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通过测量细菌清除率定量秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的食物摄入量

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DOI：

10.3791/66422

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2024年2月23日

 ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, The Scripps Research Institute, 2Department of Molecular Medicine, The Scripps Research Institute, 3Department of Neuroscience, The Scripps Research Institute

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种用于定量检测的实验方法 秀丽隐杆线虫 基于液体培养物中细菌清除率测定的摄食速率

摘要

摄食是生物体生长、繁殖和生存所必需的基本生物学过程。本实验旨在测量秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans ，简称 C. elegans）的食物摄入量，这是研究衰老或代谢遗传学时的一个重要参数。在大多数物种中，摄食量通过测定给定时间段内所提供的食物量与剩余食物量之间的差值来确定。本文所介绍的方法采用相同的策略来测定 C. elegans 的摄食行为，即测量 C. elegans 在72小时内清除的细菌（其食物来源）的量。该方法使用96孔微孔板，使得能够在速度和深度上前所未有地对数百种药物调节摄食能力进行筛选。本实验的优势在于，可同时测定摄食行为和寿命，并直接测量食物的减少量，因而基于与其他生物相同的基本原理，便于跨物种间的比较研究。

引言

Caenorhabditis elegans 已被广泛用于衰老研究。 该生物是研究由饮食限制、线粒体活性降低或胰岛素信号减弱所诱导的代谢介导长寿现象之遗传基础的有力模型1,2,3,4,5,6,7。然而，由于 C. elegans 个体体型微小，在长寿研究背景下对其摄食行为进行测量已被证明具有挑战性3,8,9,10,11,12,13,14,15。

摄食是一种维持生存所必需的基本生物学行为，其精确调控对于维持代谢健康、生殖和衰老过程至关重要。摄食行为受到神经系统和外周多种信号通路的共同控制，因此只能在活体（in vivo）条件下进行研究16,17,18,19。摄食是决定生物体能量稳态三大要素中的第一个要素，其余两个分别为：（i）能量摄入，（ii）能量储存，以及（iii）能量消耗。对秀丽隐杆线虫（C. elegans）摄食行为的研究主要通过测量咽部泵动频率来进行，即咽部收缩的速率。该方法已为理解C. elegans的摄食行为提供了重要见解3,4,8,12,13,20,21；然而，咽部泵动——尤其是以数分钟为单位的短时间测量——并不一定与实际的食物摄入量相关。

食物摄入量不仅取决于咽部泵动速率，还受到摄食行为持续时间、频率以及食物细菌密度等因素的影响。动物可能具有很高的咽部泵动速率，但其摄食行为的持续时间较短，从而抵消了速率的增加。另一个干扰因素是泵动在摄取和研磨细菌方面的效率，这种效率可能因情况而异。一个将食物摄入与咽部泵动完全分离的极端例子是在没有食物（细菌）存在的情况下添加血清素。当外源性血清素存在时，动物会以很高的速率进行泵动，但在缺乏细菌的情况下，这种高泵动速率并不会导致实际的食物摄入2,6,13,22,23。

本文介绍的细菌清除法通过随时间推移细菌浓度的下降来测量单个孔中线虫群体的食物摄入量（图 1）。该方法与其他物种中利用食物减少量作为摄食量指标的研究方法类似10,11,24,25,26,27,28。在原始发表的研究中，我们通过用15N同位素标记的细菌喂养C. elegans对该摄食量检测方法进行了验证11。后续通过质谱分析发现，细菌减少量与同位素标记的出现高度相关，表明细菌确实被动物摄取11。因此，我们确信在大多数情况下，细菌清除实验能够准确反映食物摄入。该实验的目的并非取代咽部泵动实验，而是为研究C. elegans的摄食与代谢及其与衰老和寿命的关系提供更多可用的实验工具。

方案

线虫培养实验流程图：同步化、接种至96孔板、给药后测量OD600。
图1：细菌清除实验示意图。 协议主要步骤的图示（从上到下）：细菌准备、线虫群体同步化、接种至96孔板、线虫灭菌、添加药物、第1天和第4天测量OD600。每个图示左侧标明了这些具体步骤的详细说明。缩写：OD = 光密度；FUdR = 氟脱氧尿苷。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 细菌制备

注意：本节详细说明本实验所用饲喂细菌的制备过程。实验中使用的特定大肠杆菌（E. coli）菌株名为OP50。OP50是饲喂秀丽隐杆线虫（C. elegans）最常用的菌株。所使用的OP50菌株具有羧苄西林/氨苄青霉素抗性，可防止线虫培养物被其他细菌交叉污染9。

