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方法文章

基于生物发光共振能量转移（BRET）的活细胞内CRAF与14-3-3蛋白相互作用检测方法

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DOI：

10.3791/66436

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2024年3月1日

1Department of Cell and Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics, Medical University of South Carolina, 2Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina, 3Laboratory of Cell and Developmental Signaling, Center for Cancer Research, National Cancer Institute-Frederick

本文内容

摘要

本方案描述了一种基于生物发光共振能量转移（BRET）的检测方法，用于在活细胞中测量CRAF激酶与14-3-3蛋白之间的相互作用。本方案详细说明了细胞准备、BRET信号检测及数据分析的步骤。此外，还提供了一个示例结果，包括适当对照的设置以及用于优化检测条件的故障排除方法。

摘要

CRAF 是 RAS GTP 酶的主要效应因子，在多种由 KRAS 驱动的癌症发生过程中发挥关键作用。此外，CRAF 是种系突变的热点区域，这些突变已被证实可导致发育性 RAS 病——努南综合征（Noonan syndrome）。所有 RAF 激酶均含有多个依赖磷酸化的 14-3-3 调控蛋白结合位点。在信号传导条件下，14-3-3 对这些位点的差异性结合在质膜上形成有活性的 RAF 二聚体过程中起着至关重要的作用；而在静息状态下，则有助于维持 RAF 的自抑制状态。理解这些相互作用的调控机制及其可被调节的方式，对于发现靶向 RAF 功能的新型治疗策略至关重要。本文介绍了一种基于生物发光共振能量转移（BRET）的检测方法，用于在活细胞中测量 CRAF 与 14-3-3 蛋白之间的相互作用。具体而言，该检测方法通过将 CRAF 与 Nano luciferase 供体融合、14-3-3 与 Halo tag 受体融合，当 RAF 与 14-3-3 相互作用时，引发供体向受体的能量转移，从而产生 BRET 信号。本方案进一步表明，该信号可被已知阻断 14-3-3 与 RAF 高亲和力结合位点相互作用的突变所破坏。本实验流程详细描述了细胞接种、转染和重铺板的操作步骤，以及 BRET 发射信号的读取、数据分析和蛋白表达水平验证的具体操作方法。此外，还提供了示例检测结果，以及优化和故障排除的步骤。

引言

RAF 激酶（ARAF、BRAF 和 CRAF）是 RAS GTP 酶的直接效应分子，也是促增殖/促存活的 RAF-MEK-ERK 激酶级联反应的起始成员。最近的研究表明，CRAF 的表达在多种 KRAS 驱动的癌症（包括非小细胞肺癌和胰腺导管腺癌1,2,3,4,5）的肿瘤发生中起关键作用。此外，种系 CRAF 突变会导致一种特别严重的 RAS 病变综合征——努南综合征（Noonan syndrome）6,7。深入理解 CRAF 的调控机制，对于开发靶向其细胞功能的有效治疗策略至关重要。

