使用酵母双杂交试验分离相互作用无效/受损突变体

生物分子之间的相互作用是生物现象中最基本的部分。蛋白质-蛋白质相互作用构成了这种相互作用的重要组成部分。因此，鉴定目标蛋白的相互作用伙伴对于进一步阐明目标蛋白质/基因的功能至关重要。酵母双杂交 （Y2H） 方法是一种用于鉴定体内蛋白质-蛋白质相互作用的常用技术 ¹。在该系统中，要测试其相互作用的两种蛋白质（X 和 Y）分别融合到 DNA 结合 （DB） 结构域和转录激活结构域 （AD）。DB-X 融合蛋白与 DB 结构域的识别序列结合;因此，当蛋白质 X 和 Y 相互作用时，AD-Y 融合蛋白就会接近识别序列。因此，识别序列下游的报告基因转录被激活。因此，报告基因活性的存在与否可用于确定蛋白质-^{蛋白质相互作用的存在}与否1。

一旦确定了目标蛋白质的特定相互作用伙伴，就应进行进一步分析以阐明相互作用的生物学功能。为此，如果可以分离出损害或去除特定蛋白质-蛋白质相互作用的蛋白质突变体，它们将成为强大的工具。Y2H系统可以通过筛选"相互作用阴性"克隆直接用于分离此类突变体，从野生型"相互作用阳性"克隆开始。为了加速这一过程，开发了"反向"Y2H （rY2H） 系统 ^2,3。在 rY2H 系统中，宿主酵母菌株具有反选标记基因作为报告基因，这意味着酵母细胞仅在 AD-Y 和 DB-X 蛋白不相互作用时生长。

尽管 Y2H 和 rY2H 系统都允许分离相互作用阴性突变体，但分离突变体的过程非常费力，因为并非所有通过筛选获得的候选基因都携带所需类型的突变（通常是错义突变）。最严重的问题是，很大一部分候选基因存在移码或无义突变，因此有必要进行蛋白质印迹法以排除不需要的克隆。为了克服这个问题，已经开发了新的质粒载体⁴.在这些向量中，KanMX（一种耐药性标记物）位于 DB 域或 AD 下游的帧外。只有当目的基因入时，标记基因才会与DB结构域或AD一起进入框架。当在目的基因中引入随机突变时，不需要的突变体，例如具有移码或无义突变的突变体，可以通过进行耐药性选择轻松消除，并且携带理想错义突变的候选突变可以通过Y2H^筛选轻松识别4。本文提出了一种方案，用于使用该策略分离目标蛋白质的相互作用无效/受损突变体。

1. 突变体库的建设

1. 设置聚合酶链反应 （PCR）（示例如下所示）。通常制备 50 μL 的反应物，将其分成 10 份 5 μL 的等分试样，并在 PCR 仪⁴ 中扩增目标基因片段。
   注意:用户应选择适当的聚合酶以有效地引入突变。如果要扩增的DNA片段较短，则需要错误率较高的聚合酶，例如缺乏校对活性的Taq聚合酶。如果要扩增的DNA片段很长，则需要更高保真度的聚合酶来减少突变的数量。使用常规 Taq 聚合酶⁴ 扩增 30 个周期后，每几百个碱基对发生一次突变。在代表性结果中，使用了不同的Taq聚合酶（参见 材料表），其保真度高于常规Taq聚合酶，突变率为600个碱基对中的1。PCR混合物的示例、引物详细信息和反应条件在 补充文件1中提供。
2. 当PCR完成后，合并反应的所有等分试样，确认目标DNA片段已使用琼脂糖凝胶电泳等法扩增，并纯化DNA⁵。
3. 使用"无缝"克隆策略将步骤 1.2 中生成的 DNA 片段与适当的 Y2H 载体组装（图 1）。
   注:无缝克隆系统，如Gibson组装⁶，最大限度地减少 了通过 自连接产生的空载体对构建的突变体文库的污染。 表 1 中提供了 Y2H 载体的列表。它们可以在组装前通过 BamHI 消化来制备。所有质粒均可从国家生物资源项目 - 酵母中获得（见 材料表）。
4. 将步骤1.3中产生的反应混合物引入根据高效大肠杆菌转化方案制备的大肠杆菌感受态细胞中（例如，Inoue^{等人7）。}将所有感受态细胞铺展在含有适当抗生素的几个LB平板（1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl和2%琼脂）上（参见材料表）。此时，将少量（总反应的~1/100）涂抹在同一选择板上以计算文库滴度。将板在37°C孵育过夜。
5. 一旦出现大量 大肠杆 菌菌落，使用一次性塑料环从板表面刮取所有细胞。使用常用方法（如碱性裂解⁸）从这些细胞中回收质粒 DNA。同时，计算在板上散布转化混合物的小等分试样后出现的菌落数。使用此数字估计库中独立克隆的总数。
   注意:此时，选取一些出现在铺有转化反应小等分试样的板上的几个独立菌落（4-6），将它们分开培养，并从中分离质粒，以确认几乎所有克隆都携带所需的DNA片段⁵。许多商业试剂盒可用于从 大肠杆菌中分离质粒。撒开小等分试样后出现在板上的菌落数量可以手动计算。
6. 测量文库DNA库的浓度。通常，几百纳克的文库DNA就足以在下一步中获得数千个转化子。
   注意:建议使用与 DNA 结合的荧光染料测量 DNA 浓度，因为 A₂₆₀ 的测量经常不准确。

