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体外膜氧合对凝血系统的影响

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DOI：

10.3791/66433

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2024年2月23日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiopulmonary Bypass, Fuwai Hospital, National Center for Cardiovascular Disease, State Key Laboratory of Cardiovascular Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2Department of Anesthesiology, Beijing Chao-Yang Hospital, Capital Medical University, 3Department of Anesthesiology, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们介绍了一种建立绵羊长期清醒体外膜氧合（ECMO）模型的实验方案。本方案特别关注在ECMO模型期间对凝血系统的管理和评估。

摘要

本研究旨在探讨在绵羊模型中长期清醒状态下体外膜肺氧合（ECMO）对凝血系统的影响。共纳入10只健康绵羊，每组5只。在静脉-动脉ECMO（V-A ECMO）组中，导管插入右侧颈动脉和右侧颈外静脉。在静脉-静脉ECMO（V-V ECMO）组中，使用双腔导管插入右侧颈外静脉。ECMO启动后，绵羊从麻醉状态恢复并保持清醒状态7天。目标活化凝血时间（ACT）设定为220–250秒。在两组中，实际ACT值在250秒左右波动，肝素剂量逐渐增加，实验结束时接近60 IU/kg/min。此外，尽管接受相同剂量的肝素，V-A ECMO组的活化部分凝血活酶时间（APTT）和凝血酶时间（TT）值显著高于V-V ECMO组。尽管实验室检测结果在正常且合理的范围内波动，但在研究结束时，两组均观察到肾脏出现梗死灶。

引言

体外膜肺氧合（ECMO）是一种挽救生命的干预措施，可为重症患者提供心肺支持。ECMO主要分为两种类型：静脉-动脉ECMO（V-A ECMO）和静脉-静脉ECMO（V-V ECMO）1,2。V-A ECMO适用于发生循环衰竭的患者，而V-V ECMO则适用于存在呼吸衰竭但无严重心血管功能障碍的患者3,4。

血栓和出血是ECMO患者中常见的并发症5。ECMO管路使血液暴露于人工表面，从而引发复杂的凝血反应6。这些过程可能导致内皮损伤和微循环障碍，进而引起重要器官的功能障碍7,8。因此，有效的全身抗凝管理被认为是ECMO患者治疗中的关键环节。尽管如此，在不同ECMO相关的临床情境中，仍缺乏指导抗凝策略的充分证据。

建立稳定的ECMO动物模型有助于深入了解ECMO对机体的影响，对于优化ECMO管理策略、减少ECMO相关并发症以及改善临床患者的预后具有重要意义。由于绵羊和猪等大动物的生理参数与人类高度相似，因此是建立ECMO模型的主要选择9,10。然而，既往的大动物ECMO模型维持时间通常不足24小时，难以全面评估ECMO对凝血系统的影响11。因此，有必要建立长期ECMO大动物模型，以深入探究ECMO的病理生理机制。利用长期大动物模型研究ECMO对凝血系统的作用，可为临床实践提供更为坚实的证据支持。

本研究旨在健康绵羊中建立长期（7天）清醒状态下的动静脉（V-A）和静脉-静脉（V-V）体外膜肺氧合模型。整个模型建立与评估的核心重点是抗凝管理。

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方案

本实验方案已获得阜外医院机构动物护理与使用委员会的批准（编号：0101-2-20-HX(X)）。所有操作均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》中规定的准则。实验在阜外医院心血管植入材料北京市重点实验室、阜外医院动物实验中心（注册编号：CNAS LA0009）进行。研究所用的健康绵羊均来自阜外医院动物实验中心，并符合规定的检疫标准。此外，本研究遵循《动物研究：In Vivo 实验报告》指南。选用雄性小尾寒羊，体重范围为50–65 kg，年龄范围为12–24个月（见材料表），术前在无特定病原体环境中饲养，自由进食饮水，适应期至少一周。将绵羊随机分为两组，每组5只：静脉-动脉体外膜氧合（V-A ECMO）组和静脉-静脉体外膜氧合（V-V ECMO）组。选择健康绵羊的依据在于需精确评估ECMO支持对机体的影响。研究中使用的仪器和试剂列于材料表中。