所有RAF激酶均可分为两个功能域：C端的催化域（CAT）和N端的调控域（REG），后者控制其活性（图1A）8。REG域包含RAS结合域（RBD）、富含半胱氨酸的结构域（CRD）以及一个富含丝氨酸/苏氨酸的区域（S/T-rich）。值得注意的是，S/T-rich区域含有N'位点，该位点以磷酸化依赖的方式与14-3-3蛋白结合（CRAF中的S259位点；图1A）8。CAT域包含激酶结构域，以及第二个高亲和力的14-3-3结合位点，称为C'位点（CRAF中的S621位点；图1A）8。二聚体14-3-3蛋白对N'位点、C'位点以及CRD的差异性结合，在RAF的激活与抑制过程中均发挥关键作用9,10,11,12,13。在正常信号传导条件下，RAF的激活始于其被RAS招募至质膜，从而形成具有活性的二聚体，其中BRAF-CRAF异源二聚体是主要的活性形式14,15。针对BRAF和CRAF的生化实验，以及二聚体BRAF的冷冻电子显微镜（Cryo-EM）结构研究表明，14-3-3二聚体通过同时结合两个RAF单体的C'位点，稳定了活性RAF二聚体（图1B）9,13,16,17。相反，研究显示，在静息状态下，RAF呈现一种胞质内自抑制构象，其中REG域与CAT域结合并抑制其活性12,18,19,20。这种闭合状态由结合于REG域中CRD和N'位点以及CAT域中C'位点的14-3-3二聚体所稳定（图1B）10,13,21。在BRAF中，这一模型得到了近期解析的自抑制型BRAF单体的Cryo-EM结构以及我们先前的生化研究的支持10,12,13,21,22。然而，尽管已有研究表明14-3-3在CRAF调控中起抑制作用23，但类似BRAF的自抑制状态在CRAF调控中的作用可能较小12；因此，仍需进一步研究以阐明14-3-3蛋白调控CRAF活性的具体机制。14-3-3介导的RAF激酶调控过程涉及大量RAF的磷酸化与去磷酸化事件、多种调控蛋白的结合，以及与质膜的相互作用8。因此，至关重要的是，应在生理相关条件下，并在完整脂双层存在的环境中测量14-3-3与RAF之间的相互作用。

为解决这一问题，采用NanoBRET技术（下文简称N-BRET；试剂盒详细信息见材料表），开发了一种基于邻近效应的检测方法，用于在活细胞中测量CRAF与14-3-3蛋白之间的相互作用（图1C）。该基于BRET的系统用于检测两种目标蛋白（POI），其中一种蛋白标记有纳米荧光素酶（Nano）供体，另一种蛋白则标记有Halo标签，用于结合Halo618能量受体配体22,24。当目标蛋白发生相互作用时，供体会向受体传递能量，从而产生BRET信号（图1C）。Nano供体蛋白具有极强的发光强度（发射波长（em）460 nm），Halo618配体的发射波长为618 nm，二者具有比传统BRET更优的光谱分离度和检测灵敏度，因此该系统是研究较弱蛋白相互作用及检测结合状态细微变化的理想平台24。事实上，我们此前已开发了一种基于N-BRET的检测方法，用于测量RAF蛋白REG结构域与CAT结构域之间的自抑制性相互作用，该方法对一组BRAF CRD区域RAS病相关突变的功能表征至关重要，并证明了该结构域在维持自抑制状态、防止BRAF持续激活中的关键作用12。

本实验通过检测与N端Nano标签融合的CRAF（Nano-CRAF）与C端Halo标签融合的14-3-3蛋白ζ亚型（14-3-3ζ-Halo；图1C）之间的相互作用。我们发现，Nano-CRAF与14-3-3ζ-Halo的相互作用可产生显著的生物发光共振能量转移（BRET）信号，而该信号可被破坏14-3-3与N'位点（S259A）和/或C'位点（S621A）结合的突变所抑制。以下方案提供了该实验的详细操作、优化及故障排除步骤。

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方案

注意：本实验在293FT细胞中进行。293FT细胞是一种特性明确且易于转染的上皮细胞系，源自人胚胎肾细胞。一个10 cm培养皿中长满的此类细胞通常可提供足够接种20个6孔组织培养板孔的细胞数量。步骤1-3必须在生物安全柜中采用无菌技术操作。