  1. 提前 4–5 天准备 OP50，并在使用前一天进行 X 射线辐照。确保所有接触 OP50 的材料均为无菌状态29，30。
  2. 第 -8 天：星期三（第 1 周）：
    1. 通过在 5 mL LB 培养基中加入 100 µg/mL 氨苄青霉素和 0.1 µg/mL 两性霉素 B，并接种单个 OP50 菌落，制备预接种物，在 37 °C 细菌摇床中培养约 6 小时。应尽早接种，以保证培养物充分生长至浑浊。
    2. 当培养物变浑浊后，将 OP50 预接种培养物按 1:2,000 的比例稀释至 250 mL 含 100 µg/mL 氨苄青霉素的 TB 培养基中，在 37 °C 细菌摇床中过夜培养 17–19 小时。
      注意：培养时间不得超过 19 小时。
  3. 第 -7 天：星期四（第 1 周）
    1. 经过 17–19 小时的培养后，将 OP50 液体培养物转移至无菌离心管中，在 4 °C 条件下，以 3,100 × g 离心 15 分钟。
    2. 弃去上清液，用无菌水重悬 OP50 沉淀，再次离心。重复此洗涤步骤 2 次。
    3. 第二次洗涤后，弃去上清液，将 OP50 沉淀用无菌水重悬至 50 mL 体积，并转移至已预称重的 50 mL 圆锥形离心管中。在 4 °C 条件下，以 3,100 × g 离心 20 分钟，收集 OP50 沉淀。
    4. 第三次洗涤后，小心移除所有残留上清液，确保管内无残留水分。通过从含沉淀的离心管重量中减去空离心管重量，计算沉淀的重量。
      注意：沉淀重量通常在 3–3.5 g 范围内。
    5. 将 OP50 沉淀彻底重悬于 S-complete 缓冲液中，浓度为 100 mg/mL，确保无团块存在。
    6. 确保 OP50 浓度为 100 mg/mL 时相当于 2 × 1010 细菌/mL。若已知光密度与每毫升细菌数之间的关系，可通过分光光度法测定每毫升的细菌浓度。如有必要，使用 S-complete 缓冲液将 OP50 饲喂液的浓度调整至 2 × 1010 细菌/mL。
    7. 在琼脂平板上测试 OP50，以确定是否受到污染。
    8. 将悬浮于 S-complete 缓冲液中的 OP50 储存于 4 °C。