2. 用突变体文库和复制铺板转化酵母

1. 将突变文库引入宿主酵母菌株（TAT-7（L40-ura3）^9,10 MATa，leu2-3,112，trp1-901，his3-Δ200，ade2-101，gal80Δ，LYS2:（lexAop）4-HIS3，ura3:（lexAop）_8-lacZ）使用约100ng DNA进行Y2H测定。用"诱饵"质粒预转化宿主细胞。
   1. 转化程序后，将酵母细胞悬浮在无菌水中，并将不同量的等分试样散布在适当的平板上（通常是缺乏亮氨酸和色氨酸的SC培养基:SC-LW [0.67%酵母氮基，2%葡萄糖，1.546g / L SC双滴混合物-Leu -Trp和2%琼脂，参见 材料表]）。将这些板在30°C下孵育过夜。
      注:标准方案，例如醋酸锂-PEG 方法¹¹ ，具有 ~5 × 10⁶ 个对数生长的细胞，足以用于酵母的转化。也可以使用另一种转化效率高的方法，例如电穿孔。
2. 第二天，当出现微小的菌落时，选择具有适当细胞数量（500-2000）的板，并按以下步骤从中进行复制。
3. 将两张滤纸放在复制块上，制成多个复制品（培养基为含有卡那霉素的SC-LW和SC-LW）（见 材料表）。在30°C孵育1-2天。
   注:卡那霉素 （G418） 的浓度为 600 μg/mL。不要使用天鹅绒进行复制电镀，因为菌落的分辨率会丢失。
4. 一旦菌落生长，比较板并选择候选板。如果使用 lacZ 作为报告基因，则执行Y2H颜色测定（参见步骤3）。
   注意:对于 Y2H 报告基因， lacZ 通常比 HIS3 更擅长检测弱相互作用。

3. Y2H显色法

1. 将一张预先切成适当尺寸的滤纸放在使用步骤 2 制备的复制板上。注意不要让气泡在滤纸和板之间形成。
   注意: 使用 4A 号滤纸或 50 级滤纸（见 材料表）。任何含有卡那霉素的SC-LW或SC-LW板，都是通过复制电镀制成的，可用于颜色测定。
2. 当板上的滤纸完全湿润时（当滤纸的颜色完全改变时），在上面放几张纸巾，使其与滤纸接触，以去除多余的水分。当纸巾吸收水分并变色时，请取下纸巾。重复此过程两到三次。
3. 用镊子捡起滤纸的边缘，迅速将其从板上撕下，浸入液氮中，然后冷冻。如果没有液氮，将滤纸放在塑料托盘上，菌落面朝上，然后立即将其放入冰箱（-20°C至-80°C）中完全冷冻。
4. 取出冷冻的滤纸，将其放在干燥的纸巾上，菌落面朝上解冻。解冻后，立即将滤纸（菌落面朝上）放在另一张滤纸上，该滤纸已放置在塑料托盘或可密封容器上，并用含有X-gal（5-溴-5-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷）和2-巯基乙醇9（参见材料表）的Z-缓冲液（60mM Na₂HPO 4,40mM NaH₂PO_4,10mM KCl和1mM MgSO _4，pH 7.0^）浸泡).注意不要让气泡在顶部和底部滤纸之间形成。
5. 盖上装有滤纸的塑料托盘，将其放入密闭容器或塑料袋中。关闭密闭容器或塑料袋，在37°C下孵育，直到出现蓝色。
6. 当出现蓝色时，将滤纸（菌落面朝上）放在放置在干净塑料托盘上的约 500 μL 终止溶液 （1 M Na₂CO₃） 上。停止溶液快速浸泡;因此，请立即取下过滤器，将其放在新鲜的纸巾上，菌落面朝上，然后晾干。
7. 更换纸巾并且过滤器足够干燥后，使用扫描仪或其他设备捕获数据。

