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一种由高脂血症诱导的射血分数保留型心力衰竭的小鼠模型

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DOI：

10.3791/66442

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2024年3月29日

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1Department of Medicine, Division of Cardiology, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 2Interdisciplinary Stem Cell Institute, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 3Department of Molecular and Cellular Pharmacology, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 4Department of Medical Education, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine

本文内容

摘要

本方案介绍了一种复制由高脂血症诱导的射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）小鼠模型的详细方法。该设计结合使用腺相关病毒9-心肌肌钙蛋白T-低密度脂蛋白受体（AAV9-cTnT-LDLR）和泊洛沙姆-407（P-407）。

摘要

由脂毒性驱动的射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）的病理生理机制尚未完全阐明。鉴于目前迫切需要能够准确模拟心肌代谢性HFpEF的动物模型，本研究通过逆向工程重构HFpEF患者中观察到的表型，建立了一种由高脂血症诱导的小鼠模型，旨在深入探究HFpEF中脂毒性与代谢综合征之间的相互作用。在129J品系背景的野生型（WT）小鼠中，通过每两周一次腹腔注射阻断脂蛋白脂酶的嵌段共聚物普流罗尼克-407（P-407），并联合单次静脉注射腺相关病毒9型-心肌肌钙蛋白T-低密度脂蛋白受体（AAV9-cTnT-LDLR），诱导高脂血症。在处理后第4至8周进行了全面评估，包括超声心动图、血压记录、全身体积描记法、心电图（ECG）遥测、活动轮监测（AWM）以及生化和组织学分析。LDLR/P-407小鼠在第4周即表现出典型特征，包括舒张功能障碍、射血分数保留以及左心室壁厚度增加。值得注意的是，其血压和肾功能仍保持在正常范围内。此外，心电图和活动轮监测分别显示存在心脏传导阻滞和活动量减少。至第8周时，舒张功能进一步恶化，并伴随呼吸频率显著下降。对双重处理模型的进一步研究发现，纤维化程度、肺湿/干重比以及心脏重量/体重比均显著升高。LDLR/P-407小鼠还出现睑黄瘤、腹水和心肌缺血。有趣的是，在处理后第6至12周期间发生了猝死现象。该小鼠HFpEF模型为阐明在脂毒性介导的HFpEF背景下，代谢综合征导致舒张功能障碍的复杂机制提供了宝贵且具有前景的实验资源。

引言

射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）是一种伴随多种合并症的心血管代谢综合征，占所有心力衰竭病例的50%以上1,2。此外，过去十年中HFpEF的发病率持续上升3。由于治疗选择有限，且其病理生理机制复杂多样，HFpEF已成为心血管疾病领域最突出的未满足医疗需求4。因此，迫切需要加深对HFpEF潜在机制和病理生理过程的理解，以开发有效的治疗方法。

尽管近年来取得了显著进展，但由脂毒性引起的射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）的病理生理机制仍未完全阐明。已有研究证实，与射血分数降低型心力衰竭（HFrEF）患者及健康对照者相比，HFpEF患者表现出明显的心肌脂质积聚5。来自心脏活检的RNA测序数据显示，与健康个体和HFrEF患者相比，HFpEF组中脂蛋白脂酶（LPL）基因表达下调6。泊洛沙姆-407（P-407）是一种嵌段共聚物，可通过抑制LPL活性诱导高脂血症，进而升高血浆甘油三酯和低密度脂蛋白（LDL）胆固醇水平7。既往研究表明，HFpEF小鼠心脏中低密度脂蛋白受体（LDLR）表达显著升高8。

在上述研究结果的基础上，鉴于迫切需要能够准确模拟心-代谢性射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）的动物模型，本研究建立并介绍了一种由高脂血症诱导的小鼠模型。该模型专门用于探索HFpEF，尤其聚焦于脂毒性与代谢综合征的共同作用。该模型通过诱导高脂血症/脂蛋白脂酶（LPL）阻断并增强心肌低密度脂蛋白受体（LDLR）的表达，在129J背景的野生型（WT-129）小鼠中建立，具体方法为每两周一次腹腔（i.p.）注射P-407，并联合单次静脉（i.v.）注射腺相关病毒9-心肌肌钙蛋白T-低密度脂蛋白受体（AAV9-cTnT-LDLR）9。