  1. 第 -3 天： 第二周，星期一
    1. 通过 X 射线照射杀死细菌，以防止在实验过程中细菌生长。

2. 同步化线虫培养物的制备

注意：本节介绍同步线虫群体的制备。所有与线虫群体接触的材料均为无菌。除非另有说明，所有培养板均置于 20 °C 下培养。

  1. 第-6天：星期五（第1周），下午4:00
    1. 将动物转移至新的培养皿中。
      1. 取一块线虫生长培养基（NGM）平板，其上的线虫群体主要由饥饿的L1幼虫组成。
        注意：使用混合种群也会产生结果。使用长期饥饿的L1期线虫可能会影响当前或未来世代的摄食行为，因为饥饿至少可在三代内留下表观遗传标记。
      2. 用不超过1 mL的无菌水冲洗线虫。取约300 µL洗涤后的线虫群体，接种至铺有浓缩OP50（~300 mg/mL）的NGM平板上。将平板置于平板干燥器或本生灯下干燥。于20°C培养，直至大部分群体发育为怀卵成虫（周一）。
        注意：此时间范围针对野生型 N2 线虫群体进行了优化，不同品系之间可能有所差异。对于发育延迟的线虫，应予以考虑，并提前进行分块和/或接种，以确保所测试的所有品系能够同时达到成虫阶段。
  2. 第-3天：星期一（第2周）上午10:00
    1. 建立同步化细胞群体
      警告！漂白剂对皮肤和眼睛具有腐蚀性。操作时需佩戴手套和护目镜。
      1. 用最多10 mL无菌水冲洗培养板以收集线虫，将线虫与水的混合液转移至15 mL锥形管中。
      2. 在实验台面上通过重力沉降法洗涤线虫，静置约 4 分钟（或 alternatively，在台式离心机中以 310 × g 离心 2 分钟） g.
      3. 用小吸头抽吸弃去上清液，加入最多15 mL无菌水。重复3次。
      4. 去除上清液，加入 5 mL 新鲜配制的次氯酸钠/氢氧化钠溶液（1.8 mL 家用漂白剂，0.5 mL 10 N NaOH，7.7 mL dH₂O）2O
      5. 室温孵育5分钟，或直至线虫裂解。每隔1分钟轻轻涡旋振荡至少10秒。在解剖显微镜下监测裂解进程。
        注意：裂解线虫所需时间可能因品系而异。将线虫在漂白液中放置过久可能导致卵失去活力。
      6. 加入M9缓冲液以中和反应，直至所有成虫破裂或溶解（终体积为15 mL），然后在1,300 × g下离心2分钟 g.
      7. 用13 mL M9缓冲液清洗卵子3次。
      8. 用10 mL S-complete缓冲液将卵清洗一次，于1,300 × g离心2分钟 g.
      9. 吸弃上清液，加入 10 mL S-complete 培养基，将悬浮液转移至新的 15 mL 圆锥形离心管中。在室温下，使用旋转混合仪或类似装置轻轻旋转过夜。
      10. 可选：若在 S-complete 缓冲液中完成最终离心后仍存在成虫尸体，需将线虫溶液通过 40 µm 细胞滤网过滤。
  3. 第-2天：星期二（第2周），下午1:00
    1. 将动物接种到培养板中
      1. 使用解剖镜检查线虫是否已孵化。通过解剖镜计数10 µL液滴中的线虫数量，以确定S-complete缓冲液中的线虫浓度；每份样品计数5–10个液滴。若每个10 µL液滴中的线虫数量超过30条，则用S-complete缓冲液稀释原液，降低每滴中的线虫密度，以便于准确计数。
      2. 将液体线虫混合物以每孔120 µL的体积接种至96孔板的各孔中，具体如下（终浓度）：60 条线虫/mL S-complete 培养基，50 µg/mL 羧苄青霉素，0.1 µg/mL 两性霉素，以及第1部分制备的6 mg/mL OP50。
        注意：制备的总体积取决于培养板的数量（每块96孔板约需12 mL）。每孔应含有6–12条线虫。 Alternatively，可使用大型颗粒流式细胞仪（如Union Biometrica公司的COPAS FP）将10条线虫精确分选至每孔（参见拥挤效应部分）。
      3. 还包括一个 无蠕虫 液体混合物：50 µg/mL 羧苄青霉素、0.1 µg/mL 两性霉素和 6 mg/mL OP50，于第1步中制备
      4. 加入120 µL的 无蠕虫 将混合物加入96孔板的H行，用于测定 自裂解 数值, 如前所述，将含有线虫的混合物每孔120 µL加入A-G行的各孔中。
        注意：移液过程中需确保蠕虫保持悬浮状态（参见 图2A，B）。我们使用透明的平底96孔板。实验的板式布局将整块板划分为4或6个条件，每对列对应不同的药物处理或线虫品系，底行作为“无虫”对照（图2A，B).
      5. 为避免污染和蒸发，使用封板膜密封培养板。将培养板在20 °C下孵育约65小时，直至动物发育为L4期线虫。
  4. 第0天：第2周星期四中午之前。
    1. 通过添加氟脱氧尿苷（FUdR）实现线虫群体的无菌化处理。
      1. 向每孔中的动物加入30 µL 0.6 mM的FUdR储备溶液以实现动物的无菌化。使用封板膜重新密封培养板，并在微型滴定板摇床中以800 rpm振荡20分钟。将培养板放回20 °C培养箱中。
        注意：在此步骤中，OP50 的终浓度从 6 mg/mL 降低至 5 mg/mL（1 × 109 细菌/mL），每孔最终体积为 150 µL。必须在动物达到成虫阶段之前，于 L4 期加入 FUdR。
  5. 第1天：星期五（第2周）
    1. 向培养物中添加药物。
      1. 上午9:00前，确认大多数动物已产卵，每个孔中均含有多个卵。如有需要，加入药物至目标浓度（参见讨论部分）。
      2. 加药后，用封板膜密封培养板，并在板式振荡器上以800 rpm振荡20分钟。
        注意：振荡可确保所有细菌团块均被溶解，且不接触封膜。细菌团块或封膜上的液体均会影响OD值的准确性。600 读数。如果封板膜上有液滴，可在310 × g下短暂离心10–20秒 g再次在摇床中振荡5分钟，然后测定。
      3. 在微孔板振荡器上振荡20分钟后，取下盖子和密封膜，测定OD值600 在酶标仪中；这是 第1天 光密度600 测量。密封后将培养板放回20 °C培养箱中。
        注意：由于细菌沉降迅速，震荡培养板后应在10分钟内完成读数。
      4. 使用倒置显微镜检查线虫群体是否存在污染或毒性迹象（若已添加药物）。将培养板放回20 °C培养箱中。
  6. 第4天：星期一（第3周）
    1. 取第4天的OD值600 读数
      1. 重复第1天的读数步骤（步骤2.5.1.3）以获得 第4天 光密度600 值。在 OD600 测量时，在微孔板振荡器上以800 rpm的速度振荡平板20分钟。
      2. 在倒置显微镜下，最好使用2倍物镜，对每个孔中的线虫数量进行计数，并将结果记录在电子表格中。计数完成后，将培养板放回20 °C培养箱中。
        注：参见我们提供的评分表样本 补充材料.
      3. 之后 第4天 读取后，食物摄入量的测量即已完成。如有需要，可将这些培养皿保留用于寿命分析。
        注意：本方案适用于 Solis 和 Petrascheck 方法31.