4. 候选克隆的恢复和确认

1. 从复制品的原始板（或未用于颜色测定的复制板）中选择白色和 Kan^R 候选克隆。 示例如图 1C 所示。通过在含有卡那霉素的SC-LW培养基上将它们重新划线为小斑块，并在30°C下孵育1-2天，确认候选克隆是白色和Kan^R 。至少制作两组或在第二天进行复制。
   注意:应选择白色菌落，因为淡蓝色菌落可能会保留相互作用。
2. 一旦候选克隆重新生长良好，如步骤3中所述，使用步骤4.1中生成的至少一个板重复颜色测定，并确认它们保持白色并且不会变成蓝色（图2A）。
   注意:重新划线候选细胞时，不要携带大量细胞。细胞过多导致无法区分 Kan^R 和 Kan^S 克隆。
3. 从板残渣中取出仍然是白色和步骤4.2中产生的Kan^R 的克隆，并在1mL选择培养基（SC-L或SC-W，取决于用于文库构建的载体）中独立生长过夜。
4. 将培养物转移到微管中并通过离心（~15,000 × g，在室温下 10-30 秒）收集细胞。按如下方式从细胞沉淀中分离全 DNA。
5. 将细胞沉淀悬浮在含有1μL2-巯基乙醇和20mg / mL酶解酶100T的400μL裂解缓冲液（2%Triton X-100,1%SDS，100mM NaCl，10mM Tris-Cl（8.0）和1mM EDTA中（参见 材料表），并在37°C孵育30分钟以消化细胞壁。此时，每 5-10 分钟倒置试管轻轻混合。
6. 当细胞悬液变得不透明或半透明时，加入等体积的苯酚 - 氯仿 - 异戊醇（25:24:1）混合物，并通过中等速度涡旋10-20秒充分混合。
7. 在微量离心机中以全速（~15,000× g，室温）离心5分钟，并在新的微管中回收含有DNA的水相。加入 0.8 体积的异丙醇，倒置试管充分混合。
8. 将试管在室温下放置 2-3 分钟，然后在微量离心机中以全速（~15,000 × g，室温）离心 4-5 分钟以沉淀 DNA。
9. 除去上清液，用约500μL的70%乙醇洗涤沉淀物。完全去除乙醇并短暂干燥沉淀物。
10. 向沉淀物中加入 20 μL TE 缓冲液（10 mM Tris-Cl （8.0） 和 1 mM EDTA），短暂混合，并在室温下离开试管过夜以溶解沉淀物。
    注意:如果用户赶时间，请将试管保持在 37-50 °C。 DNA 沉淀物将在几个小时内溶解。
11. 一旦沉淀完全溶解，用少量的这种DNA溶液转化 大肠杆菌 。
    注:如果使用转化效率高的大 肠杆菌 ，则约 0.5 μL DNA 溶液就足够了。
12. 当 出现大肠杆菌 菌落时，选择几个独立的菌落，培养它们，并通过标准方法（例如碱性裂解）回收质粒。
13. 将步骤4.12中获得的质粒DNA引入含有诱饵质粒的Y2H宿主细胞中。当转化体出现时，通过颜色测定法（它们应显示为白色）和蛋白质印迹⁴ （它们应表达所需大小的蛋白质）进行检查。
    注:后碱性方法¹² 是从酵母制备全细胞提取物的一种简单快速的方法。
14. 如果满足上述两个标准，则通过核苷酸测^序4确定克隆的突变位点。

最近，发现Pol2蛋白（Pol2-C）的C端半部分与Mcm10相互作用。这两种蛋白质对于启动 DNA 复制都是必需的，因此对于出芽酵母酿酒酵母 13,14,15 中的细胞生长都是必需的。为了帮助理解这种相互作用的生物学意义，使用此处描述的方法分离出与 Mcm10 没有/减少相互作用的 Pol2-C 突变体。

按照步骤1中描述的方法构建突变文库。用 GoTaq 聚合酶扩增 Pol2-C DNA 片段，并使用 In-Fusion 酶克隆到 Gal4AD （pST2525） 载体中。据估计，文库中的独立克隆数量为5000个。

