且螯合剂稀释了一倍，浓度将整个板中的每根柱减半，即第 11-2 列，铁螯合剂的最高浓度为 1000 μM在第 11 列 A 至 E。
8. 使用多通道移液器将 10 μL 10 μM 钙黄绿素原液 （cB） 添加到第 2-12 列的 A 至 E 行中。
9. 使用移液管将 80 μL PBS 和 10 μL 钙黄绿素原液 （cB） 和 10 μL FAS 原液 （fB） 移液至第 1 列 A-E 行。通过移液混合样品。这提供了 1 μM 钙黄绿素和 10 μM FAS 的对照，没有螯合剂。
10. 将 100 μL PBS 移液到 F 行第 1 列至第 5 列。这提供了 PBS 阴性对照。
11. 将 100 μL 的 2 mM 铁螯合剂（去铁酮）添加到 F 行第 6 列至第 10 列。这提供了单独的螯合剂控制。
12. 在室温下避光孵育 10 分钟。在设置为 490 nm 激发和 530 nm 检测的多模式酶标仪上进行分析（或适合 Calcien 荧光的滤光片组）。

5. 数据分析

1. 通过测定钙黄绿素荧光的线性范围进行分析以验证分析。
   1. 计算步骤 1 中 96 孔板列中每种钙黄绿素浓度的 AH 行的平均相对荧光单位 （RFU），并对照浓度绘制图。在 x 轴上绘制钙黄绿素浓度的折线图与 y 轴上的平均 RFU 的关系图，并使用线性回归提供最佳拟合线。
   2. 通过将每列 （2-11） 中的钙黄绿素浓度与第 1 行 A 至 E 中的 PBS 对照进行比较来量化统计显着性。执行方差分析 （ANOVA） 并使用阈值为 p <0.001 的最小显著性差异 （LSD） 应用事后分析以确定统计显着性，（在 图 1 中用 ** 表示）。
2. 通过 Fe²⁺ 离子淬灭进行分析以验证分析，以减少钙黄绿素荧光。
   1. 计算第 2-11 列中每种 FAS 浓度的 A 到 E 行的平均相对荧光单位 （RFU）。在 y 轴上绘制每个 FAS 浓度的平均 RFU。在 x 轴上，使用 Log2 刻度绘制 FAS 的浓度，因为它更好地分布了数据。使用线性回归绘制一条最佳拟合线。
   2. 通过比较 PBS、1 μM 钙黄绿素、0 μM FAS（第 1 列 A 至 E 行）的每列平均值与平均 RFU 来量化统计显着性。使用 LSD 事后分析执行方差分析，阈值为 p <0.001，以确定统计显著性。
3. 分析分析:定量铁螯合剂在 Fe²⁺ 离子中胜过弱螯合剂钙黄绿素的能力。
   1. 计算第 2-11 列中每种浓度的螯合剂的 A 到 E 行的平均相对荧光单位 （RFU）。在 y 轴上绘制每个螯合剂浓度的平均 RFU。在 x 轴上，使用 Log2 刻度绘制螯合剂的浓度，因为它可以更好地分配数据。
   2. 通过比较 PBS、1 μM 钙黄绿素和 10 μM FAS 对照的每列平均值与平均 RFU（第 1 列，A 至 E 行）来量化统计显着性。使用 LSD 事后分析执行方差分析，阈值为 p <0.001，以确定统计显著性。

结果

对于步骤 2 中所示的方法，第一个实验（图 1）确定了检测钙黄绿素荧光发射时微量滴定荧光酶标仪的线性范围。我们的代表性结果显示钙黄绿素荧光的线性范围很宽，从 0-100 μM。LSD 事后分析的方差分析表明，与 0 μM 钙黄绿素对照相比，所有钙黄绿素浓度的平均 RFU 存在统计学上的显着差异。在进一步的实验中，使用 1 μM 钙黄绿素（步骤 3 和 4），因为它与 0 μM 对照产生统计学上的显着差异，并且属于流式细胞术¹³ 中通常以钙黄绿素 AM 形式应用于细胞的范围内。