3. 食物摄入数据的分析

用于细胞裂解分析的微孔板实验图表，包括孔板设计、OD<sub>600</sub> 和 ΔOD<sub>600</sub>。
图 2：实验设计与数据分析。 （A, B）针对 4 个和 6 个实验条件的可能孔板设计方案，其中 H 行为“无线虫”对照孔。这些孔用于确定自溶率（selflysis）。每块板均需包含 N2 未处理对照组群体作为参考。 （C）在提供的电子表格中收集的示例数据，包括线虫数量（绿色框）、第 1 天和第 4 天的两次 OD600 测量值（橙色框）、自溶值（selflysis）（蓝色框），以及使用公式（2）计算的结果（(OD600 - selflysis)/X0）（红色框）。此处展示的具体示例采用了（B）中所示的孔板设计。缩写：OD = 光密度；X0 = 每孔线虫数量。请点击此处查看该图的放大版本。

注意：本节介绍如何分析本实验方案第2节中的摄食量数据。首先需要计算的是自溶对照值。细菌在液体中会随着时间推移发生裂解，即使在没有线虫的情况下也是如此。这种自溶值还可能受到多种化学物质的影响，因此必须加以控制，因为其数值相对于线虫的摄食量而言相对较大。如步骤2.3.1.4所述，并在图2A、B的平板布局中所示，H行包含与实验组相同的溶液，但不含线虫。在我们如图2B所示的平板设置中，每种条件设有14个孔，其中分别包含两个对应的自溶对照孔（H行，“无虫”）。

  1. 使用公式（1）计算每种条件下无虫对照孔的自溶对照值。对于每个重复组的孔，确保至少有两个无虫对照孔，如步骤2.3.1.4所述。使用该重复组所有无虫对照孔的平均值作为该组的自溶值。
    自溶 = 平均值（第1天OD600 - 第4天OD600）    (1)
    注：对于图2B所示的板布局，我们将通过计算H行中两个自溶对照孔的平均值，得到六个自溶值，每个值对应六个组中的一个。
  2. 使用公式（2）计算每条线虫的食物摄入量：
    使用OD600值进行实验分析的食物摄入量计算公式。    (2)
    注：该公式用于电子表格中（红色框，图2C），其中X0表示每孔线虫数量。
  3. 在确定每孔每条线虫的食物摄入量后，计算整个条件下的平均值和标准差。
    注：对于图2B所示的板布局，每种条件设置14个重复孔足以进行统计学比较。
  4. 将每种条件归一化至其对应的N2未处理对照组群体。以倍数变化或N2摄食量的百分比表示摄食变化。
    注：进行归一化是因为不同实验日所获得的公式(2)中OD600/X0的绝对值可能存在差异。

结果

5-羟色胺诱导的倍数变化图；使用基因 daf-16(mu86) 和化学处理的实验。
图 3：代表性数据。（A）该图显示了食物摄入量倍数变化随5-羟色胺浓度变化的剂量-反应曲线。所有数据均以N2野生型基础摄食为基准进行归一化。注意，在未添加5-羟色胺时，daf-16(mu86) 动物的摄食量高于野生型N2，但其调控摄食的能力范围减弱。（B）该图显示了用50 μM抗精神病药物洛沙平处理、并喂食经X射线、γ射线或甲醛灭活细菌的线虫的食物摄入倍数变化的小提琴图。（C）该图显示了不同突变体的食物摄入倍数变化的小提琴图，横轴标明其基因型。这些数据表明，exc-4 和 cgr-1 突变体摄食较少，而 srp-6 突变体摄食较多。星号表示 ** p < 0.001，****p < 0.0001，由ANOVA和Brown-Forsythe-Welch检验确定，并通过事后校正以校正多重假设检验。误差棒表示±S.E.M。 请点击此处查看该图的放大版本。

图1 展示了本实验方案的整体工作流程，涵盖了从细菌制备到第1天和第4天获取OD600读数的全部过程。此外，信息图还标注了所用方法的具体步骤。图2A、B 展示了两种可能的实验板布局，其中H行包含“无线虫”对照孔，这是计算讨论部分所述的selflysis率所必需的。根据我们实验室的经验，实验设计中必须包含未经处理的N2对照组，以校正不同实验之间线虫摄取细菌量的差异（参见讨论部分：[N2参考种群]的规划）。

图2C 是用于分析本实验方案所产生数据的电子表格示例。其中以绿色高亮显示线虫数量，自溶以蓝色表示，第1天OD600 和第4天OD600 以橙色表示，每条线虫的食物摄入量以红色表示。此外，每个孔均记录了菌株、药物、浓度、实验日期及其他添加的处理条件。有关所用具体公式的更多细节，请参见方案第3部分。总体而言，这些电子表格（模板作为补充材料提供）可实现本实验方案的高效数据收集与分析。

图3A展示了使用本方案获得的5-羟色胺在N2和daf-16突变体中调节摄食行为的剂量-反应曲线的代表性结果。在该实验中，基于基础食物摄入量（曲线中第一个数据点）计算了五个递增浓度5-羟色胺下的摄食变化倍数。如结果所示，N2品系能够以剂量依赖的方式过度进食。然而，对于daf-16(mu86)突变体，尽管其基础摄食水平高于N2，但该突变体无法像N2品系那样以剂量依赖的方式响应5-羟色胺。本方案使我们能够在两种品系间比较摄食行为，其中5-羟色胺浓度为变量因素，用于生成剂量-反应曲线。图3B显示了用抗精神病药物洛沙平处理、并喂食经X射线、γ射线或甲醛固定的细菌的线虫的摄食量。请注意，这些实验并非平行进行，观察到的差异并不代表不同细菌灭活方法之间的实际差异，而是源于实验间的变异性。图3C展示了多个遗传品系的摄食量，其中两个品系表现出摄食减少，一个品系表现出摄食增加，均相对于N2品系而言。本方案的这一应用可在不同遗传背景下测试单一浓度的单一药物，适用于鉴定在给予相同药物时摄食反应与野生型N2对照不同的遗传背景。该方法可与我们的寿命实验方案结合使用，在相同的培养板设置中快速同步筛选摄食量和寿命31。

