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方法文章

利用酵母双杂交实验分离相互作用缺失/受损突变体

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DOI：

10.3791/66423

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2023年12月29日

 ,  , 
1Graduate School of Engineering, Kochi University of Technology, 2School of Engineering Science, Kochi University of Technology

本文内容

摘要

生物分子之间的相互作用，例如蛋白质-蛋白质相互作用，是生物功能的分子基础。如果能够分离出特异性缺失相关相互作用的相互作用缺失或功能受损突变体，将极大有助于理解该相互作用的功能。本文介绍了一种高效分离相互作用缺失或功能受损突变体的方法。

摘要

蛋白质-蛋白质相互作用是介导生物现象的最基本过程之一。理解特定蛋白质-蛋白质相互作用的作用和功能的最简单且最有效的方法之一，是比较野生型（存在相关蛋白质-蛋白质相互作用）与缺失该相互作用的突变体的表型。因此，若能分离到此类突变体，将有助于阐明相关的生物学过程。酵母双杂交（Y2H）技术不仅是一种检测蛋白质-蛋白质相互作用的有力方法，还可用于分离相互作用缺失或受损的突变体。本文介绍了一种利用Y2H技术分离相互作用缺失/受损突变体的实验方案。首先，通过结合聚合酶链式反应与高效的无缝克隆技术构建突变文库，该方法可高效排除文库中的空载体。其次，通过Y2H实验筛选相互作用缺失或受损的突变体。由于Y2H载体设计上的巧妙机制，诸如移码突变和无义突变等非预期突变体可在筛选过程中被高效剔除。该策略简便，因此可适用于任何可通过双杂交系统检测其相互作用的蛋白质组合。

引言

生物分子间的相互作用是生物现象最基本的组成部分，而蛋白质-蛋白质相互作用构成了这类相互作用的重要部分。因此，鉴定目标蛋白质的相互作用伴侣对于进一步阐明该蛋白质或基因的功能至关重要。酵母双杂交（Y2H）技术是一种广泛用于体内检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法in vivo1。在该系统中，待检测相互作用的两种蛋白质（X 和 Y）分别与DNA结合（DB）结构域和转录激活结构域（AD）融合。DB-X融合蛋白可结合至DB结构域的识别序列；因此，当蛋白质X与Y发生相互作用时，AD-Y融合蛋白将被带至该识别序列附近，从而激活位于识别序列下游的报告基因的转录。因此，可通过检测报告基因是否具有活性来判断蛋白质-蛋白质相互作用是否存在1。

一旦鉴定出目标蛋白的特定相互作用伙伴，应进一步开展分析以阐明该相互作用的生物学功能。为此，若能分离到破坏或消除特定蛋白-蛋白相互作用的蛋白突变体，则这些突变体可作为强有力的研究工具。酵母双杂交系统（Y2H）可直接用于筛选“无相互作用”克隆，从而分离此类突变体，起始材料为野生型的“有相互作用”克隆。为了加速这一过程，已开发出“反向”酵母双杂交（rY2H）系统2,3。在rY2H系统中，宿主酵母菌株携带可作为报告基因的反向选择性标记基因，这意味着只有当AD-Y与DB-X蛋白不发生相互作用时，酵母细胞才能生长。

尽管Y2H和rY2H系统均可用于分离相互作用阴性的突变体，但突变体的筛选过程较为繁琐，因为通过筛选获得的候选克隆并非全部携带所需类型的突变（通常为错义突变）。最严重的问题是，相当一部分候选克隆含有移码或无义突变，因此必须通过Western印迹法排除不理想的克隆。为解决这一问题，已开发出新的质粒载体4。在这些载体中，药物抗性标记KanMX被置于DNA结合结构域（DB结构域）或激活结构域（AD）下游的非阅读框位置。只有当目的基因正确插入时，标记基因才会与DB结构域或AD形成同框融合。当在目的基因中引入随机突变后，可通过药物抗性筛选轻松淘汰含有移码或无义突变等不良突变的克隆，而携带理想错义突变的候选克隆则可通过Y2H筛选快速鉴定4。本文提供了一种利用该策略分离目标蛋白相互作用缺失或减弱突变体的实验方案。