治疗后4至8周，进行了一系列广泛的评估，包括超声心动图、血压记录、全身体积描记法（WBP）、连续心电图（ECG）遥测、活动轮监测（AWM）以及生化和组织学分析9。在4周时，LDLR/P407或“双重处理”小鼠表现出明显的射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）特征，包括舒张功能障碍、射血分数保留以及左心室壁厚度增加9。此外，心电图遥测和活动轮监测分别显示存在心脏传导阻滞和活动量减少。值得注意的是，血压和肾功能仍保持正常9。至8周时，舒张功能进一步恶化，体积描记法测量结果显示呼吸频率降低9。

进一步探索双重处理模型发现，小鼠出现纤维化、肺湿/干重比升高以及心重/体重比升高9。尸检显示存在腹水、心肌缺血和黄斑瘤。值得注意的是，在治疗后6至12周内记录到突发性死亡事件9。这种由小鼠高脂血症驱动的射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）模型，为揭示代谢综合征在脂毒性介导的舒张功能障碍及HFpEF中的复杂作用机制，提供了一种快速、有价值且前景广阔的实验工具。

方案

动物实验方案经迈阿密大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，符合美国国立卫生研究院（NIH）指南（IACUC方案编号：23-103-ad03）。本研究中使用的129J背景的野生型（WT）小鼠购自商业来源（见材料表），并在本机构内自行繁育。所有小鼠均为129J背景的同窝仔鼠。实验包括雄性和雌性小鼠。LDLR/P-407 HFpEF小鼠模型通过在第一周单次注射AAV9-cTnT-LDLR，随后每两周一次给予P407，持续四周建立。

1. AAV9-cTnT-LDLR 的制备与给药

注意：AAV9-cTNT-hLDLR 质粒（见材料表）编码全长的人类 LDLR 蛋白（2664 bp）（图1）。

  1. AAV-LDLR 病毒载体的制备
    1. 根据动物数量，将 AAV9 原液在冰上解冻 20 分钟，然后用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）稀释，使每只小鼠的病毒颗粒浓度达到 1 × 1012 拷贝，在 100 µL 体积中。
    2. 将病毒溶液吸入装有 28–30 G 针头的 1 mL 注射器中。注意避免将气泡吸入针头。
  2. 静脉（i.v.）尾静脉注射操作
    1. 打开氧气，流量调至 0.5 L/min，并将异氟烷麻醉系统设置为 4%–5%。将小鼠放入诱导室约 2 分钟，直至小鼠无反应。
    2. 将小鼠置于尾部照明固定装置（例如 Braintree Scientific, Inc.（Braintree, MA））上，并使其侧卧。使用 2%–3% 的异氟烷维持麻醉。
      注意：固定装置产生的热量会使小鼠尾静脉扩张，从而显著便于注射。
    3. 确定侧尾静脉位置，使用纱布垫蘸取消毒剂清洁注射区域。
    4. 握住尾部末端将其拉直，并用手指按摩小鼠尾部，直至静脉清晰可见。以低角度（10–15 度角）插入针头，并向尾静脉注射 100 µL 稀释后的 AAV 溶液（图 2A）。
    5. 拔出针头后立即用手指按压止血，直至出血停止。将小鼠放回原笼具中。

2. P-407 的制备与给药

  1. P-407 溶液的制备
    1. 在通风橱内，将 P-407 试剂（参见材料表）用 DPBS 稀释至终浓度为 100 mg/mL。将溶液置于 4 °C 冰箱中，在旋转器上过夜冷藏，以促进 P-407 的溶解10。
  2. 每两周一次腹腔内（i.p.）注射操作步骤
    1. 在开始腹腔注射的第一天称量每只小鼠的体重。根据 1 g/kg 的剂量公式，按体重计算每只小鼠的合适剂量，并预先填充注射器。
    2. 在通风橱内，用手固定小鼠，使其头部和身体向下倾斜，从而使内脏器官向头侧移位。该技术可避免刺破邻近的重要结构。
    3. 在腹部下象限、腹中线外侧定位左侧腹膜腔区域。用消毒剂清洁注射部位。
    4. 以 45 度角或更小角度将针头插入腹膜腔（图 2B）。回抽注射器活塞，确认针头已正确进入。
    5. 若回抽时发现血液或组织，应立即拔出针头，并重复步骤 2.2.2 至 2.2.4，直至回抽无异物。将使用过的针头丢弃至专用锐器盒中，并将小鼠放回原笼具。