补充材料：如图2C所示的电子表格模板。 请点击此处下载这些材料。

讨论

本方案通过在96孔微孔板中测定细菌清除率，作为C. elegans摄食量的检测指标。代表性结果中的剂量-反应曲线表明，该检测方法可定量测量摄食行为，这一结论已通过同位素标记细菌的方法得到独立验证11。利用该检测方法，我们成功测试了具有已知人类代谢副作用的FDA批准药物（如抗精神病药），并证明这些药物可增加C. elegans的摄食量10,26。该检测方法适用于研究摄食行为的遗传学或药理学机制，为利用C. elegans开展代谢研究提供了新的工具。该方法成本低，可实现高通量、省时的摄食行为研究，而这一点在大多数其他生物中难以实现。我们对FDA批准药物的研究表明，人类患者中观察到的许多副作用在C. elegans中同样可见，揭示了进化上的保守性24,26,32。

该检测方法受限于可在OD线性范围内测量的细菌浓度600 测量。因此，可检测的线虫数量和细菌浓度范围均受到限制。线虫数量过多会影响OD600 因消耗细菌过快，因此 "进食" 线性OD范围外的细菌浓度600根据我们的经验，细菌制备过程中的差异是导致不同实验间结果不一致的关键因素。我们曾尝试大量制备细菌后冷冻保存，或使用冻干细菌，但均未成功。在这些情况下，要么细菌活性显著下降，要么实验重复性无法保证。 自裂解 速率过高，或细菌质量较差导致速度减慢 秀丽隐杆线虫 发育。然而，我们的测试尚未穷尽所有可能性，这一问题或许可以解决。

通常情况下，细菌的自溶速率最难控制，可能导致显著的实验变异性。我们发现，某些药物会提高自溶 速率，使其达到无法可靠测定摄食量的水平。由于在实验过程中，细菌的自溶速率随时间逐渐增加，因此我们未对成虫第5天之后的摄食量进行测量。到该时间点时，细菌已在培养物中生长约10天。若需测定成虫第5天之后的摄食量，必须将陈旧的细菌清洗掉，并更换为新鲜细菌。

本研究所述的实验方法是我们基于96孔微孔板的寿命测定法的延伸31。该组合方法能够在同一群体中同时测量寿命和摄食量。尽管本文所述的细菌清除测定法由于细菌的自溶现象而无法在整个秀丽隐杆线虫（C. elegans）生命周期中测定摄食量，但它能够提供成年早期前四天（即摄食量最高的时期）的可靠数据。尤其在小分子药物发现研究中，控制摄食量至关重要。综上所述，我们预期本实验方法将对秀丽隐杆线虫（C. elegans）研究领域具有重要价值，并进一步拓展在代谢研究以及衰老和寿命研究背景下调控代谢的技术工具集。

规划：

在计划测量食物摄入量之前，必须考虑一些事项。

杀死细菌：

我们使用X射线照射50 mL锥形管中的细菌以将其灭活（设定为160.0 kV、25.0 mA，剂量为900 Gray，持续4小时）。照射设备采用Rad Source公司的RS2000。根据设备的不同，具体照射时间与辐射剂量在不同实验机构之间可能有所差异。细菌是否被完全灭活需通过照射后涂板培养来检测存活菌落，以确认无细菌生长。必须彻底灭活所有细菌，以防止在实验过程中发生增殖，否则将导致摄食量被低估，甚至出现负值摄食结果。重要的是，灭菌方法必须确保细菌仍可被C. elegans摄食。根据我们的经验，可靠灭活大量细菌的方法主要有三种：(i) X射线照射，(ii) γ射线照射，以及(iii) 添加甲醛29,30。这三种方法之间的自溶率具有可比性，在图3B所示实验中，其自溶率的变异系数为8%。在我们实验中未能可靠奏效的方法包括紫外线照射、抗生素混合物处理、加热灭活和叠氮化钠处理。这些方法的问题在于：无法彻底杀死细菌（紫外线和抗生素），或导致C. elegans不再摄食（加热处理），或改变摄食行为（叠氮化钠）。

重复次数：

根据我们的经验，与观察到的变异相比，摄食的倍数变化通常较小。因此，测量食物摄入量的变化需要设置多个重复孔。图2A、B展示了用于四种或六种不同条件的96孔板，分别包含21个或14个重复孔，以及两个不含线虫的selflysis对照孔。鉴于数据变异性较大且预期变化相对较小，摄食量的0.5–2.5倍变化通常为可检测的下限和上限。我们建议每种条件设置14至21个重复孔，并至少设置两个接下来所述的selflysis对照孔。这些重复足以生成能够反映影响摄食药物的定量剂量-反应曲线11,26。

