使用酵母双杂交试验分离相互作用无效/受损突变体

摘要

生物分子的相互作用，如蛋白质-蛋白质相互作用，是生物学功能的分子基础。如果可以分离出特别缺乏相关相互作用的相互作用无效/受损突变体，它们将极大地有助于理解这种相互作用的功能。本文提出了一种有效的方法来分离相互作用无效/受损的突变体。

摘要

蛋白质-蛋白质相互作用是构成生物现象的最基本过程之一。理解特定蛋白质-蛋白质相互作用的作用和功能的最简单和最好的方法之一是比较野生型的表型（具有相关的蛋白质-蛋白质相互作用）和缺乏相关相互作用的突变体的表型。因此，如果能够分离出这样的突变体，它们将有助于阐明相关的生物学过程。酵母双杂交 （Y2H） 程序是一种强大的方法，不仅可以检测蛋白质-蛋白质相互作用，还可以分离相互作用无效/受损的突变体。在本文中，提出了一种使用 Y2H 技术分离相互作用无效/受损突变体的协议。首先，将聚合酶链反应与高效的无缝克隆技术相结合，构建突变文库，有效地从文库中排除空载体;其次，通过Y2H测定筛选相互作用无效/受损的突变体。由于 Y2H 载体中的一个技巧，不需要的突变体，例如具有移码和无义突变的突变体，可以有效地从筛选过程中消除。这种策略很简单，因此可以应用于任何蛋白质组合，其相互作用可以被双杂交系统检测到。

引言

生物分子之间的相互作用是生物现象中最基本的部分。蛋白质-蛋白质相互作用构成了这种相互作用的重要组成部分。因此，鉴定目标蛋白的相互作用伙伴对于进一步阐明目标蛋白质/基因的功能至关重要。酵母双杂交 （Y2H） 方法是一种用于鉴定体内蛋白质-蛋白质相互作用的常用技术 ¹。在该系统中，要测试其相互作用的两种蛋白质（X 和 Y）分别融合到 DNA 结合 （DB） 结构域和转录激活结构域 （AD）。DB-X 融合蛋白与 DB 结构域的识别序列结合;因此，当蛋白质 X 和 Y 相互作用时，AD-Y 融合蛋白就会接近识别序列。因此，识别序列下游的报告基因转录被激活。因此，报告基因活性的存在与否可用于确定蛋白质-^{蛋白质相互作用的存在}与否1。

一旦确定了目标蛋白质的特定相互作用伙伴，就应进行进一步分析以阐明相互作用的生物学功能。为此，如果可以分离出损害或去除特定蛋白质-蛋白质相互作用的蛋白质突变体，它们将成为强大的工具。Y2H系统可以通过筛选"相互作用阴性"克隆直接用于分离此类突变体，从野生型"相互作用阳性"克隆开始。为了加速这一过程，开发了"反向"Y2H （rY2H） 系统 ^2,3。在 rY2H 系统中，宿主酵母菌株具有反选标记基因作为报告基因，这意味着酵母细胞仅在 AD-Y 和 DB-X 蛋白不相互作用时生长。

尽管 Y2H 和 rY2H 系统都允许分离相互作用阴性突变体，但分离突变体的过程非常费力，因为并非所有通过筛选获得的候选基因都携带所需类型的突变（通常是错义突变）。最严重的问题是，很大一部分候选基因存在移码或无义突变，因此有必要进行蛋白质印迹法以排除不需要的克隆。为了克服这个问题，已经开发了新的质粒载体⁴.在这些向量中，KanMX（一种耐药性标记物）位于 DB 域或 AD 下游的帧外。只有当目的基因入时，标记基因才会与DB结构域或AD一起进入框架。当在目的基因中引入随机突变时，不需要的突变体，例如具有移码或无义突变的突变体，可以通过进行耐药性选择轻松消除，并且携带理想错义突变的候选突变可以通过Y2H^筛选轻松识别4。本文提出了一种方案，用于使用该策略分离目标蛋白质的相互作用无效/受损突变体。