1. 细胞接种（第1天）

注意：在此步骤中，将细胞从组织培养皿中分离，计数后接种于6孔组织培养板中，用于步骤2的转染（图2）。

  1. 吸弃10 cm培养皿中的培养基。用5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，然后吸弃。
  2. 加入1 mL胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA），在37 °C孵育3–5分钟，使细胞从培养皿上脱落。
  3. 向细胞中加入9 mL完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），以中和胰蛋白酶，并反复吹打混匀，制备成均一的单细胞悬液。
  4. 立即转移20 µL细胞至1.7 mL离心管中，与20 µL台盼蓝染液混合。使用自动细胞计数仪（材料表）或血细胞计数板进行细胞计数。
  5. 将细胞用完全DMEM培养基稀释至2 × 105 个细胞/mL，并向6孔组织培养板的每孔加入2 mL（每孔4 × 105 个细胞）。于37 °C、10% CO2条件下过夜培养。
    注意：建议使用传代次数少于20代的293FT细胞。我们先前发现，使用传代次数较高的细胞可能导致BRET比值降低以及孔间信号变异增加。

2. 细胞转染（第2天）

注意：此处将细胞转染 pCMV5-NanoLuc-CRAF 和 pCMV5-14-3-3ζ-Halo 表达载体，同时共转染 pCDNA3.1 空载体（图 2）。

  1. 转染前，将 N-BRET 质粒稀释至 5 ng/µL，pCDNA3.1 稀释至 100 ng/µL，并对一组无菌的 1.7 mL 离心管进行编号。
  2. 向每根离心管中加入 100 µL 转染培养基（详见材料表），以及 5 ng 的 pCMV5-NanoLuc-CRAF、10 ng 的 pCMV5-14-3-3ζ 和 200 ng 的 PCDNA3.1。
  3. 加入 2 µL 转染试剂（详见材料表），轻轻涡旋混匀。在微量离心机中短暂离心，确保所有液体聚集于管底，随后在约 25 °C 下孵育 15 分钟。
  4. 将转染复合物逐滴加入细胞中，在 37 °C、10% CO2 条件下孵育 16–20 小时，以使 Halo 和 Nano 标记的蛋白得以表达。
    注意：添加空载体（pCDNA3.1）作为载体 DNA 对于实现 N-BRET 表达构建体的高转染效率至关重要。如不添加空载体，将导致 14-3-3ζ-Halo 和 Nano-CRAF 蛋白的表达水平降低，进而引起 BRET 比值弱且不稳定，此前已有讨论22。

3. 细胞重铺（第3天）

注意：在此步骤中，将细胞转移至384孔板中，并加入Halo 618配体（+配体；材料表）或DMSO（+溶剂），用于在步骤4中读取BRET发射信号。剩余的细胞则转移至新的6孔培养板中，用于步骤5的蛋白质印迹分析（图2）。