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方案

1. 突变文库的构建

  1. 设置聚合酶链式反应（PCR）（示例如下）。通常制备 50 µL 反应体系，将其均分为 10 份，每份 5 µL，在 PCR 仪中扩增目标基因片段4.
    注意：用户应选择合适的聚合酶以高效引入突变。若待扩增的DNA片段较短，则需要使用错误率较高的聚合酶，例如缺乏校对活性的Taq聚合酶；若待扩增的DNA片段较长，则需要使用高保真聚合酶，以减少突变数量。使用常规Taq聚合酶进行30轮扩增后，每数百个碱基对中即可能出现突变。4在代表性结果中，使用了不同的Taq聚合酶（参见 材料表），其保真度高于普通的Taq聚合酶，突变率为每600个碱基对中出现1个。PCR反应体系示例、引物详细信息及反应条件见于 补充文件 1.
  2. PCR 完成后，合并所有反应分装样品，通过琼脂糖凝胶电泳等方法确认目标 DNA 片段已扩增，并纯化 DNA5.
  3. 使用“无缝”克隆策略将步骤1.2中获得的DNA片段与适当的Y2H载体进行连接图1).
    注意：无缝克隆系统，例如 Gibson 组装6，可最大限度减少由空载体污染所造成的构建突变文库的污染 通过 自连。提供了用于酵母双杂交（Y2H）的载体列表。 表1. 它们可在组装前通过BamHI消化进行制备。所有质粒均可从国家生物资源项目-酵母（见 材料表).
  4. 将步骤1.3中生成的反应混合物引入 大肠杆菌 根据高效方法制备的感受态细胞 E. coli 转化方案（例如，Inoue 等）7). 将所有感受态细胞涂布于多个含有适当抗生素的LB平板（1% 胰蛋白胨、0.5% 酵母提取物、1% NaCl 和 2% 琼脂）上（参见 材料表）。此时，取少量反应产物（约总量的1/100）涂布于相同的筛选平板，以计算文库滴度。将平板置于37 °C过夜培养。
  5. 一旦获得大量 E. coli 菌落出现后，使用一次性塑料接种环从培养皿表面刮下所有细胞。采用常用方法（如碱裂解法）从这些细胞中提取质粒DNA。8同时，通过将转化混合物的小份样品涂布在平板上，计数出现的菌落数量。根据该数值，估算文库中独立克隆的总数。
    注意：此时应挑取平板上转化反应小量涂布后出现的数个独立菌落（4-6个），分别培养，并从中提取质粒，以确认几乎所有克隆均携带目标DNA片段5许多商业试剂盒可用于从质粒中分离 E. coli平板上涂布少量等分试样后出现的菌落数量可手动计数。
  6. 测定文库DNA池的浓度。通常，下一步获得数千个转化子只需几百纳克的文库DNA即可。
    注意：建议使用能够结合DNA的荧光染料来测定DNA浓度，因为通过A260 经常不准确。

