体外膜氧合对凝血系统的影响

摘要

我们介绍了一种建立绵羊长期清醒体外膜氧合（ECMO）模型的实验方案。本方案特别关注在ECMO模型期间对凝血系统的管理和评估。

摘要

本研究旨在探讨在绵羊模型中长期清醒状态下体外膜肺氧合（ECMO）对凝血系统的影响。共纳入10只健康绵羊，每组5只。在静脉-动脉ECMO（V-A ECMO）组中，导管插入右侧颈动脉和右侧颈外静脉。在静脉-静脉ECMO（V-V ECMO）组中，使用双腔导管插入右侧颈外静脉。ECMO启动后，绵羊从麻醉状态恢复并保持清醒状态7天。目标活化凝血时间（ACT）设定为220–250秒。在两组中，实际ACT值在250秒左右波动，肝素剂量逐渐增加，实验结束时接近60 IU/kg/min。此外，尽管接受相同剂量的肝素，V-A ECMO组的活化部分凝血活酶时间（APTT）和凝血酶时间（TT）值显著高于V-V ECMO组。尽管实验室检测结果在正常且合理的范围内波动，但在研究结束时，两组均观察到肾脏出现梗死灶。

引言

体外膜肺氧合（ECMO）是一种挽救生命的干预措施，可为重症患者提供心肺支持。ECMO主要分为两种类型：静脉-动脉ECMO（V-A ECMO）和静脉-静脉ECMO（V-V ECMO）^1,2。V-A ECMO适用于发生循环衰竭的患者，而V-V ECMO则适用于存在呼吸衰竭但无严重心血管功能障碍的患者^3,4。

血栓和出血是ECMO患者中常见的并发症⁵。ECMO管路使血液暴露于人工表面，从而引发复杂的凝血反应⁶。这些过程可能导致内皮损伤和微循环障碍，进而引起重要器官的功能障碍^7,8。因此，有效的全身抗凝管理被认为是ECMO患者治疗中的关键环节。尽管如此，在不同ECMO相关的临床情境中，仍缺乏指导抗凝策略的充分证据。

建立稳定的ECMO动物模型有助于深入了解ECMO对机体的影响，对于优化ECMO管理策略、减少ECMO相关并发症以及改善临床患者的预后具有重要意义。由于绵羊和猪等大动物的生理参数与人类高度相似，因此是建立ECMO模型的主要选择^9,10。然而，既往的大动物ECMO模型维持时间通常不足24小时，难以全面评估ECMO对凝血系统的影响¹¹。因此，有必要建立长期ECMO大动物模型，以深入探究ECMO的病理生理机制。利用长期大动物模型研究ECMO对凝血系统的作用，可为临床实践提供更为坚实的证据支持。

本研究旨在健康绵羊中建立长期（7天）清醒状态下的动静脉（V-A）和静脉-静脉（V-V）体外膜肺氧合模型。整个模型建立与评估的核心重点是抗凝管理。

方案

本实验方案已获得阜外医院机构动物护理与使用委员会的批准（编号：0101-2-20-HX(X)）。所有操作均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》中规定的准则。实验在阜外医院心血管植入材料北京市重点实验室、阜外医院动物实验中心（注册编号：CNAS LA0009）进行。研究所用的健康绵羊均来自阜外医院动物实验中心，并符合规定的检疫标准。此外，本研究遵循《动物研究：In Vivo 实验报告》指南。选用雄性小尾寒羊，体重范围为50–65 kg，年龄范围为12–24个月（见材料表），术前在无特定病原体环境中饲养，自由进食饮水，适应期至少一周。将绵羊随机分为两组，每组5只：静脉-动脉体外膜氧合（V-A ECMO）组和静脉-静脉体外膜氧合（V-V ECMO）组。选择健康绵羊的依据在于需精确评估ECMO支持对机体的影响。研究中使用的仪器和试剂列于材料表中。