3. 超声心动图评估

  1. 准备工作
    1. 在成像前一日或数小时前，将脱毛膏涂抹于小鼠胸部和上腹部。2分钟后用湿纱布擦除脱毛膏。
    2. 以0.8 L/min的流速使用2.5%-3.0%异氟烷对小鼠进行麻醉，并以1%-1.5%异氟烷维持麻醉。随后将小鼠仰卧位固定于适当平台，四肢置于含导电凝胶的电极垫上，并用鼻罩覆盖口鼻，以确保持续给予异氟烷维持麻醉。
  2. 胸骨旁长轴切面
    1. 将小鼠保持仰卧位，将平台右侧倾斜45度。
    2. 接着，在导轨系统中对换能器探头进行斜向对齐，从右上肢至左腹部方向顺时针倾斜30-40度，获取并储存B型图像。
    3. 使用超声分析软件（见材料表）分析B型图像，以获得射血分数（图3A）。
  3. 胸骨旁短轴切面
    1. 在导轨系统中将换能器探头顺时针旋转90度，获取并储存B型和M型图像。
  4. 心尖切面
    1. 将平台左上角向下并向右侧倾斜。将换能器朝向动物的右肩方向定位。
    2. 在B型和彩色多普勒模式下观察二尖瓣。采集并储存脉冲波（PW）多普勒和组织多普勒图像5。
    3. 使用超声分析软件分析PW多普勒和组织多普勒图像，以获得IVRT、E/E'和E/A（图3B-E）。

4. 压力-容积（PV）环数据记录

  1. 在研究结束时进行血流动力学分析，以评估左心室（LV）的收缩和舒张功能，操作步骤参照先前描述的方法11,12。
    1. 使用异氟烷（3–5%，诱导舱）对小鼠进行麻醉诱导。
    2. 当麻醉作用开始后，将动物转移至手术台，并通过面罩维持异氟烷麻醉（1–3%）。
    3. 在颈部皮肤做一小切口，以便经口进行气管插管。
    4. 使用啮齿类动物呼吸机（例如 Micro vent model 848，Harvard Apparatus），以氧气与异氟烷混合气体对动物进行通气，设置潮气量约为 0.15–0.2 mL，呼吸频率为 120–170 次/分钟。
    5. 在整个操作过程中，使用温控手术台将动物体温维持在约 37 °C ± 1 °C。
    6. 暴露左侧颈内静脉，并用 30 G 针头进行插管，用于液体支持给药。
    7. 切开腹侧颈部中线处皮肤，暴露颈动脉。阻断右侧颈动脉远端后，在动脉上做一小切口，以便将微尖端压力-容积（PV）导管（见材料表）插入左心室（闭胸法）。
    8. 在稳态及下腔静脉阻断期间记录 PV 环。
    9. 实验结束后，在深度麻醉状态下，采用经批准的 AVMA 方法对动物实施人道安乐死（例如，先使用异氟烷，随后行颈椎脱位）。
    10. 使用 LabChart 软件（见材料表）分析 PV 数据，并利用超声心动图测量值对容积进行校准。

结果

经4周联合单次静脉注射AAV9-cTnT-LDLR及每两周一次腹腔注射P-407后，超声心动图显示出现射血分数保留型心力衰竭（HFpEF），表现为射血分数保留、心室间舒张时间（IVRT）延长、E/E'比值升高以及E/A比值降低（图3A-E）。与治疗4周后相比，治疗8周后观察到更严重的心室舒张功能障碍。治疗8周后通过压力-容积（PV）环分析显示，舒张末期压力-容积关系斜率升高，进一步证实了超声心动图所提示的舒张功能障碍（图3F）。值得注意的是，在LDLR/P-407治疗后6至12周期间，接受LDLR/P-407处理的小鼠中出现显著比例的猝死事件（图3G）。这些结果表明该模型成功建立了心肌代谢性射血分数保留型心力衰竭，验证了本实验方案与设计的有效性。在LDLR/P-407处理后4周和8周，小鼠均表现出高脂血症，特征为总胆固醇、甘油三酯、极低密度脂蛋白（VLDL）、低密度脂蛋白（LDL）胆固醇水平升高，而高密度脂蛋白胆固醇水平正常，进一步支持了我们关于高脂血症的发现（图3H）。

质粒图谱示意图；复制起点、AmpR基因、酶切位点、DNA克隆策略。
图1：AAV9-cTnT-LDLR质粒图谱。 请点击此处查看此图的放大版本。

大鼠注射操作；使用注射器进行药物给药研究的实验装置。
图2：注射操作流程。（A）在129J品系背景的野生型小鼠中进行AAV9-cTnT-LDLR尾静脉（i.v.）注射的代表性图像。（B）在先前已接受单次AAV9-cTnT-LDLR静脉注射的129J品系背景野生型小鼠中，进行P-407腹腔注射的示意图。请点击此处查看此图的放大版本。