1. 动物准备

  1. 手术前，将健康的成年绵羊禁食48小时，并禁水12小时。
  2. 手术前对所有手术器械和ECMO参数进行灭菌。确保为手术团队所有成员提供个人防护装备，包括手术帽、一次性口罩、清洁手术服、鞋套、无菌手术衣和无菌手套。
  3. 通过耳缘静脉注射丙泊酚（5 mg/kg）。如前所述，将血压袖带固定在大腿上，并将心电图导联放置于四肢。将血压袖带和心电图导联连接至监护仪，用于心电图和无创血压监测12.
  4. 将单腔气管导管插入气管，并连接至呼吸机，采用容量控制通气模式。设置参数如下：潮气量：8–10 mL/kg，呼吸频率：12–20 次/分钟，初始吸氧浓度（FiO₂）：60%。
  5. 以静脉麻醉（丙泊酚，8-10 mg/kg/h）联合吸入麻醉（异氟烷 2%-3%）维持麻醉。术中镇痛采用间歇性静脉注射氟比洛芬（1-2 mg/kg）。
  6. 将绵羊置于手术台上，使用弹性布带固定其四肢。分离左侧颈总动脉和颈静脉，分别插入单腔中心静脉导管（18 Fr）和三腔中心静脉导管（7 Fr）。将左侧颈总动脉上的18 G导管连接至监护仪，用于血流动力学监测。将左侧颈静脉上的7 Fr三腔中心静脉导管通过三通阀连接至输液泵和监护仪，以实现静脉输液、药物注射及中心静脉压监测的同步进行。所有连接均使用三通阀完成。采集静脉或动脉血液样本 通过 三通旋塞阀
    注意：导管插入后，使用2-0外科缝线将导管与血管结扎固定。
  7. 暴露右侧颈总动脉和颈静脉。通过右侧颈静脉推注肝素（120 IU/kg）实现全身抗凝。
    注意：插管时的目标活化凝血时间（ACT）应高于250秒。

2. 插管

  1. 建立 V-A ECMO 管路：通过右侧颈动脉插入动脉导管（18 Fr），深度为 10–15 cm，并通过右侧颈外静脉插入静脉导管（24 Fr），直至右心房。
  2. 建立 V-V ECMO 管路：暴露右侧颈外静脉，并通过该静脉插入双腔导管（23 Fr）。
    注意：在操作过程中，维持绵羊的血压和心率在基线值的 ±20% 范围内。保持动脉二氧化碳分压（PaCO2）在 35–40 mmHg 之间。确保呼气末二氧化碳分压（EtCO2）维持在 35–45 mmHg 之间。当绵羊出现血压或心率波动时，调整麻醉深度。若此措施无效或出现紧急情况，可考虑使用血管活性药物。通过调整呼吸机参数（主要关注潮气量和呼吸频率）将 PaCO2 和 EtCO2 维持在正常范围内。
  3. 在 V-V ECMO 中，将导管尖端经右心房（RA）送入下腔静脉（IVC）。将双腔导管的流出端朝向三尖瓣（需在超声引导下确认位置）。
    注意：导管插入后，使用 2-0 外科缝线将导管与血管结扎固定。使用 4-0 外科缝线缝合皮肤切口。

3. 启动体外膜肺氧合（ECMO）

  1. 根据制造商的说明连接所有ECMO设备（参见材料表），确保无任何泄漏。
    注意：连接过程中应遵循无菌操作原则。
  2. 预充液由生理盐水（1000 mL）加肝素2000 IU组成。手动将预充液注入ECMO管路并确认管路内无气泡后，启动离心泵进行预充（1000–1500 rpm）。
  3. 预充完成后，关闭离心泵。将引流管连接至离心泵的入口，将回输管连接至氧合器的出口。所有连接均使用三通旋塞阀完成，并通过三通旋塞阀排出连接处的空气。将氧气源连接至ECMO系统，确保氧流量正确。随后启动离心泵开始ECMO运行，初始泵流量设置为2.0 L/min，泵转速为3000 rpm。
  4. 将ECMO管路在绵羊颈部半环形固定，以防止管路移位或扭曲。

4. 术后管理和监测

  1. 手术完成后，将绵羊转移至代谢笼中，并对其进行适当固定。
    注意：特别注意固定绵羊的头部和肩部，防止套管发生移位或弯曲。逐渐降低麻醉深度。术后护理人员应穿戴防护装备（无菌服、手套、口罩和帽子），做好个人防护。
  2. 当确认呼吸稳定且血气分析结果正常后，拔除气管插管。
  3. 术后最初24小时内，静脉输注氟比洛芬（1–2 mg/kg）和右美托咪定（0.2–0.3 µg/kg·h），以实现镇静和镇痛。
    注意：术后24小时后，若绵羊因术后疼痛出现躁动或血压波动，可考虑使用镇静和镇痛药物。
  4. 在监测笼内，确保绵羊可在一定范围内自由活动，并可自由摄取适量饲料和饮水。
  5. 持续实时监测基本生命体征（心率和动脉血压）以及ECMO液压参数（泵流量、泵转速、泵前压力、泵后压力和氧合器后压力）。
    注意：设定ECMO管理的目标参数（泵流量：2.0–2.5 L/min，泵转速：3000–3500 rpm，氧流量：1.0–1.5 L/min，FiO₂为50%–80%）。根据血气分析结果调整上述参数。
  6. 每6小时检测一次血气和活化凝血时间（ACT），每日监测血常规、血液生化及凝血功能。根据凝血指标调整抗凝策略。
    注意：目标ACT值为220–250秒。
  7. 根据液体平衡调整静脉输液，维持中心静脉压（CVP）在5–12 cm H2O之间。每日静脉注射头孢呋辛钠（1.5 g，i.v.，b.i.d.）以预防感染。每日进行切口消毒，并密切观察有无感染或出血迹象。