1. 动物准备

1. 手术前，将健康的成年绵羊禁食48小时，并禁水12小时。
2. 手术前对所有手术器械和ECMO参数进行灭菌。确保为手术团队所有成员提供个人防护装备，包括手术帽、一次性口罩、清洁手术服、鞋套、无菌手术衣和无菌手套。
3. 通过耳缘静脉注射丙泊酚（5 mg/kg）。如前所述，将血压袖带固定在大腿上，并将心电图导联放置于四肢。将血压袖带和心电图导联连接至监护仪，用于心电图和无创血压监测¹².
4. 将单腔气管导管插入气管，并连接至呼吸机，采用容量控制通气模式。设置参数如下：潮气量：8–10 mL/kg，呼吸频率：12–20 次/分钟，初始吸氧浓度（FiO₂）：60%。
5. 以静脉麻醉（丙泊酚，8-10 mg/kg/h）联合吸入麻醉（异氟烷 2%-3%）维持麻醉。术中镇痛采用间歇性静脉注射氟比洛芬（1-2 mg/kg）。
6. 将绵羊置于手术台上，使用弹性布带固定其四肢。分离左侧颈总动脉和颈静脉，分别插入单腔中心静脉导管（18 Fr）和三腔中心静脉导管（7 Fr）。将左侧颈总动脉上的18 G导管连接至监护仪，用于血流动力学监测。将左侧颈静脉上的7 Fr三腔中心静脉导管通过三通阀连接至输液泵和监护仪，以实现静脉输液、药物注射及中心静脉压监测的同步进行。所有连接均使用三通阀完成。采集静脉或动脉血液样本 通过 三通旋塞阀
   注意：导管插入后，使用2-0外科缝线将导管与血管结扎固定。
7. 暴露右侧颈总动脉和颈静脉。通过右侧颈静脉推注肝素（120 IU/kg）实现全身抗凝。
   注意：插管时的目标活化凝血时间（ACT）应高于250秒。

2. 插管

1. 建立 V-A ECMO 管路：通过右侧颈动脉插入动脉导管（18 Fr），深度为 10–15 cm，并通过右侧颈外静脉插入静脉导管（24 Fr），直至右心房。
2. 建立 V-V ECMO 管路：暴露右侧颈外静脉，并通过该静脉插入双腔导管（23 Fr）。
   注意：在操作过程中，维持绵羊的血压和心率在基线值的 ±20% 范围内。保持动脉二氧化碳分压（PaCO2）在 35–40 mmHg 之间。确保呼气末二氧化碳分压（EtCO2）维持在 35–45 mmHg 之间。当绵羊出现血压或心率波动时，调整麻醉深度。若此措施无效或出现紧急情况，可考虑使用血管活性药物。通过调整呼吸机参数（主要关注潮气量和呼吸频率）将 PaCO2 和 EtCO2 维持在正常范围内。
3. 在 V-V ECMO 中，将导管尖端经右心房（RA）送入下腔静脉（IVC）。将双腔导管的流出端朝向三尖瓣（需在超声引导下确认位置）。
   注意：导管插入后，使用 2-0 外科缝线将导管与血管结扎固定。使用 4-0 外科缝线缝合皮肤切口。

3. 启动体外膜肺氧合（ECMO）

1. 根据制造商的说明连接所有ECMO设备（参见材料表），确保无任何泄漏。
   注意：连接过程中应遵循无菌操作原则。
2. 预充液由生理盐水（1000 mL）加肝素2000 IU组成。手动将预充液注入ECMO管路并确认管路内无气泡后，启动离心泵进行预充（1000–1500 rpm）。
3. 预充完成后，关闭离心泵。将引流管连接至离心泵的入口，将回输管连接至氧合器的出口。所有连接均使用三通旋塞阀完成，并通过三通旋塞阀排出连接处的空气。将氧气源连接至ECMO系统，确保氧流量正确。随后启动离心泵开始ECMO运行，初始泵流量设置为2.0 L/min，泵转速为3000 rpm。
4. 将ECMO管路在绵羊颈部半环形固定，以防止管路移位或扭曲。