  1. 收集以下材料，并按如下说明准备操作区域。
    1. 使用 37 °C 水浴，预热胰蛋白酶-EDTA、无血清检测培养基以及含 10% FBS 的检测培养基（详见材料表）。
    2. 根据待测样品数量，预先标记三组无菌 1.7 mL 离心管（第 1–3 组）和一组无菌 15 mL 圆底离心管。在摆动吊桶式离心机中安装 15 mL 离心管适配器，并预冷至 4 °C。
    3. 将以下物品放入细胞培养超净台内：试剂储液槽、384 孔细胞培养板、6 孔细胞培养板、多通道移液器及吸头、细胞计数载片/计数板和台盼蓝染液（材料表），以及 1.7 mL 离心管第 1–3 组。
  2. 按如下说明收获并计数细胞。
    1. 吸除 6 孔板中的培养基，向每孔加入 250 µL 胰蛋白酶-EDTA。将 6 孔板在 37 °C 培养箱中孵育，直至细胞开始脱落（3–5 分钟）。
    2. 向每孔加入 1 mL 含 10% FBS 的检测培养基以中和胰蛋白酶，并反复吹打以形成单细胞悬液。
    3. 将 1 mL 细胞悬液转移至预先标记的 15 mL 离心管中。向每个 15 mL 离心管中再加入 1 mL 含 10% FBS 的检测培养基。
    4. 轻轻颠倒混匀离心管 5 次，立即取 20 µL 细胞悬液转移至第 1 组离心管中。
    5. 在预冷的摆动吊桶式离心机中以约 250 × g 离心 5 分钟。在离心过程中，将 20 µL 台盼蓝染液与第 1 组离心管中的细胞混合，随后使用自动细胞计数仪或血细胞计数板进行细胞计数。通常细胞产量为 6–8 × 105 个细胞/mL。
    6. 从离心机中取出 15 mL 离心管，吸除细胞沉淀上的上清液。用无血清检测培养基将细胞沉淀重悬至浓度为 2 × 105 个细胞/mL，并剧烈吹打以形成单细胞悬液。
      注：使用无血清检测培养基的目的是使正常的细胞信号通路处于静息状态。
  3. 将细胞重新接种至 384 孔板和 6 孔板，操作如下。
    1. 反复颠倒 15 mL 离心管数次，确保细胞悬液均匀，取 500 µL 分别转移至 1.7 mL 离心管第 2 组和第 3 组。
    2. 向第 2 组加入 0.5 µL DMSO（+对照溶剂），向第 3 组加入 0.5 µL Halo 618 配体（+配体），并吹打混匀。
    3. 将含对照溶剂和含配体的细胞悬液分别转移至试剂储液槽的不同孔中。使用多通道移液器（材料表），从储液槽中取 40 µL 含对照溶剂的细胞悬液，加入 384 孔培养板的四个重复孔中。对含配体的细胞悬液重复此步骤。
    4. 将剩余细胞转移至新的 6 孔培养板中。将 384 孔板和 6 孔板在 37 °C、5% CO2 条件下孵育过夜。

4. 检测BRET发射信号（第4天）

注意：在此步骤中，将纳米荧光素酶底物（详见材料表）加入384孔培养板中的细胞，随后检测N-BRET受体（618 nm）和供体（460 nm）的发射信号（图2），然后计算校正后的BRET比值。

  1. 将无血清检测培养基在 37 °C 水浴中预热，并在 25°C 下解冻纳米荧光素酶底物。用无血清检测培养基以 1:100 的比例稀释纳米荧光素酶底物，转移至试剂储液槽中。配制足够体积的该混合液，以便向 384 孔板的每个孔中加入 10 µL，并额外多准备 10%–15% 的体积。
  2. 使用多通道移液器（材料表），向 384 孔细胞培养板中含细胞的每个孔加入 10 µL 底物混合液。轻轻旋转培养板 1 分钟，可手动操作或使用轨道摇床。
  3. 将 384 孔板插入多功能酶标仪，记录所有含细胞孔在 460 nm 和 618 nm 处的发射光信号。
    注意：本步骤所用的多功能酶标仪（详见 材料表）采用 6.5 mm 的读板高度和 0.1 s 的读数时间，但若使用其他型号的酶标仪，可能需要进一步优化参数。
  4. 使用以下公式分别计算加载体（+vehicle）和加配体（+ligand）组的原始 BRET 比值，单位为毫BRET单位（mBU）：
    用于生化分析的荧光发射比值公式，616nm/460nm 结果计算。
  5. 通过从加配体组的 BRET 比值中减去加载体组的 BRET 比值，计算校正后的 BRET 比值（补充表 1）。
    注意：在比较多个实验结果时，可将校正后的 BRET 比值合并，并归一化至野生型（WT）N-BRET 配对（Nano-CRAFWT 与 14-3-3ζWT-Halo）的平均值（补充表 1）。

5. 蛋白质表达水平的验证（第4天和第5天）

注意：在此步骤中，使用针对Halo标签和Nano标签的特异性抗体，通过蛋白质印迹分析检测6孔板中细胞裂解后Nano-CRAF和14-3-3ζ-Halo蛋白的表达水平。（图2）。