2. 用突变文库转化酵母及复制平板接种

  1. 使用约 100 ng DNA 将突变文库导入宿主酵母菌株（TAT-7 (L40-ura3)9,10 MATa, leu2-3,112, trp1-901, his3-Δ200, ade2-101, gal80Δ, LYS2:(lexAop)4-HIS3, ura3:(lexAop)8-lacZ）以进行酵母双杂交（Y2H）实验。预先将“诱饵”质粒转化至宿主细胞中。
    1. 转化完成后，将酵母细胞悬浮于无菌水中，并将不同体积的菌液涂布于相应的平板上（通常为缺乏亮氨酸和色氨酸的 SC 培养基：SC-LW [0.67% 酵母氮源基础培养基，2% 葡萄糖，1.546 g/L SC 双缺氨基酸混合物 -Leu -Trp，2% 琼脂]，参见材料表）。于 30 °C 培养过夜。
      注意：标准转化方法（如乙酸锂-PEG 法11，使用约 5 × 106 处于对数生长期的细胞）足以满足酵母转化需求。也可采用转化效率更高的方法，例如电穿孔法。
  2. 次日，当出现微小菌落时，选择菌落数量适中（500–2000）的平板，并按如下方法制作多个复制平板。
  3. 在复制平板装置上放置两张滤纸，制备多个复制平板（培养基分别为 SC-LW 和含卡那霉素的 SC-LW）（参见材料表）。于 30 °C 培养 1–2 天。
    注意：卡那霉素（G418）浓度为 600 µg/mL。请勿使用绒布进行复制接种，以免菌落分辨率下降。
  4. 待菌落生长后，比较各平板并挑选候选克隆。若使用 lacZ 作为报告基因，则进行 Y2H 显色实验（见步骤 3）。
    注意：在 Y2H 报告系统中，lacZ 通常比 HIS3 更灵敏，更适合检测弱相互作用。

3. 酵母双杂交显色实验

  1. 将预先裁剪至合适尺寸的滤纸片放置在按步骤2制备的复制平板上。注意避免滤纸与平板之间产生气泡。
    注意：使用No. 4A滤纸或Grade 50滤纸（见材料表）。通过影印接种法制备的任何SC-LW或含卡那霉素的SC-LW平板均可用于显色实验。
  2. 当平板上的滤纸完全润湿（滤纸颜色完全改变）后，在其上方覆盖数层纸巾，使其与滤纸充分接触以去除多余水分。当纸巾吸水变色后立即更换。重复此过程两到三次。
  3. 用镊子夹住滤纸边缘，迅速将其从平板上剥离，浸入液氮中冷冻。若无液氮，可将滤纸菌落面向上放置于塑料托盘中，并立即放入冰箱（-20 °C 至 -80 °C）中彻底冷冻。
  4. 取出冷冻的滤纸，菌落面向上放置于干燥的纸巾上解冻。解冻后立即将其菌落面向上转移至另一张已放置于塑料托盘或可密封容器中、并用Z缓冲液（60 mM Na2HPO4、40 mM NaH2PO4、10 mM KCl 和 1 mM MgSO4，pH 7.0）浸润且含有X-gal（5-溴-5-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷）和2-巯基乙醇9（见材料表）的滤纸上。注意避免上下两层滤纸之间产生气泡。
  5. 用盖子盖住含有滤纸的塑料托盘，并将其放入密闭容器或塑料袋中。密封后于37 °C 培养，直至出现蓝色。
  6. 当出现蓝色时，将滤纸菌落面向上放置于洁净塑料托盘中约500 µL终止液（1 M Na2CO3）上。终止液会迅速被吸收，因此应立即取出滤纸，菌落面向上放置于新的纸巾上，并使其干燥。
  7. 更换纸巾并待滤纸充分干燥后，使用扫描仪或其他设备采集数据。