4. 术后管理和监测

1. 手术完成后，将绵羊转移至代谢笼中，并对其进行适当固定。
   注意：特别注意固定绵羊的头部和肩部，防止套管发生移位或弯曲。逐渐降低麻醉深度。术后护理人员应穿戴防护装备（无菌服、手套、口罩和帽子），做好个人防护。
2. 当确认呼吸稳定且血气分析结果正常后，拔除气管插管。
3. 术后最初24小时内，静脉输注氟比洛芬（1–2 mg/kg）和右美托咪定（0.2–0.3 µg/kg·h），以实现镇静和镇痛。
   注意：术后24小时后，若绵羊因术后疼痛出现躁动或血压波动，可考虑使用镇静和镇痛药物。
4. 在监测笼内，确保绵羊可在一定范围内自由活动，并可自由摄取适量饲料和饮水。
5. 持续实时监测基本生命体征（心率和动脉血压）以及ECMO液压参数（泵流量、泵转速、泵前压力、泵后压力和氧合器后压力）。
   注意：设定ECMO管理的目标参数（泵流量：2.0–2.5 L/min，泵转速：3000–3500 rpm，氧流量：1.0–1.5 L/min，FiO₂为50%–80%）。根据血气分析结果调整上述参数。
6. 每6小时检测一次血气和活化凝血时间（ACT），每日监测血常规、血液生化及凝血功能。根据凝血指标调整抗凝策略。
   注意：目标ACT值为220–250秒。
7. 根据液体平衡调整静脉输液，维持中心静脉压（CVP）在5–12 cm H₂O之间。每日静脉注射头孢呋辛钠（1.5 g，i.v.，b.i.d.）以预防感染。每日进行切口消毒，并密切观察有无感染或出血迹象。

5. 安乐死

1. 经过7天的实验期后，移除ECMO管路。
2. 在丙泊酚（20 mg/kg）镇静下，静脉注射氯化钾（100 mg/kg）实施安乐死。
   注意：安乐死后，采集主要器官（心脏、肾脏、肺、肝脏、脑和肠道），肉眼检查是否存在梗死、出血或明显损伤。所有器官损伤均需详细记录。随后将器官切成小块，置于4%甲醛中固定，石蜡包埋，并切成4 µm厚的切片，进行苏木精-伊红（HE）染色¹³。由至少两名病理学家独立在光学显微镜下对HE染色切片进行组织学检查。

结果

整个实验共评估了十只绵羊，每组五只（表1）。ECMO启动后，所有绵羊均从麻醉中恢复，并在清醒状态下维持7天。两个组的ECMO流量均超过1.8 L/min。在V-V ECMO组中，流量在1.8 L/min左右波动；而在V-A ECMO组中，流量范围为2.3 L/min至1.8 L/min（图1A）。每只绵羊的生命体征保持稳定。两组在苏醒后60小时至180小时期间，血乳酸水平均低于1 mmol/L（图1B）。在整个7天期间，ACT水平目标维持在220–250 s左右，实际ACT值在250 s上下波动（图1C），肝素剂量逐渐增加，实验结束时接近60 IU/kg/min（图1D）。

两组的凝血酶原时间（PT）均在15 s至32 s之间（图2A）。在整个实验过程中，某些时间点V-V ECMO组的活化部分凝血活酶时间（APTT）和凝血酶时间（TT）低于V-A ECMO组（APTT差异具有统计学意义）（图2B，C）。各组国际标准化比值（INR）均在1.5左右波动（图2D）。纤维蛋白原、纤维蛋白降解产物、D-二聚体和血小板在两组间的波动趋势相似，且均保持在正常范围内（图3）。

两组绵羊的血清肌酐和血尿素氮水平在整个实验过程中均保持在正常范围内，且两组之间无统计学差异（图4）。此外，观察到两组的液体平衡在0附近仅有轻微波动，且两组的中心静脉压（CVP）在整个研究期间均维持在正常范围内（图5）。实验结束时，尽管实验室检测结果均在正常且合理的范围内波动，但两组绵羊的肾脏均出现梗死灶（图6 和 表1）。