自裂解对照：

光密度600 测量溶液中颗粒的数量，该方法在很大程度上不受颗粒大小的影响。然而，死亡的细菌会发生裂解，失去其颗粒特性。我们将此称为 自裂解，这在有蠕虫存在时会独立发生，并降低OD值600 无虫进食情况下的测量 自裂解 在检测过程中会发生，并且每种条件下至少需要在两个孔中独立测量。这些孔所接受的处理与同条件下的其他孔相同，但不含有任何线虫。我们发现许多药物也可能改变 自裂解 速率。因此，每种条件需要独立 自裂解 对照孔及其相应浓度。 图2 显示了四个或六个条件的平板设置，包含所有 自裂解 H行底部的对照孔。

N2 参考种群：

我们还注意到，每次实验中消耗的细菌绝对量可能存在波动，这很可能与细菌的质量有关。尽管我们每次都尽力以完全相同的方式制备细菌，但仍会出现差异。例如，细菌可能在对数生长期的分裂阶段被收获，因此其体积会明显大于处于稳定期收获的细菌。因此，细菌大小的这些微小差异可能导致被摄食细菌数量的变化以及OD600 值的不同，因为OD600测量无法区分细菌的大小差异。基于这一原因，我们始终设置一组未经处理的N2对照动物作为参考值，该值通常设定为1或100%，用于判断实验组动物的摄食量高于或低于N2对照组。这一做法使得即使OD600 值存在差异，也能在不同实验之间进行比较。

时间间隔：

使用 OD600 值测量摄食量时，需要细菌浓度出现可测量的下降。由于培养液体积远大于线虫体积，线虫必须摄食大量细菌才能产生可检测的差异。为了保持在 OD600 值的线性范围内，细菌浓度应维持在约 1 mg/mL 至 10 mg/mL 之间，因此必须有相当数量的细菌被消耗才能被检测到。线虫在晚期 L4 阶段至成虫第 4 天期间摄食量最大，这是由于产卵需求所致，因此该时间段最为理想。虽然也可以测量较短的时间间隔（如 24 小时）11，但这要困难得多，且每种实验条件需要约 40 个孔。另一种测量幼虫摄食量的方法是将每孔中的动物数量加倍，但这种方法的问题在于，当线虫长大后，数量过多会开始影响 OD600 的读数。

待测药物的储备溶液：

如果测试血清素等药物对摄食行为的调节能力，在配制储备液时需考虑以下事项。对于水溶性药物，我们通常配制50倍浓度的储备液，并向每孔加入3 µL（1:50稀释），但其他浓度的储备液（如100倍、300倍）也可使用。然而，若药物使用非水溶剂（例如DMSO）进行稀释，则最终溶剂浓度不应超过0.5%。溶剂对C. elegans具有快速毒性作用。因此，使用DMSO等有机溶剂溶解的药物储备液浓度必须达到300倍或更高。

对活体和死亡线虫进行计数：

活体与死亡动物的判定基于线虫的运动情况。使用强光（尤其是蓝光），因为它可促使动物产生运动。此外，统计每孔中动物的数量有助于发现是否存在过多的死亡情况。过多的死亡可能由有毒物质或多种溶剂在高浓度（>0.5%）下引起，包括DMSO。通常情况下，死亡动物比例应低于1:100（1%）。如果培养基中的食物已沉降，导致种群难以计数，可将培养板在微孔板振荡器上以800 rpm的速度振荡30秒。请忽略含有雄性个体或超过16条线虫的孔（参见问题部分）。

可能存在的问题：

振荡不充分：

在液体培养基中，细菌容易聚集并沉降到孔板底部。根据我们的经验，若振荡时间少于20分钟，可能无法充分打散细菌团块并使其重新悬浮，从而导致OD600测量结果不准确。当存在细菌团块时，OD600的测量值会低估实际的细菌浓度。过高的振荡速度可能导致液体黏附在封板膜上。一旦移除封板膜进行OD600读数，黏附在封板膜上的液体会导致测得的OD600值偏低。如果发现封板膜上有液体，应立即将孔板以低速短暂离心（500–1,000 rpm），然后再次振荡5分钟。此外，务必遵循第1天和第4天读数时的要求，在振荡孔板后10分钟内完成读数，以避免细菌重新沉降。

不同实验之间的绝对食物摄入量值存在差异：

尽管我们已尽力标准化细菌制备过程，但这些制备物在影响线虫摄食行为方面仍常存在差异。例如，由于细菌的分裂状态不同，其大小会因收获时处于对数生长期或稳定期而有所区别，对数生长期的细菌体积更大。由于OD600测定无法区分细菌大小，因此收获时期导致的细菌尺寸差异可能导致不同细菌制备物之间基础摄食量出现表观差异。比较不同实验结果的最佳方法是始终包含未经处理的N2对照种群，并将实验结果归一化至该N2种群。