  1. 向 NP40 裂解缓冲液（材料表）中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，每份样品准备 200 µL 裂解缓冲液。
  2. 吸除含细胞的 6 孔板中的培养基，每孔加入 1 mL 冷 PBS 洗涤一次，然后吸除 PBS。
  3. 向每个孔中加入 125 µL NP40 裂解缓冲液，将 6 孔板置于 4 °C 摇床上孵育 15 分钟，以裂解细胞。
  4. 将裂解物转移至冰上的 1.7 mL 离心管中，在 4 °C 条件下以 20,000 × g 离心 10 分钟。将上清裂解物放回冰上，并使用市售试剂盒（如 Bradford 或二辛可宁酸（BCA）法）测定蛋白浓度。
  5. 通过向新的 1.7 mL 离心管中转移适量体积的裂解物和 NP40 裂解缓冲液，将所有样品的蛋白浓度归一化，总体积为 100 µL。
  6. 将 5× 蛋白上样缓冲液（材料表）煮沸 1 分钟，每份样品中加入 25 µL，然后将样品在沸水中加热 5–6 分钟，短暂离心以确保样品全部沉降至管底。
  7. 将 25 µL 样品分别上样至两块重复的蛋白凝胶（凝胶 1 和凝胶 2）的每个孔中，随后按照先前描述的标准 Western 印迹程序22，将蛋白转移至硝酸纤维素膜或 PVDF 膜上。
  8. 将膜在 25 °C 条件下用含 3% BSA 的 PBS 封闭 30 分钟，然后在含 0.2% Tween-20 的 Tris 缓冲盐水（TBST；材料表）中，分别与 Halo 抗体（1:1,000 稀释；凝胶 1）以及 NanoLuc 荧光素酶或 CRAF 抗体（1:500 稀释；凝胶 2）在 4 °C 过夜孵育。
  9. 用 10 mL TBST 在室温下洗涤膜 1 次，每次 5 分钟，然后在室温下用 1:10,000 稀释于 TBST 中的抗小鼠 HRP 二抗孵育 1 小时。
  10. 在 25 °C 条件下，于 10 mL TBST 中于摇床上洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。吸除 TBST，使用 ECL 试剂并结合 X 射线胶片显影仪或其他合适的成像系统检测蛋白条带。

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结果

按照本方案所述操作（图2），Nano-CRAFWT 与 14-3-3ζ-Halo 的相互作用应产生 50–60 mBU 的校正后 BRET 比值（图3A；补充表1）。CRAF 含有两个依赖磷酸化的 14-3-3 结合位点，即 N' 位点和 C' 位点（图1）8。因此，用于减少 CRAF:14-3-3ζ 结合的适当对照包括 S259A 和 S621A 突变，它们分别阻止 N' 和 C' 位点的磷酸化，从而阻止 14-3-3 的结合25。如 图3A 所示，Nano-CRAFS259A 使 BRET 信号降低约 45%，Nano-CRAFS621A 降低约 25%，而 S259A/S621A（SS/AA）双突变体几...

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讨论

既往研究表明，14-3-3 蛋白在 RAF 激酶的激活和抑制过程中均发挥关键作用。深入了解这些结合事件的调控机制，以及调控这些相互作用对 RAF 信号传导和 RAF 驱动的肿瘤发生的影响，可能揭示靶向 CRAF 功能的新治疗弱点。然而，Raf 激活循环受到多种相关蛋白、翻译后修饰以及亚细胞定位变化的支持8，因此为了完全重现这些条件，必须在活细胞环境中检测 RAF 与其调控因子之间的相互作用。本方案描述了一种基于邻近关系的新方法，该方法利用纳米荧光素酶-Halo N-BRET 配对系统优异的信噪比和光谱分辨率，用于在活细胞中检测 14-3-3ζ 与 CRAF 的相互作用。

尽管该检测方法为在生理相关条件下研究14-3-3与CRAF之间复杂的相互作用提供了亟需的平台，但仍存在若干局限性需加以考虑。首先，鉴于已有研究表明14-3-3在RAF自抑制和二聚化过程中均发挥作用8，可结合其他对照和实验方法来区分这些状态。例如，本实验可与先前开发的N-BRET自抑制检测法联合使用，后者可直接反映RAF自...