图1：基本参数监测。（A）ECMO血流。（B）乳酸。（C）ACT。（D）肝素剂量。乳酸，乳酸；ACT，活化凝血时间；V-V ECMO，静脉-静脉体外膜氧合；V-A ECMO，静脉-动脉体外膜氧合。数值：均值 ± 标准误。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：凝血功能检测结果。（A）PT。（B）APTT。（C）TT。（D）INR。PT，凝血酶原时间；APTT，活化部分凝血活酶时间；TT，凝血酶时间；INR，国际标准化比值；V-V ECMO，静脉-静脉体外膜氧合；V-A ECMO，静脉-动脉体外膜氧合。采用非配对t检验对各时间点的两组间差异进行比较。数值以均值±标准误表示；*P < 0.05；P > 0.05的结果未显示。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：两组患者的纤维蛋白原、纤维蛋白降解产物、D-二聚体和血小板计数。 （A）FIB。（B）FDP。（C）D-二聚体。（D）PLT。FIB，纤维蛋白原；FDP，纤维蛋白降解产物；PLT，血小板计数；V-V ECMO，静脉-静脉体外膜氧合；V-A ECMO，静脉-动脉体外膜氧合。采用非配对t检验对每个时间点的两组进行比较。数值以均值±标准误表示；P > 0.05的结果未显示。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：肾功能监测。 （A）肌酐。（B）尿素氮（BUN）。V-V ECMO，静脉-静脉体外膜氧合；V-A ECMO，静脉-动脉体外膜氧合；BUN，血液尿素氮。采用非配对t检验对每个时间点的两组进行比较。数值：均值 ± 标准误；P > 0.05 的结果未显示。请点击此处查看该图的放大版本。

图5：液体平衡与CVP值的动态变化。（A）V-V ECMO组每日液体平衡变化。（B）V-A ECMO组每日液体平衡变化。（C）CVP监测。采用非配对t检验比较两组在各时间点的CVP值。数据以均值±标准误表示；P > 0.05的结果未显示。CVP，中心静脉压；V-V ECMO，静脉-静脉体外膜氧合；V-A ECMO，静脉-动脉体外膜氧合；PSD，术后天数。请点击此处查看该图的放大版本。

图6：两组动物的肾脏解剖结构及苏木精-伊红染色结果。 比例尺：400 µm；插图：100 µm。V-V ECMO，静脉-静脉体外膜氧合；V-A ECMO，静脉-动脉体外膜氧合。请点击此处查看该图的放大版本。

绵羊编号	性别	体重 (kg)	肾脏病理结果*
VA1	雄性	58	无
VA2	雄性	54	无
VA3	雄性	55	局灶性小梗死
VA4	雄性	56	局灶性小梗死
VA5	雄性	57	局灶性小梗死
VV1	雄性	56	无
VV2	雄性	60	无
VV3	雄性	63	无
VV4	雄性	59	无
VV5	雄性	60	局灶性小梗死
*肾脏病理诊断由两名独立的病理学家完成，以获得客观评估。

表1：两组患者的肾脏病理结果。

讨论

本研究概述了在绵羊中建立稳定、长期存活的静脉-静脉（V-V）和静脉-动脉（V-A）体外膜肺氧合（ECMO）模型的操作流程。所有存活动物的生命体征均保持稳定，未发生严重出血或凝血事件。ECMO的血流和氧合性能稳定，未观察到重大病理损伤。本研究提供了关于抗凝管理的详细信息。

抗凝管理在ECMO围手术期护理中起着至关重要的作用。最初，根据以往的研究，目标ACT设定为180-220秒^14,15,16,17。然而，在预实验阶段，观察到氧合器（见材料表）中出现纤维蛋白沉积和血栓形成，表明绵羊需要更高的抗凝水平。尽管未出现明显的出血征象且血小板计数相对稳定，仍将目标ACT调整为220-250秒。这一抗凝目标的调整凸显了绵羊与人类之间的血液学差异。调整后，氧合器中的纤维蛋白沉积和血栓形成减少，氧合器功能趋于稳定。

在整个实验过程中，观察到绵羊血小板计数呈现先下降后上升的趋势。值得注意的是，在未接受全血或血小板输注的情况下，血小板计数在第7^天时已恢复并超过基线水平。在接受持续肝素输注的健康绵羊中，血小板计数的初期下降可能归因于肝素诱导的血小板减少症¹⁸。随后的上升则可通过绵羊凝血系统和造血系统的代偿机制加以解释。