拥挤效应：

本方案中的细菌浓度足以使每孔2至16条线虫在约72 小时内保持OD600处于线性范围内。根据所研究药物的不同，每孔超过16条线虫可能会在第二次测量前耗尽细菌浓度。我们还发现，仅含一条线虫的孔结果往往不可靠。裂解因素的影响超过了单条线虫的摄食量，因此，在线虫数量较少的孔中，裂解因子测定的微小误差会产生不成比例的影响。

如果满足以下任一条件，建议在统计分析中排除该孔。孔中含有雄虫（目前尚无关于雄虫与雌雄同体之间摄食量比较的数据）；孔中线虫数量少于2条或多于16条；第二次观察时线虫已死亡；或孔中出现子代，表明氟脱氧尿苷（FUdR）失效。FUdR对热敏感，即使低至37 °C的温度也可能使其失活。解冻FUdR时，务必使用室温水进行。

负的食物摄入量值：

食物摄入量偶尔为负值，表明第4天的食物量多于第1天。负的食物摄入量可能由以下因素之一引起：较高的selflysis率，可能由作用于细菌的药物引起；或提示孔板污染，导致除线虫外的其他生物生长。随着细菌老化，selflysis率也会升高；因此，建议使用不超过一周的细菌。若添加了随时间推移发生沉淀的药物，会影响OD600值。第1天振荡不充分可能导致因细菌聚集成团而使OD600读数偏低。线虫经历了缺氧应激，这通常发生在气液界面比例不足、无法充分进行氧气交换时。请使用材料中指定的96孔板，且每孔液体总量不得超过150 µL（120 µL + 30 µL FUdR）。孔板中液面与底部线虫生存区域之间的距离决定了氧气浓度。

