本方案描述了一种基于生物发光共振能量转移（BRET）的检测方法，用于在活细胞中测量CRAF激酶与14-3-3蛋白之间的相互作用。本方案详细说明了细胞准备、BRET信号检测及数据分析的步骤。此外，还提供了一个示例结果，包括适当对照的设置以及用于优化检测条件的故障排除方法。
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本文内容
摘要
摘要
CRAF 是 RAS GTP 酶的主要效应因子，在多种由 KRAS 驱动的癌症发生过程中发挥关键作用。此外，CRAF 是种系突变的热点区域，这些突变已被证实可导致发育性 RAS 病——努南综合征（Noonan syndrome）。所有 RAF 激酶均含有多个依赖磷酸化的 14-3-3 调控蛋白结合位点。在信号传导条件下，14-3-3 对这些位点的差异性结合在质膜上形成有活性的 RAF 二聚体过程中起着至关重要的作用；而在静息状态下，则有助于维持 RAF 的自抑制状态。理解这些相互作用的调控机制及其可被调节的方式，对于发现靶向 RAF 功能的新型治疗策略至关重要。本文介绍了一种基于生物发光共振能量转移（BRET）的检测方法，用于在活细胞中测量 CRAF 与 14-3-3 蛋白之间的相互作用。具体而言，该检测方法通过将 CRAF 与 Nano luciferase 供体融合、14-3-3 与 Halo tag 受体融合，当 RAF 与 14-3-3 相互作用时，引发供体向受体的能量转移，从而产生 BRET 信号。本方案进一步表明，该信号可被已知阻断 14-3-3 与 RAF 高亲和力结合位点相互作用的突变所破坏。本实验流程详细描述了细胞接种、转染和重铺板的操作步骤，以及 BRET 发射信号的读取、数据分析和蛋白表达水平验证的具体操作方法。此外，还提供了示例检测结果，以及优化和故障排除的步骤。
引言
RAF 激酶（ARAF、BRAF 和 CRAF）是 RAS GTP 酶的直接效应分子，也是促增殖/促存活的 RAF-MEK-ERK 激酶级联反应的起始成员。最近的研究表明，CRAF 的表达在多种 KRAS 驱动的癌症（包括非小细胞肺癌和胰腺导管腺癌1,2,3,4,5）的肿瘤发生中起关键作用。此外，种系 CRAF 突变会导致一种特别严重的 RAS 病变综合征——努南综合征（Noonan syndrome）6,7。深入理解 CRAF 的调控机制，对于开发靶向其细胞功能的有效治疗策略至关重要。
所有RAF激酶均可分为两个功能域：C端的催化域（CAT）和N端的调控域（REG），后者控制其活性（图1A）8。REG域包含RAS结合域（RBD）、富含半胱氨酸的结构域（CRD）以及一个富含丝氨酸/苏氨酸的区域（S/T-rich）。值得注意的是，S/....
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方案
注意：本实验在293FT细胞中进行。293FT细胞是一种特性明确且易于转染的上皮细胞系，源自人胚胎肾细胞。一个10 cm培养皿中长满的此类细胞通常可提供足够接种20个6孔组织培养板孔的细胞数量。步骤1-3必须在生物安全柜中采用无菌技术操作。
1. 细胞接种（第1天）
注意：在此步骤中，将细胞从组织培养皿中分离，计数后接种于6孔组织培养板中，用于步骤2的转染（图2）。
- 吸弃10 cm培养皿中的培养基。用5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，然后吸弃。
- 加入1 mL胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA），在37 °C孵育3–5分钟，使细胞从培养皿上脱落。
- 向细胞中加入9 mL完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），以中和胰蛋白酶，并反复吹打混匀，制备成均一的单细胞悬液。
- 立即转移20 µL细胞至1.7 mL离心管中，与20 µL台盼蓝染液混合。使用自动细胞计数仪（材料表）或血细胞计数板进行细胞计数。
- 将细胞用完全DMEM培养基稀释至2 × 105 个细胞/mL，并向6孔组织培养板的每孔加入2 mL（每孔4 × 105 个细胞）。于37 °C、10% CO....
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结果
按照本方案所述操作（图2），Nano-CRAFWT 与 14-3-3ζ-Halo 的相互作用应产生 50–60 mBU 的校正后 BRET 比值（图3A；补充表1）。CRAF 含有两个依赖磷酸化的 14-3-3 结合位点，即 N' 位点和 C' 位点（图1）8。因此，用于减少 CRAF:14-3-3ζ 结合的适当对照包括 S259A 和 S621A 突变，它们分别阻止 N' 和 C' 位点的磷酸化，从而阻止 14-3-3 的结合25。如 图3A 所示，Nano-CRAFS259A 使 BRET 信号降低约 45%，Nano-CRAFS621A 降低约 25%，而 S259A/S621A（SS/AA）双突变体几.......