对于步骤 3 中所示的方法，我们证明，当在 0-1000 μM（作为 FAS）的范围内添加到 1 μM 钙黄绿素中时，Fe²⁺ 离子导致钙黄绿素荧光 （RFU） 线性降低。这允许观察基于 Fe²⁺ 的钙黄绿素荧光淬灭。钙黄绿素作为一种弱铁螯合剂，可结合铁，从而降低荧光输出。在图 2 中，与单独使用 1 μM 钙黄绿素相比，8.9 μM FAS 及以上浓度的钙黄绿素荧光显著降低，p<0.001。使用 8.9 μM FAS 对应于钙黄绿素荧光减少 33%（平均 RFU）。对于进一步的实验（步骤 4），使用 10 μM FAS，因为它位于钙黄绿素的荧光猝灭范围内。

对于步骤 4 所示的方法，如图 3 所示，可以观察到铁螯合剂对钙黄绿素对 Fe²⁺ 离子的竞争。Fe²⁺ 形式的铁降低了 1 μM 对照的钙黄绿素荧光，而铁螯合剂去铁酮将这种荧光增加到一个峰值，释放了钙黄绿素的铁淬灭并增加了荧光（平均 RFU）。浓度范围为 0.97-512 μM 的去铁酮（用作示例）导致荧光在统计学上显着增加，如方差分析和 LSD 事后分析所观察到的那样 （p<0.001）。最大的倍数变化是与 1 μM 钙黄绿素 AM 和 10 μM FAS 的对照相比，62.5 μM 螯合剂的平均 RFU 变化了 3 倍。高于 512 μM 去铁酮，螯合剂与 1 μM 钙黄绿素和 10 μM FAS 的对照之间没有统计学显着差异。

图 1:使用荧光微量滴定板读数仪测定的钙黄绿素浓度和荧光 （RFU）。 此处显示了孵育 30 分钟并测定荧光 （RFU） 的 0-100 μM 钙黄绿素浓度。数据显示每个实验和 3 个独立实验的平均值，误差线显示平均值的 95% 置信区间。统计显着性用 ** 表示，其中 p<0.001 是使用方差分析和 LSD 事后分析（使用图形垫棱柱计算）确定的。将每种浓度的平均钙黄绿素RFU与PBS和0μM钙黄绿素的对照进行比较。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:FAS 浓度的增加导致钙黄绿素荧光线性降低。 FAS 的浓度从 0 增加到 1000 μM，这导致在 PBS 中孵育 30 分钟后 1 μM 钙黄绿素荧光线性降低显示的数据是每个实验 5 次重复和三个独立实验的平均值，误差线显示平均值的 95% 置信区间。统计显着性用 ** 表示，其中 p<0.001 是使用方差分析和 LSD 事后分析（使用图形垫棱柱计算）确定的。将每种浓度的FAS和1μM钙黄绿素的平均钙黄绿素RFU与PBS中1μM钙黄绿素0μMFAS的对照进行比较。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:去铁酮浓度增加。 去铁酮的浓度从 0 增加到 1000 μM，在 PBS 中孵育 1 μM 钙黄绿素、10 μM FAS。 在多模式酶标仪上测量荧光。显示的数据是每个实验 5 个重复和 3 个独立实验的平均值，误差线显示平均值的 95% 置信区间。统计显着性用 ** 表示，其中 p<0.001 使用方差分析和 LSD 事后分析（使用图形垫棱镜计算）确定。平均 RFU 与 PBS 中的 1 μM 钙黄绿素、10 μM FAS 和 0 μM 去铁酮相比。 请单击此处查看此图的较大版本。

浓度 （μm）	体积来自 （1 mM 原液）	PBS 体积	总体积
800	800 微升	200 微升	1 毫升
400	400 微升	600 微升	1 毫升
200	200 微升	800 微升	1 毫升
100	100 微升	900 微升	1 毫升
50	50 微升	950 微升	1 毫升
25	25 微升	975 微升	1 毫升
10	10 微升	990 微升	1 毫升
6	6 微升	994 微升	1 毫升
2	2 μL	998 微升	1 毫升
1	1 微升	999 微升	1 毫升