局限性：

该检测仅限于液体培养。在固体平板上观察到的摄食行为，例如在食物菌苔上移动或离开菌苔，无法通过该检测进行评估。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢叶晓兰，本实验方案的建立源于她最初的观察发现。感谢Petrascheck实验室所有过去和现在的成员，他们在本方案的开发与优化过程中提供了帮助。本研究由R21 AG080376（资助对象：M.P.）资助。部分菌株由CGC提供，CGC由美国国立卫生研究院研究基础设施项目办公室（P40 OD010440）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
两性霉素 BRPIA40030-0.1溶剂：EtOH
氨苄青霉素Fisher ScientificBP176025溶剂：水
Bacto PeptoneBD Biosciences211677用于制备NGM平板
羧苄青霉素Fisher Scientific46-100-RG溶剂：水
细胞筛Fisher Scientific2236354740 µm 以去除成虫
胆固醇 MP Biomedicals02101380-CF5 mg/mL 储存液
Difco，琼脂，细菌用BD Biosciences214510用于制备NGM平板
氟脱氧尿苷Sigma AldrichF0503对L4期的线虫进行消毒
LB肉汤RPIL24045-1000.0打开胶囊，与1 L水混合，高压灭菌
M9 缓冲液 实验室制备室温下无菌保存
制备 1 L：
 15 g Na2HPO4*12H2O（分子量：358）
3 g KH2PO4（分子量：136）
 5 g NaCl（分子量：58），0.25 g MgSO₄4*7H2O（分子量：246）
 高压灭菌
微孔板封膜机Fisher Scientific236707
OP50秀丽隐杆线虫遗传学中心
铺96孔板 Falcon351172
酶标仪Tecan30016056使用600 nm滤光片
柠檬酸钾，1 M，pH 6实验室制备室温下无菌保存
制备1 L：
268.8 g 枸橼酸钾三碱一水合物（FW: 324）
26.3 g 柠檬酸一水合物（分子量：210）
900 mL 的 dH2O
用 5 M KOH 将 pH 调至 6
高压灭菌 
磷酸钾，1 M，pH 6 实验室制备室温下无菌保存
制备 1 L：
136 g KH2PO4（分子量：136）
900 mL dH₂O2O
 用 5 M KOH 将 pH 调至 6
高压灭菌
S-Basal实验室制备室温下于无菌条件下保存
制备 1 L：<喂食是生物体生长、繁殖和生存的基本生物学过程。本实验旨在测量秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans）的食物摄入量，这是研究衰老或代谢遗传学时的一个重要参数。在大多数物种中，喂食量通过测定给定时间间隔内提供的食物量与剩余食物量之间的差值来确定。本文所介绍的方法采用相同策略来测定C. elegans的摄食行为，即测量在72小时内被清除的细菌（C. elegans的食物来源）的量。该方法使用96孔微孔板，已实现对数百种药物调节摄食能力的高通量筛选，其速度和深度是其他动物模型无法比拟的。本实验的优势在于能够同时测量摄食和寿命，并直接量化食物的减少量，因而基于与其他生物相同的基本原理，便于跨物种比较。> 5.9 g NaCl（分子量：58）
 50 mL 1 M 磷酸钾（pH 6）
加入 900 mL dH₂O2O<喂食是生物体生长、繁殖和生存的基本生物学过程。本实验旨在测量秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans）的食物摄入量，这是研究衰老或代谢遗传学时的一个重要参数。在大多数物种中，喂食量通过测定给定时间间隔内所提供的食物量与剩余食物量之间的差值来确定。本文介绍的方法采用相同策略来测定C. elegans的摄食行为，通过测量72小时内被清除的细菌量（即C. elegans的食物来源）来评估摄食水平。该方法使用96孔微孔板，已实现对数百种药物调节摄食能力的高通量筛选，其速度和深度是其他动物模型难以达到的。该实验的优势在于可同时测量摄食行为和寿命，并直接量化食物的减少量，因而基于与其他生物相同的基本原理，便于跨物种比较。> 高压灭菌，冷却至 55 ℃ °C
S-Complete实验室制备室温下于无菌条件下保存
制备 1 L：
向1 L已冷却至55℃的S-basal中加入 °C 或 RT
 10 mL 1 M 柠檬酸钾
 pH 6，10 mL 微量金属溶液
 3 mL 1 M CaCl2<喂食是生物体生长、繁殖和生存的基本生物学过程。本实验旨在测量秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans）的食物摄入量，这是研究衰老或代谢遗传学时的一个重要参数。在大多数物种中，喂食量通过测定给定时间间隔内提供的食物量与剩余食物量之间的差值来确定。本文介绍的方法采用相同策略来测定C. elegans的摄食行为，即测量线虫在72小时内清除的细菌（其食物来源）的量。该方法使用96孔微孔板，已实现对数百种药物调节摄食能力的高通量筛选，其速度和深度是其他动物模型无法比拟的。本实验的优势在于可同时测量摄食量和寿命，并直接量化食物的减少量，因而遵循了适用于其他生物体的通用原理，有利于跨物种比较。> 3 mL 1 M MgSO₄4
盐酸5-羟色胺赛默飞世尔科技AAB21263095 mM 浓度下使用
氯化钠Sigma AldrichS7653-5KG用于配制缓冲液和NGM平板
terrific broth赛默飞世尔科技J75856-A112.5 g 溶于 250 mL 水中，高压灭菌
滴定板摇床赛默飞世尔科技88880023以800 rpm振荡，具体取决于摇床型号
痕量金属溶液 实验室制备室温下于无菌条件下保存<喂食是生物体生长、繁殖和生存的基本生物学过程。该检测旨在测量秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans）的食物摄入量，这是研究衰老或代谢遗传学时的一个重要参数。在大多数物种中，喂食量通过测量给定时间段内所提供的食物量与剩余食物量之间的差值来确定。本文介绍的方法采用相同策略来测定 C. elegans 的摄食行为，即测量线虫在72小时内清除的细菌（其食物来源）的量。该方法使用96孔微孔板，已实现对数百种药物调节摄食能力的高通量筛选，其速度和深度是其他动物模型无法达到的。该检测的优势在于可同时测量摄食行为和寿命，并直接量化食物的减少量，因而基于与其他生物相同的基本原理，便于跨物种比较。> 制备1 L：
1.86 g Na2EDTA（分子量：372.24）
0.69 g FeSO₄4*7H2O（分子量：278）
 0.20 g MnCl2*4H2O（分子量：198）<喂食是生物体生长、繁殖和生存的基本生物学过程。本实验旨在测量秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans, C. elegans）的食物摄入量，这是研究衰老或代谢遗传学时的一个重要参数。在大多数物种中，喂食量通过测定给定时间段内所提供的食物量与剩余食物量之间的差值来确定。本文所介绍的方法采用相同的策略来测定C. elegans的摄食行为，即测量在72小时内被清除的细菌（C. elegans的食物来源）的量。该方法使用96孔微孔板，已实现对数百种药物调节摄食能力的高通量筛选，其速度和深度是其他动物模型无法比拟的。该实验方法的优势在于，可同时测定摄食量和寿命，并直接测量食物的减少量，因而基于适用于其他生物体的通用原理，便于跨物种比较。> 0.29 g ZnSO₄4*7H2O（分子量：287）<喂食是生物体生长、繁殖和生存的基本生物学过程。本实验旨在测量秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans）的食物摄入量，这是研究衰老或代谢遗传学时的一个重要参数。在大多数物种中，喂食量通过测定给定时间段内所提供的食物量与剩余食物量之间的差值来确定。本文所述方法采用相同策略来测定 C. elegans 的摄食行为，即测量线虫在72小时内清除的细菌（其食物来源）的量。该方法使用96孔微孔板，已实现对数百种药物调节摄食能力的高通量筛选，其速度和深度是其他动物模型无法达到的。该实验方法的优势在于，可同时测量摄食量和寿命，并直接量化食物的减少量，因而基于与其他生物相同的基本原理，便于跨物种比较。>  0.016 g CuSO₄4 (FW: 158)
高压灭菌
用铝箔包裹以避光

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