方案

1. 突变体库的建设

1. 设置聚合酶链反应 （PCR）（示例如下所示）。通常制备 50 μL 的反应物，将其分成 10 份 5 μL 的等分试样，并在 PCR 仪⁴ 中扩增目标基因片段。
   注意:用户应选择适当的聚合酶以有效地引入突变。如果要扩增的DNA片段较短，则需要错误率较高的聚合酶，例如缺乏校对活性的Taq聚合酶。如果要扩增的DNA片段很长，则需要更高保真度的聚合酶来减少突变的数量。使用常规 Taq 聚合酶⁴ 扩增 30 个周期后，每几百个碱基对发生一次突变。在代表性结果中，使用了不同的Taq聚合酶（参见 材料表），其保真度高于常规Taq聚合酶，突变率为600个碱基对中的1。PCR混合物的示例、引物详细信息和反应条件在 补充文件1中提供。
2. 当PCR完成后，合并反应的所有等分试样，确认目标DNA片段已使用琼脂糖凝胶电泳等法扩增，并纯化DNA⁵。
3. 使用"无缝"克隆策略将步骤 1.2 中生成的 DNA 片段与适当的 Y2H 载体组装（图 1）。
   注:无缝克隆系统，如Gibson组装⁶，最大限度地减少 了通过 自连接产生的空载体对构建的突变体文库的污染。 表 1 中提供了 Y2H 载体的列表。它们可以在组装前通过 BamHI 消化来制备。所有质粒均可从国家生物资源项目 - 酵母中获得（见 材料表）。
4. 将步骤1.3中产生的反应混合物引入根据高效大肠杆菌转化方案制备的大肠杆菌感受态细胞中（例如，Inoue^{等人7）。}将所有感受态细胞铺展在含有适当抗生素的几个LB平板（1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl和2%琼脂）上（参见材料表）。此时，将少量（总反应的~1/100）涂抹在同一选择板上以计算文库滴度。将板在37°C孵育过夜。
5. 一旦出现大量 大肠杆 菌菌落，使用一次性塑料环从板表面刮取所有细胞。使用常用方法（如碱性裂解⁸）从这些细胞中回收质粒 DNA。同时，计算在板上散布转化混合物的小等分试样后出现的菌落数。使用此数字估计库中独立克隆的总数。
   注意:此时，选取一些出现在铺有转化反应小等分试样的板上的几个独立菌落（4-6），将它们分开培养，并从中分离质粒，以确认几乎所有克隆都携带所需的DNA片段⁵。许多商业试剂盒可用于从 大肠杆菌中分离质粒。撒开小等分试样后出现在板上的菌落数量可以手动计算。
6. 测量文库DNA库的浓度。通常，几百纳克的文库DNA就足以在下一步中获得数千个转化子。
   注意:建议使用与 DNA 结合的荧光染料测量 DNA 浓度，因为 A₂₆₀ 的测量经常不准确。

2. 用突变体文库和复制铺板转化酵母

1. 将突变文库引入宿主酵母菌株（TAT-7（L40-ura3）^9,10 MATa，leu2-3,112，trp1-901，his3-Δ200，ade2-101，gal80Δ，LYS2:（lexAop）4-HIS3，ura3:（lexAop）_8-lacZ）使用约100ng DNA进行Y2H测定。用"诱饵"质粒预转化宿主细胞。
   1. 转化程序后，将酵母细胞悬浮在无菌水中，并将不同量的等分试样散布在适当的平板上（通常是缺乏亮氨酸和色氨酸的SC培养基:SC-LW [0.67%酵母氮基，2%葡萄糖，1.546g / L SC双滴混合物-Leu -Trp和2%琼脂，参见 材料表]）。将这些板在30°C下孵育过夜。
      注:标准方案，例如醋酸锂-PEG 方法¹¹ ，具有 ~5 × 10⁶ 个对数生长的细胞，足以用于酵母的转化。也可以使用另一种转化效率高的方法，例如电穿孔。
2. 第二天，当出现微小的菌落时，选择具有适当细胞数量（500-2000）的板，并按以下步骤从中进行复制。
3. 将两张滤纸放在复制块上，制成多个复制品（培养基为含有卡那霉素的SC-LW和SC-LW）（见 材料表）。在30°C孵育1-2天。
   注:卡那霉素 （G418） 的浓度为 600 μg/mL。不要使用天鹅绒进行复制电镀，因为菌落的分辨率会丢失。
4. 一旦菌落生长，比较板并选择候选板。如果使用 lacZ 作为报告基因，则执行Y2H颜色测定（参见步骤3）。
   注意:对于 Y2H 报告基因， lacZ 通常比 HIS3 更擅长检测弱相互作用。