4. 候选克隆的回收与验证

  1. 选择白色和卡那霉素R 来自复制平板的原始平板（或未用于显色实验的复制平板）中的候选克隆。示例如下所示 图1C确认候选克隆为白色且具有卡那霉素抗性R 通过在含有卡那霉素的SC-LW培养基上重新划线接种为小块菌斑，并在30 °C下培养1-2天。至少制备两组，或于次日进行重复实验。
    注意：应选择白色菌落，因为浅蓝色菌落可能仍存在相互作用。
  2. 一旦候选克隆生长良好，按照步骤3所述方法，使用至少一块在步骤4.1中制备的平板重复显色实验，并确认菌落仍为白色，未变为蓝色（图2A).
    注意：重新划线接种候选菌落时，不要带入过多细胞。细胞量过多将导致无法区分卡那霉素（Kan）抗性菌落的生长情况。R 和 KanS 克隆
  3. 挑取仍呈白色且对卡那霉素（Kan）抗性的菌落R 在步骤4.2中，从平板残留物中挑取菌落，分别接种于1 mL选择性培养基（根据文库构建所用载体选择SC-L或SC-W）中，于30 °C过夜培养。
  4. 将培养物转移至微量离心管中，通过离心收集细胞（约15,000 × g，持续10-30秒 在室温下）按照如下步骤从细胞沉淀中提取总DNA。
  5. 将细胞沉淀重悬于 400 µL 裂解缓冲液（含 2% Triton X-100、1% SDS、100 mM NaCl、10 mM Tris-Cl (8.0) 和 1 mM EDTA）中，每管加入 1 µL 巯基乙醇和 1 µL 20 mg/mL Zymolyase 100T（见 材料表），37 °C孵育30分钟以消化细胞壁。孵育期间，每5-10分钟轻柔颠倒试管混匀一次。
  6. 当细胞悬液变得不透明或半透明时，加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇混合液（25:24:1），并在中等速度下涡旋振荡10–20秒，充分混匀。
  7. 将微量离心管在微量离心机中以全速（约15,000 × g）离心5分钟。 g, 在室温下孵育，然后将含有 DNA 的水相转移至新的微量离心管中。加入 0.8 倍体积的异丙醇，通过倒置混匀管壁充分混合。
  8. 将离心管在室温下静置 2-3 分钟，然后在微型离心机中以全速（约 15,000 × g在室温下沉淀DNA。
  9. 移除上清液，用约 500 µL 70% 乙醇洗涤沉淀。彻底去除乙醇后，短暂干燥沉淀。
  10. 加入20 µL TE缓冲液（10 mM Tris-Cl (8.0) 和 1 mM EDTA）至沉淀中，短暂混匀，室温放置过夜以溶解沉淀。
    注意：如果使用者时间紧迫，可将试管置于 37–50 °C 环境中，DNA 沉淀将在数小时内溶解。
  11. 一旦沉淀完全溶解，进行转化 E. coli 用少量该DNA溶液。
    注意：如果使用约 0.5 µL 的 DNA 溶液即已足够 E. coli 使用具有高转化效率的菌株。
  12. 当 E. coli 菌落出现后，挑取数个独立菌落进行培养，并通过标准方法（如碱裂解法）回收质粒。
  13. 将步骤4.12中获得的质粒DNA导入含有诱饵质粒的Y2H宿主细胞中。当转化子出现后，通过显色实验（应呈白色）和蛋白质印迹法进行检测。4 （它们应表达出具有目标大小的蛋白质）。
    注意：后碱法12 是一种从酵母中制备全细胞提取物的简便快速方法。
  14. 若满足上述两个标准，则通过核苷酸测序确定克隆的突变位点4.

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结果

最近研究发现，Pol2 蛋白的C端部分（Pol2-C）与 Mcm10 相互作用。这两种蛋白对于DNA复制的起始以及酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的细胞生长均至关重要13,14,15。为了帮助理解这一相互作用的生物学意义，本研究采用此处所述方法筛选出与 Mcm10 无相互作用或相互作用减弱的 Pol2-C 突变体。

按照步骤1中所述方法构建突变文库。使用GoTaq聚合酶扩增Pol2-C DNA片段，并利用In-Fusion酶将其克隆至Gal4AD（pST2525）载体中。文库中独立克隆的数量估计为5000个。

如步骤2所述，将文库质粒的DNA导入已预先转化LexA-Mcm10质粒的Y2H宿主菌株TAT-7中。将细胞涂布于SC-LW平板上，并于次日转接到SC-LW和SC-LW+G418平板上。随后按...