如步骤 2 所述，将文库质粒的 DNA 引入 Y2H 宿主菌株 TAT-7 中，该菌株用 LexA-Mcm10 质粒预转化。将细胞铺展在 SC-LW 平板上，并于次日复制到 SC-LW 和 SC-LW+G418 平板上。将重复品进行步骤3中所述的颜色测定。颜色测定的一些结果如图 1C所示。

从大约 8500 个转化体中分离出 47 个在颜色测定中为白色和 G418 抗性的菌落作为第一个候选菌落。他们再次用颜色测定法进行了测试，47个克隆中有25个被确认为白色（图2A）。这 25 个克隆被保留为候选基因。如步骤4所述，从25个候选质粒中的每一个中回收候选质粒DNA。将它们重新引入含有 LexA-Mcm10 的 Y2H 酵母宿主细胞中，并用颜色测定法进行测试，选择 16 个缺乏颜色的克隆。为了进一步确认这些是Pol2-C错义突变体，通过蛋白质印迹法证实了Pol2-C蛋白的表达。12 名候选物在几乎与阳性对照（Gal4AD-HA-Pol2-C-KanMX 融合蛋白，分子量:158.8 kDa）的位置表现出条带（图 2B）。颜色测定表明，这12个克隆不与Mcm10相互作用（图2C）。在确定了这些克隆的核苷酸序列后，确认它们都存在错义突变。错义突变的数量从1到5个不等（数据未显示）。平均而言，每 1000 个碱基中大约发生一个错义突变。

图 1:基于 Y2H 的方法用于筛选相互作用无效/受损突变体的示意图。 （A） Y2H系统。（B） 分离相互作用无效/受损突变体的策略。1:新构建的 Y2H 载体包含 Y2H 标签、DB 结构域和 AD 下游的 KanMX 基因拷贝。 重要的是，该 KanMX 基因缺少起始密码子，并且与 Y2H 标签处于框架外。因此，预计 KanMX 基因不会从该载体中表达。当PCR扩增的DNA片段插入载体中时，KanMX基因与Y2H标签位于框架内并表达。因此，只有具有野生型插入片段或具有错义突变的插入片段的质粒才能表达 KanMX 基因，该基因赋予对 G418 的抗性。具有无义突变或移码突变的质粒不能表达 KanMX 基因。2:将步骤1构建的突变文库引入Y2H宿主酵母细胞中。当转化体出现时，就会制作复制品。通过比较报告基因的表达和对G418的抗性，可以选择相互作用无效/受损突变体的候选者。（C） 甄别的一个例子。将含有 Gal4-AD 和 PCR 诱变的 Pol2-C DNA 片段的质粒文库引入 Y2H 宿主菌株 TAT-7 中，该菌株用 LexA-Mcm10 质粒预转化。显示了颜色测定之前（左）和之后（中）的细胞图像以及在SC-LW + G418板上生长的细胞（右）的图像。相互作用无效/受损突变体和虚假候选者的候选示例分别用白色和黑色箭头表示。（D） Y2H载体、AD（上）和DB（下）载体克隆位点周围的DNA序列。显示了从 Y2H 标签的最后十个氨基酸 （aa） （红色） 到 KanMX 的前十个氨基酸 （绿色） 对应的部分的序列。还显示了 SmaI 和 BamHI 的识别位点。当使用BamHI位点作为克隆位点时，PCR引物的位置显示在底部。相同的引物适用于将目的基因克隆到其他质粒中 （pST2303/2523）。该图由Tanaka等人4修改而来。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 2:相互作用无效/受损突变体的筛选过程示例。 （A） 如图 1C 所示，作为候选克隆分离的 47 个菌落再次在含有 G418 的 SC-LW 培养基上生长并进行颜色测定。+:阳性对照（Wt Pol2-C），-:阴性对照（载体）。培养编号为 1-25 的候选克隆以回收质粒。（B） 从（A）中的每个候选克隆中回收质粒，引入 Y2H 宿主细胞，然后再次进行颜色测定。其中16个是白色的（没有颜色）。从中制备全细胞提取物，并用抗HA单克隆抗体进行蛋白质印迹。面板上的数字对应于 （A） 中的数字。对从每个候选物中回收的几个独立质粒克隆进行了分析，但#6除外。（C） 最后 12 个克隆的颜色测定结果。数字与（A）中的数字相对应。#16 保留了与 Mcm10 的相互作用，用作颜色测定中的阳性对照。 请点击这里查看此图的较大版本.

表 1:包含带有 Y2H 标签的 KanMX 帧外的 Y2H 向量列表。

补充文件1:PCR混合物示例、引物详细信息和反应条件。请点击这里下载此文件。

提交人声明他们没有利益冲突。