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讨论
既往研究表明，14-3-3 蛋白在 RAF 激酶的激活和抑制过程中均发挥关键作用。深入了解这些结合事件的调控机制，以及调控这些相互作用对 RAF 信号传导和 RAF 驱动的肿瘤发生的影响，可能揭示靶向 CRAF 功能的新治疗弱点。然而，Raf 激活循环受到多种相关蛋白、翻译后修饰以及亚细胞定位变化的支持8，因此为了完全重现这些条件，必须在活细胞环境中检测 RAF 与其调控因子之间的相互作用。本方案描述了一种基于邻近关系的新方法，该方法利用纳米荧光素酶-Halo N-BRET 配对系统优异的信噪比和光谱分辨率，用于在活细胞中检测 14-3-3ζ 与 CRAF 的相互作用。
尽管该检测方法为在生理相关条件下研究14-3-3与CRAF之间复杂的相互作用提供了亟需的平台，但仍存在若干局限性需加以考虑。首先，鉴于已有研究表明14-3-3在RAF自抑制和二聚化过程中均发挥作用8，可结合其他对照和实验方法来区分这些状态。例如，本实验可与先前开发的N-BRET自抑制检测法联合使用，后者可直接反映RAF自.......
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披露
无任何利益冲突需要披露。
致谢
本项目部分资金来自美国国家癌症研究所、美国国立卫生研究院的联邦基金，项目编号为 ZIA BC 010329。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>抗体 | |||
| HaloTag® 小鼠单克隆抗体 | Promega | G9211 | 用于检测HaloTag标签的抗体 通过免疫印迹检测蛋白质 |
| NanoLuc® 小鼠单克隆抗体 | R&D Systems | MAB10026 | 用于免疫印迹检测Nano标签蛋白的抗体 |
| CRAF小鼠单克隆抗体（E10） | Santa Cruz Biotechnology | sc-7267 | 直接通过免疫印迹检测CRAF蛋白的抗体 |
| ECL 抗小鼠 HRP 二抗 | Amersham | NA931-1ML | 辣根过氧化物酶标记的鼠二抗（来源于羊） |
| <强>试剂 | |||
| X-tremeGENE™ 9 | 罗氏/西格玛 | 6365809001 | |
| NanoBRET™ 试剂盒 | Promega | N1661 | 含Halo 618配体和NanoGlo（nanoluciferase）底物的NanoBRET试剂盒 |
| 不含 Ca++ 和 Mg++ 的 DPBS | 优质生物材料 | 114-057-101 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.05%），酚红 | Life Technologies | 25300120 | |
| DMEM细胞培养基 | Life Technologies | 11995073 | 高葡萄糖、L-谷氨酰胺、酚红、钠 丙酮酸；不含 HEPES，补充培养基至含 10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺和 100 U 青霉素-链霉素 |
| L-谷氨酰胺（200 mM） | Life Technologies | 25030164 | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | Life Technologies | 15140163 | |
| Opti-MEM™ 我减少了血清培养基的用量 | Gibco | 31985062 | 用于细胞转染 |
| Opti-MEM 低血清培养基，无酚红 | Gibco | 11058021 | 第3天传代细胞时，补充2 mM L-谷氨酰胺和100 U青霉素-链霉素，以及10% FBS（如注明）。 |
| Invitrogen 台盼蓝染色液 | 赛默飞世尔科技 | T10282 | |
| NP40 裂解缓冲液 | N/A | N/A | 20 mM Tris（pH 8.0），137 mM NaCl，10% 甘油 NP40 替代试剂（Milipore，货号# 492016）。4 摄氏度保存。使用前立即加入以下蛋白酶和磷酸酶抑制剂：20 µM亮抑蛋白酶肽，0.5 mM 正钒酸钠，0.15 U/mL，1 mM PMSF。 |
| 5×上样缓冲液 | N/A | N/A | 240 mM Tris（pH 8.0），9.5% SDS，30% 甘油，500 mM DTT，3 mM 溴酚蓝。-20 摄氏度保存。 |
| <强>细胞系 | |||
| 293FT细胞（人源） | 赛默飞世尔科技 | R70007 | |
| <强>DNA载体 | |||
| pCMV5-Nano-CRAF 野生型及突变体 | N/A | N/A | |
| pCMV5-14-3-3ζ-Halo | N/A | N/A | |
| <强>仪器设备 | |||
| EnVision 2104 多功能酶标仪 | PerkinElmer 2104 | 2104-0010 | 600LP NanoBRET & M460/50 nm NanoBRET 发射滤光片， 发光404镜片，6.5 mm测量高度，0.1 s测量时间 |
| Invitrogen Countess™ II 自动细胞计数仪 | 赛默飞世尔科技 | AMQAX1000 | |
| ThermoFisher E1-ClipTip™ 多通道 移液器 | 赛默飞世尔科技 | 4672070 | |
| <强>软件 | |||
| GraphPad Prism（版本 10.0.3） | GraphPad | www.graphpad.com | |
| <强>其他 | |||
| ThermoFisher ClipTip 多通道移液器吸头 | 赛默飞世尔科技 | 94410153 | |
| 25 mL 分隔式无菌试剂储液槽 | Thomas Scientific | 1228K16 | |
| Perkin Elmer 384孔CulturPlate™ | PerkinElmer | 6007680 | 白色，聚苯乙烯，组织培养处理 |
| Countess 细胞计数板载玻片 | 赛默飞世尔科技 | C10228 |
参考文献
- Blasco, R. B., et al. c-Raf, but not B-Raf, is essential for development of K-Ras oncogene-driven non-small cell lung carcinoma. Cancer Cell. 19, 652-663 (2011).
- Blasco, M. T., et al. ....
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