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讨论

本文介绍了如何利用酵母双杂交（Y2H）实验分离相互作用缺失或受损的突变体。这类突变体是研究目标蛋白功能的有力工具。为分离此类突变体，此前已通过改造Y2H宿主菌株开发出重组Y2H（rY2H）实验方法2,3，但这些方法并未显著减少实验工作量。相比之下，本方法可在无需大量人力的情况下实现突变体的分离。在本方法中，通过对Y2H载体进行改造，理论上可确保所有候选克隆均为野生型或错义突变体。此外，该方法还能高效地从候选克隆中剔除空载体。由于具备上述理想特性，该方法有望成为分离相互作用缺失或受损突变体的标准方法。

尽管这些方法简单直接，但要获得良好的结果仍需注意几个关键步骤：复制平板接种（步骤 2.3）以及用于显色检测的菌落转移（步骤 3.2 和 3.3）。因此，视频中展示了这些步骤。对于步骤 2.3，用户必须使用适当的滤纸，而非传统的绒布，具体说明见该步骤的注释，以获得清晰且高分辨率的复制平板。对于步骤 3.2 和 3.3，建议用户至少准备两份复制平板作为备用，因为有时菌落无法...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

Y. Tanaka 完成了酵母双杂交技术的改进。本工作由日本学术振兴会科学研究费补助金（JSPS KAKENHI）JP22K06336 号和大阪发酵研究所资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.5 M EDTA (8.0)Nacalai Tesque Inc.14347-21
10% SDS 溶液Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.313-90275
2-巯基乙醇Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.135-07522
2-丙醇Kishida Chemical Co. Ltd.110-64785
5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳吡喃糖苷（X-Gal）Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.021-07852
琼脂FormediumAGR60
氨苄青霉素钠Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.68-52-3
抗HA标签单克隆抗体-HRP-DirecT  Medical & Biological Laboratories Co. Ltd.M180-7
鲑鱼精DNAMerck KGaA.D1626
乙醇Merck KGaA.9-0770-4-4L-J
菌落杂交用滤纸（Grade 50）Whatman, Cytiva1450-090
菌落杂交用滤纸（No.4A）Advantec Toyo Kaisha, Ltd.01411090
复制平板用滤纸（No.1）Advantec Toyo Kaisha, Ltd.00011150
G-418 硫酸盐Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.075-05962
盐酸Kishida Chemical Co. Ltd.230-37585
KClFujifilm Wako Pure Chemical Corp.163-03545
二水合乙酸锂Nacalai Tesque Inc.20604-22
MgSO4•7H2OFujifilm Wako Pure Chemical Corp.131-00405
Na2HPO4•12H2ONacalai Tesque Inc.10039-32-4
NaClNacalai Tesque Inc.31319-45
NaH2PO4•2H2ONacalai Tesque Inc.31717-25
纸巾AS ONE Corp.7-6200-02
苯酚:氯仿:异戊醇 25:24:1Nacalai Tesque Inc.25970-56
质粒DNA日本国家生物资源计划 - 酵母（https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml）
质粒提取试剂盒Nippon Genetics Co. Ltd.FG-90502
聚乙二醇#4,000Nacalai Tesque Inc.11574-15
SC双缺失培养基混合物 -Leu -TrpFormediumDSCK172
无缝克隆试剂盒（In-Fusion连接）Takara Bio Inc.#639648
脱脂奶粉Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.190-12865
硫酸链霉素Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.3810-74-0
Taq DNA聚合酶（GoTaq Green Master Mix）Promega Corp.M7122
TRIS（羟甲基）氨基甲烷FormediumTRIS01
Triton X-100Nacalai Tesque Inc.12967-45
胰蛋白胨ThermoFisher Scientific Inc.211705
Tween 20Nacalai Tesque Inc.35624-15
酵母提取物ThermoFisher Scientific Inc.212750
酵母氮源基础（YNB）FormediumCYN0210
Zymolyase 100TNacalai Tesque Inc.07665-55

参考文献

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