3. Y2H显色法

1. 将一张预先切成适当尺寸的滤纸放在使用步骤 2 制备的复制板上。注意不要让气泡在滤纸和板之间形成。
   注意: 使用 4A 号滤纸或 50 级滤纸（见 材料表）。任何含有卡那霉素的SC-LW或SC-LW板，都是通过复制电镀制成的，可用于颜色测定。
2. 当板上的滤纸完全湿润时（当滤纸的颜色完全改变时），在上面放几张纸巾，使其与滤纸接触，以去除多余的水分。当纸巾吸收水分并变色时，请取下纸巾。重复此过程两到三次。
3. 用镊子捡起滤纸的边缘，迅速将其从板上撕下，浸入液氮中，然后冷冻。如果没有液氮，将滤纸放在塑料托盘上，菌落面朝上，然后立即将其放入冰箱（-20°C至-80°C）中完全冷冻。
4. 取出冷冻的滤纸，将其放在干燥的纸巾上，菌落面朝上解冻。解冻后，立即将滤纸（菌落面朝上）放在另一张滤纸上，该滤纸已放置在塑料托盘或可密封容器上，并用含有X-gal（5-溴-5-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷）和2-巯基乙醇9（参见材料表）的Z-缓冲液（60mM Na₂HPO 4,40mM NaH₂PO_4,10mM KCl和1mM MgSO _4，pH 7.0^）浸泡).注意不要让气泡在顶部和底部滤纸之间形成。
5. 盖上装有滤纸的塑料托盘，将其放入密闭容器或塑料袋中。关闭密闭容器或塑料袋，在37°C下孵育，直到出现蓝色。
6. 当出现蓝色时，将滤纸（菌落面朝上）放在放置在干净塑料托盘上的约 500 μL 终止溶液 （1 M Na₂CO₃） 上。停止溶液快速浸泡;因此，请立即取下过滤器，将其放在新鲜的纸巾上，菌落面朝上，然后晾干。
7. 更换纸巾并且过滤器足够干燥后，使用扫描仪或其他设备捕获数据。

4. 候选克隆的恢复和确认

1. 从复制品的原始板（或未用于颜色测定的复制板）中选择白色和 Kan^R 候选克隆。 示例如图 1C 所示。通过在含有卡那霉素的SC-LW培养基上将它们重新划线为小斑块，并在30°C下孵育1-2天，确认候选克隆是白色和Kan^R 。至少制作两组或在第二天进行复制。
   注意:应选择白色菌落，因为淡蓝色菌落可能会保留相互作用。
2. 一旦候选克隆重新生长良好，如步骤3中所述，使用步骤4.1中生成的至少一个板重复颜色测定，并确认它们保持白色并且不会变成蓝色（图2A）。
   注意:重新划线候选细胞时，不要携带大量细胞。细胞过多导致无法区分 Kan^R 和 Kan^S 克隆。
3. 从板残渣中取出仍然是白色和步骤4.2中产生的Kan^R 的克隆，并在1mL选择培养基（SC-L或SC-W，取决于用于文库构建的载体）中独立生长过夜。
4. 将培养物转移到微管中并通过离心（~15,000 × g，在室温下 10-30 秒）收集细胞。按如下方式从细胞沉淀中分离全 DNA。
5. 将细胞沉淀悬浮在含有1μL2-巯基乙醇和20mg / mL酶解酶100T的400μL裂解缓冲液（2%Triton X-100,1%SDS，100mM NaCl，10mM Tris-Cl（8.0）和1mM EDTA中（参见 材料表），并在37°C孵育30分钟以消化细胞壁。此时，每 5-10 分钟倒置试管轻轻混合。
6. 当细胞悬液变得不透明或半透明时，加入等体积的苯酚 - 氯仿 - 异戊醇（25:24:1）混合物，并通过中等速度涡旋10-20秒充分混合。
7. 在微量离心机中以全速（~15,000× g，室温）离心5分钟，并在新的微管中回收含有DNA的水相。加入 0.8 体积的异丙醇，倒置试管充分混合。
8. 将试管在室温下放置 2-3 分钟，然后在微量离心机中以全速（~15,000 × g，室温）离心 4-5 分钟以沉淀 DNA。
9. 除去上清液，用约500μL的70%乙醇洗涤沉淀物。完全去除乙醇并短暂干燥沉淀物。
10. 向沉淀物中加入 20 μL TE 缓冲液（10 mM Tris-Cl （8.0） 和 1 mM EDTA），短暂混合，并在室温下离开试管过夜以溶解沉淀物。
    注意:如果用户赶时间，请将试管保持在 37-50 °C。 DNA 沉淀物将在几个小时内溶解。
11. 一旦沉淀完全溶解，用少量的这种DNA溶液转化 大肠杆菌 。
    注:如果使用转化效率高的大 肠杆菌 ，则约 0.5 μL DNA 溶液就足够了。
12. 当 出现大肠杆菌 菌落时，选择几个独立的菌落，培养它们，并通过标准方法（例如碱性裂解）回收质粒。
13. 将步骤4.12中获得的质粒DNA引入含有诱饵质粒的Y2H宿主细胞中。当转化体出现时，通过颜色测定法（它们应显示为白色）和蛋白质印迹⁴ （它们应表达所需大小的蛋白质）进行检查。
    注:后碱性方法¹² 是从酵母制备全细胞提取物的一种简单快速的方法。
14. 如果满足上述两个标准，则通过核苷酸测^序4确定克隆的突变位点。