5. 安乐死

  1. 经过7天的实验期后，移除ECMO管路。
  2. 在丙泊酚（20 mg/kg）镇静下，静脉注射氯化钾（100 mg/kg）实施安乐死。
    注意：安乐死后，采集主要器官（心脏、肾脏、肺、肝脏、脑和肠道），肉眼检查是否存在梗死、出血或明显损伤。所有器官损伤均需详细记录。随后将器官切成小块，置于4%甲醛中固定，石蜡包埋，并切成4 µm厚的切片，进行苏木精-伊红（HE）染色13。由至少两名病理学家独立在光学显微镜下对HE染色切片进行组织学检查。

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结果

整个实验共评估了十只绵羊，每组五只（表1）。ECMO启动后，所有绵羊均从麻醉中恢复，并在清醒状态下维持7天。两个组的ECMO流量均超过1.8 L/min。在V-V ECMO组中，流量在1.8 L/min左右波动；而在V-A ECMO组中，流量范围为2.3 L/min至1.8 L/min（图1A）。每只绵羊的生命体征保持稳定。两组在苏醒后60小时至180小时期间，血乳酸水平均低于1 mmol/L（图1B）。在整个7天期间，ACT水平目标维持在220–250 s左右，实际ACT值在250 s上下波动（图1C），肝素剂量逐渐增加，实验结束时接近60 IU/kg/min（图1D）。

两组的凝血酶原时间（PT）均在15 s至32 s之间（图2A）。在整个实验过程中...

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讨论

本研究概述了在绵羊中建立稳定、长期存活的静脉-静脉（V-V）和静脉-动脉（V-A）体外膜肺氧合（ECMO）模型的操作流程。所有存活动物的生命体征均保持稳定，未发生严重出血或凝血事件。ECMO的血流和氧合性能稳定，未观察到重大病理损伤。本研究提供了关于抗凝管理的详细信息。

抗凝管理在ECMO围手术期护理中起着至关重要的作用。最初，根据以往的研究，目标ACT设定为180-220秒14,15,16,17。然而，在预实验阶段，观察到氧合器（见材料表）中出现纤维蛋白沉积和血栓形成，表明绵羊需要更高的抗凝水平。尽管未出现明显的出血征象且血小板计数相对稳定，仍将目标ACT调整为220-250秒。这一抗凝目标的调整凸显了绵羊与人类之间的血液学差异。调整后，氧合器中的纤维蛋白沉积和血栓形成减少，氧合器功能趋于稳定...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ACT分析仪Hemochron，美国Jr 签名
麻醉机德国 Drager公司 普里默斯
动脉导管Edwards Lifescience，美国18-Fr为静脉-动脉体外膜肺氧合提供动脉回输通路
血液化学分析仪IDEXX Laboratories，美国 Catalyst One
血气分析仪Abbott，美国Abbott i-STAT1
离心泵中国江苏STMed科技有限公司STM CP-24 I
离心泵驱动装置与控制台中国江苏STMed科技有限公司OASSIST STM001
凝血分析仪北京赛克尔科技，中国SF-8050
全血细胞计数分析仪西门子医疗，德国ADVIA 2120i
双通道微量注射泵中国浙江史密斯医疗器械WZS-50F6
双腔导管MAQUET Avalon Elite，德国23-Fr为静脉-静脉体外膜肺氧合（VV-ECMO）建立右颈外静脉的回流与引流通路
氟比洛芬中国北京泰德制药有限公司5毫升：50毫克
GraphPad 软件GraphPad Software，美国GraphPad Prism v9.0统计分析
肝素 中国上海上药第一生化制药有限公司2 ml：12500 IU
高频电外科COVIDIEN，美国力 F
多参数医用监护仪荷兰MP60
氧合器套件德国梅多斯Hilite 7000LT
氧合器套件德国马奎特BE-PLS 2050
丙泊酚  Xi’中国Libang制药有限公司20毫升：0.2克
单腔中心静脉导管中国台湾18Fr插入左侧颈总动脉  用于血流动力学监测和血液采样。
小尾寒羊金玉通丰商贸有限公司，中国体重：50-65 千克，年龄：12-24 个月
三腔中心静脉导管中国台湾7Fr插入左侧颈静脉，用于静脉输液、给药和采血。
超声波仪器美国通用电气公司，美国E9
静脉导管Edwards Lifescience，美国24-Fr为静脉-动脉体外膜肺氧合（VA-ECMO）提供静脉引流通路
呼吸机德国 Drager 萨维娜

参考文献

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