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披露

无任何利益冲突需要披露。

致谢

本项目部分资金来自美国国家癌症研究所、美国国立卫生研究院的联邦基金，项目编号为 ZIA BC 010329。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>抗体 
HaloTag® 小鼠单克隆抗体PromegaG9211 用于检测HaloTag标签的抗体  通过免疫印迹检测蛋白质
NanoLuc® 小鼠单克隆抗体R&D SystemsMAB10026用于免疫印迹检测Nano标签蛋白的抗体
CRAF小鼠单克隆抗体（E10） Santa Cruz Biotechnologysc-7267直接通过免疫印迹检测CRAF蛋白的抗体
ECL 抗小鼠 HRP 二抗AmershamNA931-1ML 辣根过氧化物酶标记的鼠二抗（来源于羊）
<强>试剂
X-tremeGENE™ 9罗氏/西格玛6365809001
NanoBRET™ 试剂盒 PromegaN1661 含Halo 618配体和NanoGlo（nanoluciferase）底物的NanoBRET试剂盒 
不含 Ca++ 和 Mg++ 的 DPBS 优质生物材料 114-057-101
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），酚红 Life Technologies25300120
DMEM细胞培养基Life Technologies11995073高葡萄糖、L-谷氨酰胺、酚红、钠  丙酮酸；不含 HEPES，补充培养基至含 10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺和 100 U 青霉素-链霉素
L-谷氨酰胺（200 mM）  Life Technologies25030164
青霉素-链霉素（10,000 U/mL） Life Technologies  15140163
Opti-MEM™ 我减少了血清培养基的用量 Gibco31985062用于细胞转染 
Opti-MEM 低血清培养基，无酚红Gibco11058021第3天传代细胞时，补充2 mM L-谷氨酰胺和100 U青霉素-链霉素，以及10% FBS（如注明）。 
Invitrogen 台盼蓝染色液 赛默飞世尔科技 T10282 
NP40 裂解缓冲液 N/AN/A20 mM Tris（pH 8.0），137 mM NaCl，10% 甘油  NP40 替代试剂（Milipore，货号# 492016）。4 摄氏度保存。使用前立即加入以下蛋白酶和磷酸酶抑制剂：20 µM亮抑蛋白酶肽，0.5 mM 正钒酸钠，0.15 U/mL，1 mM PMSF。
5×上样缓冲液N/AN/A240 mM Tris（pH 8.0），9.5% SDS，30% 甘油，500 mM DTT，3 mM 溴酚蓝。-20 摄氏度保存。 
<强>细胞系 
293FT细胞（人源）赛默飞世尔科技 R70007 
<强>DNA载体 
pCMV5-Nano-CRAF 野生型及突变体 N/AN/A
pCMV5-14-3-3ζ-Halo  N/AN/A
<强>仪器设备
EnVision 2104 多功能酶标仪PerkinElmer 21042104-0010 600LP NanoBRET & M460/50 nm NanoBRET 发射滤光片，  发光404镜片，6.5 mm测量高度，0.1 s测量时间
Invitrogen Countess™ II 自动细胞计数仪 赛默飞世尔科技AMQAX1000 
ThermoFisher E1-ClipTip™  多通道  移液器 赛默飞世尔科技  4672070
<强>软件
GraphPad Prism（版本 10.0.3） GraphPad www.graphpad.com
<强>其他 
ThermoFisher ClipTip 多通道移液器吸头 赛默飞世尔科技 94410153
25 mL 分隔式无菌试剂储液槽 Thomas Scientific1228K16
Perkin Elmer 384孔CulturPlate™PerkinElmer6007680白色，聚苯乙烯，组织培养处理 
Countess 细胞计数板载玻片赛默飞世尔科技 C10228

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