表 1:钙黄绿素二级储备液制备。

讨论

癌症过度依赖铁来促进其新陈代谢，这使得铁螯合成为治疗方案的潜在补充⁴。然而，快速筛选新型金属离子螯合剂结合铁离子的能力是有限的。已知常用且广泛使用的荧光探针钙黄绿素充当弱铁螯合剂，与铁离子结合会淬灭钙黄绿素荧光。然后可以通过使用更强的铁螯合剂竞争与铁的结合来恢复荧光。当钙黄绿素结合铁时观察到的荧光减少以及当它被更强的螯合剂竞争时荧光的恢复，为筛选具有铁螯合潜力的新型化合物提供了一种快速简单的方法。虽然基于钙黄绿素的技术¹³ 已经用于可视化螯合剂在细胞中结合铁的能力，但这些技术需要昂贵的流式细胞术设备，只是半定量的，需要广泛的员工培训并使用更昂贵的细胞渗透形式的钙黄绿素 Calcien-AM。此外，该技术的可重复性差，不容易通过统计分析来确定数据显着性。因此，我们创造了一种简单廉价 的体外 方法，可以作为新型化合物铁螯合能力的首次筛选。这种无细胞检测消除了对昂贵的细胞培养方法的要求，作为铁螯合能力的首次高通量筛选。

人们对筛选或开发可用于靶向癌症的新型铁螯合剂越来越感兴趣，因为它们依赖铁来驱动其代谢适应²。在本文中，我们描述了一种 体外 技术，该技术可用于确认新化合物通过竞争弱螯合剂钙黄绿素来螯合铁的能力。这允许对新化合物进行简单、定量和廉价的铁螯合能力筛选。

该方案中的关键步骤之一是确定荧光微量滴定酶标仪的线性范围（图 1）。钙黄绿素具有较宽的荧光激发和发射光谱，以 501 nm 的激发峰和 521 nm 的发射峰为中心。然而，钙黄绿素的线性范围可能取决于用于激发和检测钙黄绿素荧光发射的滤光片，用于检测的光电倍增管的线性范围也将部分决定线性范围。因此，重要的是首先确定钙黄绿素荧光呈线性的浓度范围，以确保测定在荧光读板机上钙黄绿素的线性范围内工作。鉴于我们观察到 0 到 100 mM 钙黄绿素之间的线性，这表明钙黄绿素具有较宽的线性范围。此外，荧光微量滴定板读数仪通常具有可以测量钙黄绿素荧光的滤光片组，因为它与一些最常用的绿光发光荧光团具有相似的光谱。因此，该测定法广泛适用于广泛的用户。

首选使用 FAS 作为铁离子供体，因为它提供 Fe²⁺ 离子，这是细胞不稳定铁库中的主要铁离子。然而，使用提供 Fe³⁺ 的氯化铁 （FAC） 也获得了与此处所示（图 2）类似的结果（数据未显示）。因此，该测定与铁离子的两种氧化还原状态兼容，扩大了对螯合剂的适用性，优先选择这两种氧化还原状态中的任何一种。

在这项研究中，我们提供了铁螯合剂去铁酮的数据，但是，我们还评估了包括Mimosine在内的其他铁螯合剂使用该测定法在铁离子结合方面优于钙黄绿素的能力（数据未显示）。该测定的局限性之一是，与 1 μM 钙黄绿素和 10 μM FAS 的对照相比，高于 512 mM 的螯合剂去铁酮，荧光没有统计学上的显着增加。目前尚不清楚为什么较高浓度的螯合剂不会导致荧光增加，尽管在其他螯合剂中观察到了这一点（数据未显示）。然而，先导治疗化合物应起作用< 100 μM，因此该测定在先导化合物疗效所需的浓度范围内起作用。

因此，该测定允许快速筛选任何潜在的铁螯合剂，以确定铁的螯合能力，以证明机制。这是在昂贵且费力的基于细胞或 体内 分析中筛选新型螯合剂之前的重要第一步。该测定的一个局限性是它使用水性溶剂进行，因此要求螯合剂可溶于水性缓冲液。然而，鉴于本研究中使用的最高浓度是 10 mM 去铁酮，这是一种小的亲脂性铁螯合剂¹⁵，因此仍然可以测试水溶度有限的螯合剂。

总而言之，此处描述的测定可能在筛选新型铁螯合剂方面被证明是有价值的，这是癌症治疗开发的持续重点。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硫酸铁 （II） 铵 六水合	Sigma-Aldrich	215406	另一种称为 FAS
钙黄绿素	Sigma-Aldrich	C0875
去铁酮	Sigma-Aldrich	379409
Dulbecco′s 磷酸盐缓冲盐水	Sigma-Aldrich	D5652	不含镁和钙
Greiner CELLSTAR 96 孔板	Sigma-Aldrich	M0812	任何光学透明的 96 孔板都可以工作