结果

最近，发现Pol2蛋白（Pol2-C）的C端半部分与Mcm10相互作用。这两种蛋白质对于启动 DNA 复制都是必需的，因此对于出芽酵母酿酒酵母 13,14,15 中的细胞生长都是必需的。为了帮助理解这种相互作用的生物学意义，使用此处描述的方法分离出与 Mcm10 没有/减少相互作用的 Pol2-C 突变体。

按照步骤1中描述的方法构建突变文库。用 GoTaq 聚合酶扩增 Pol2-C DNA 片段，并使用 In-Fusion 酶克隆到 Gal4AD （pST2525） 载体中。据估计，文库中的独立克隆数量为5000个。

如步骤 2 所述，将文库质粒的 DNA 引入 Y2H 宿主菌株 TAT-7 中，该菌株用 LexA-Mcm10 质粒预转化。将细胞铺展在 SC-LW 平板上，并于次日复制到 SC-LW 和 SC-LW+G41...

讨论

本文介绍如何使用 Y2H 检测分离相互作用无效/受损的突变体。这种突变体是分析目标蛋白质功能的有力工具。为了分离此类突变体，以前通过修饰 Y2H 宿主菌株 ^2,3 开发了 rY2H 测定法。然而，他们并没有大大减少劳动量。相比之下，可以使用这种方法分离突变体，而无需大量的劳动力。在这种方法中，理论上，对Y2H载体的修饰可确保所有候选突变体都是野生型或错义突变体。此外，该方法可以有效地消除候选向量中的空向量。由于这些理想的特性，这种方法可能成为分离相互作用无效/受损突变体的标准方法。

尽管这些方法简单明了，但要获得良好的结果，有几个关键步骤:复制铺板（步骤2.3）和颜色测定的菌落提升（步骤3.2和3.3）。因此，这些步骤显示在视频中。对于步骤 2.3，用户必须使用适当的滤纸而不是传统的天鹅绒，如此步骤的 NOTE 中所述，以获得离散和高分辨率的复制品。对于步骤 3.2 和 3.3，用户应准备至少两个复制板作为备份，因为有时菌落无法完全提升。如果第一块板的提升不完整，用...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 M EDTA （8.0）	Nacalai Tesque Inc.	14347-21
10% SDS 溶液	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	313-90275
2-巯基乙醇	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	135-07522
2-丙醇	岸田化学有限公司	110-64785
5-溴-4-氯-3-吲哚基-β;-D-吡喃半乳糖苷 （X-Gal）	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	021-07852
琼脂	培养基	AGR60
氨苄青霉素钠	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	68-52-3
抗 HA 标签 mAb-HRP-DirecT	医疗 &Biological Laboratories Co. Ltd. 生物实验室有限公司	M180-7
DNA，默	克 KGaA。	D1626
乙醇	Merck KGaA.	9-0770-4-4L-J
菌落提升滤纸（50 级）	Whatman， Cytiva1450-090
菌落提升滤纸（No.4A）	Advantec Toyo Kaisha， Ltd.
复制电镀用滤纸（No.1）	Advantec Toyo Kaisha， Ltd.
G-418 硫酸盐	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	075-05962
盐酸	岸田化学有限公司	230-37585
KCl	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	163-03545
二水醋酸锂	Nacalai Tesque Inc.	20604-22
硫酸镁4&公牛;7H2O	富士和光纯化学公司	131-00405
Na2HPO4&公牛;12H2O	Nacalai Tesque 公司	10039-32-4
NaCl	Nacalai Tesque Inc.	31319-45
NaH2PO4&公牛;2H2O	Nacalai Tesque 公司	31717-25
纸巾	AS ONE Corp.	7-6200-02
苯酚：氯仿：异戊醇 25：24：1	Nacalai Tesque Inc.	25970-56
质粒 DNA	国家生物资源计划 - 酵母 （https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml）
质粒分离试剂盒	Nippon Genetics Co. Ltd.	FG-90502
聚乙二醇 #4,000	Nacalai Tesque Inc.	11574-15
SC 双缺失混合物 -Leu -Trp	Formedium	DSCK172
无缝克隆试剂盒（In-Fusion 组装）	Takara Bio Inc.	#639648
脱脂奶粉	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	190-12865
硫酸链霉素	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	3810-74-0
Taq 聚合酶 （GoTaq Green Master Mixes）	Promega Corp.	M7122
TRIS （羟甲基） 氨基甲烷	Formedium	TRIS01
Triton X-100	Nacalai Tesque Inc.	12967-45
胰蛋白胨	ThermoFisher scientific Inc.
Tween 20	Nacalai Tesque Inc.	35624-15
酵母提取物	ThermoFisher scientific Inc.	212750
酵母氮基 （YNB）	用于中	CYN0210
酶解酶 100T	Nacalai Tesque Inc.	07665-55