此外，在向健康绵羊给予相同剂量肝素的情况下，V-A ECMO 的 APTT 和 TT 值明显高于 V-V ECMO。这一观察结果表明，在肝素抗凝后，V-A ECMO 对凝血参数的反应性更强。在之前的一项队列研究中发现，为达到相似的 APTT 水平，接受 V-A ECMO 支持的患者所需肝素剂量低于接受 V-V ECMO 支持的患者。此外，V-A ECMO 患者表现出凝血因子消耗增加¹⁹。这些发现共同提示，在这两种 ECMO 模式之间，凝血管理需要采取不同的考虑策略。

尽管几乎所有实验室检测结果均在正常且合理的范围内波动，但在实验结束时，两组动物的肾脏中均发现了梗死灶。这表明，重要器官的灌注和凝血状况仍是体外膜肺氧合（ECMO）管理的关键重点，强调仅依靠实验室检测无法准确评估器官状态。

在管理该模型的过程中，肝素剂量逐渐增加，表明在长期 ECMO 管理中需要进行动态抗凝。然而，用于正常绵羊的 ECMO 抗凝策略可能无法直接适用于危重症患者的临床情况。危重症及其炎症反应的复杂性可能进一步破坏患者的止血平衡，尤其是在获得性高凝状态和高炎症反应的情况下，例如在 COVID-19 患者中所观察到的现象^7,20。在不同临床情况下，ECMO 的抗凝策略仍是重要的临床考量因素。未来需要开展更详细的临床试验，以研究针对术前基础凝血状态不同的患者以及处于不同临床情况（如 V-V 和 V-A 模型）下的患者所适用的 ECMO 抗凝策略。

本研究仍存在一些局限性。首先，未设置假手术对照组。其次，为了尽量减少血液消耗，未对炎症标志物进行动态监测。此外，本研究未建立与体外膜肺氧合（ECMO）相关的疾病动物模型，且本文所述的ECMO术后管理方案可能与临床实践存在差异。

综上所述，长期清醒绵羊 ECMO 模型在抗凝管理中将目标 ACT 值维持在 220–250 秒之间，显示出可行且稳定。除了密切监测凝血功能外，重要器官的灌注功能仍是 ECMO 管理中的重点。未来还需进一步实验，深入探讨疾病动物 ECMO 模型中适宜的抗凝管理策略。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ACT分析仪	Hemochron，美国	Jr 签名
麻醉机	德国 Drager公司	普里默斯
动脉导管	Edwards Lifescience，美国	18-Fr	为静脉-动脉体外膜肺氧合提供动脉回输通路
血液化学分析仪	IDEXX Laboratories，美国	Catalyst One
血气分析仪	Abbott，美国	Abbott i-STAT1
离心泵	中国江苏STMed科技有限公司	STM CP-24 I
离心泵驱动装置与控制台	中国江苏STMed科技有限公司	OASSIST STM001
凝血分析仪	北京赛克尔科技，中国	SF-8050
全血细胞计数分析仪	西门子医疗，德国	ADVIA 2120i
双通道微量注射泵	中国浙江史密斯医疗器械	WZS-50F6
双腔导管	MAQUET Avalon Elite，德国	23-Fr	为静脉-静脉体外膜肺氧合（VV-ECMO）建立右颈外静脉的回流与引流通路
氟比洛芬	中国北京泰德制药有限公司	5毫升：50毫克
GraphPad 软件	GraphPad Software，美国	GraphPad Prism v9.0	统计分析
肝素	中国上海上药第一生化制药有限公司	2 ml：12500 IU
高频电外科	COVIDIEN，美国	力 F
多参数医用监护仪	荷兰	MP60
氧合器套件	德国梅多斯	Hilite 7000LT
氧合器套件	德国马奎特	BE-PLS 2050
丙泊酚	Xi’中国Libang制药有限公司	20毫升：0.2克
单腔中心静脉导管	中国台湾	18Fr	插入左侧颈总动脉  用于血流动力学监测和血液采样。
小尾寒羊	金玉通丰商贸有限公司，中国	体重：50-65 千克，年龄：12-24 个月
三腔中心静脉导管	中国台湾	7Fr	插入左侧颈静脉，用于静脉输液、给药和采血。
超声波仪器	美国通用电气公司，美国	E9
静脉导管	Edwards Lifescience，美国	24-Fr	为静脉-动脉体外膜肺氧合（VA-ECMO）提供静脉引流通路
呼吸机	德国 Drager	萨维娜