LDLR/P407 研究中的心脏功能与血脂谱分析；超声心动图与生存曲线图
图3心血管代谢性射血分数保留的心力衰竭 (A-E) 经4周（n = 17）和8周（n = 11）LDLR/P-407处理后，与未处理小鼠（n = 15）相比，显示射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）的超声心动图参数。表现为射血分数保留、等容舒张时间（IVRT）延长、E/E'比值升高及E/A比值降低，均为舒张功能障碍的指标。F压力-容积环的采集与分析显示，经过8周治疗后，舒张末期压力-容积关系（EDPVR）斜率升高。G) LDLR/P-407 治疗后 6 至 12 周内发生猝死。 (H血脂检测结果支持LDLR/P407处理4周（n = 4）和8周（n = 3）小鼠存在高脂血症，表现为总胆固醇、甘油三酯、极低密度脂蛋白（VLDL）、低密度脂蛋白（LDL）胆固醇水平升高，而高密度脂蛋白胆固醇水平正常，与未处理小鼠（n = 5）相比差异明显。数据以均值 ± 标准差表示。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

尽管过去十年中射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）的患病率持续上升，但对其潜在病理生理机制的明确认识仍然不足13。此外，截至目前，基于证据的治疗手段仍然有限13。因此，有必要更深入地理解心血管代谢性HFpEF所涉及的机制。此前已建立一种高脂血症小鼠模型，该模型通过心脏特异性LDLR过表达（OE）联合p407注射诱导，可模拟出不依赖慢性肾病（CKD）或高血压的HFpEF表型9。

研究结果表明，心脏LDLR过表达与高脂血症联合作用可在小鼠中于四周内导致舒张功能障碍、心律失常、左心室（LV）肥厚、运动耐受性下降、心肌脂质积聚及纤维化，此结果此前已有报道9。此外，这些小鼠的心脏、肝脏和骨骼肌中低密度脂蛋白胆固醇（LDL-cholesterol）摄取增加，同时心脏和肝脏中的甘油三酯水平降低9。该方法的优势在于其能够快速研究心脏代谢综合征的相关通路，相较于其他高脂血症性射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）小鼠模型（如需16至20周才能建立的高脂饮食（HFD）模型）具有更短的建模周期14。本模型仅需四周即可建立，并能模拟人类的代谢异常，因此该模型的可重复性至关重要。

必须确保充分制备并正确使用 AAV9-cTnT-LDLR 和 P-407。该模型的可重复性高度依赖于 P-407 与 AAV9-cTnT-LDLR 浓度及剂量的准确计算，以及体重测量的精确性。溶液配制、静脉注射和腹腔注射操作技术的规范性同样至关重要。上述任一操作的偏差均可能导致显著的实验变异或非预期结果。

尽管该模型具有良好的有效性和高效性，但仍存在一些局限性。进行静脉注射和腹腔注射需要经过严格的培训。此外，静脉注射以及频繁的腹腔注射可能带来发病和死亡的风险。在实施静脉注射时可能导致小鼠尾部损伤，而腹腔注射则可能造成盲肠穿刺，进而引发腹膜炎15。这些损伤通常源于操作技术不当，可能导致实验对象丢失以及治疗中断。因此，在实施这些操作前必须进行充分的培训。另一个局限性在于本模型聚焦于129J品系小鼠。选择129J品系的依据来自初步研究结果，与我们最初在未发表研究中使用的C57BL/6小鼠相比，该品系表现出更快的舒张功能障碍及HFpEF特征。

尽管存在这些局限性，该模型仍将有助于更快速地研究射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）的潜在机制及可能有效的治疗方案。以往的研究已建立了一种由高脂饮食（HFD）和N[w]-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）在5至15周内诱导的心源性代谢型HFpEF的病理生理模型13。然而，由于HFpEF患病率持续上升，迫切需要进一步深入了解心源性代谢型HFpEF的病理生理机制，并开发有效的治疗方法。这种通过小鼠心脏LDLR过表达联合p407诱导高脂血症的模型，是一种快速且可行的诱导心源性代谢型HFpEF的方法，可用于未来的研究工作。

披露

JH 被列为生长激素释放激素（GHRH）类似物相关专利的共同发明人，这些专利已转让给迈阿密大学和美国退伍军人事务部。JH 此前曾持有本研究中所使用知识产权的被许可方 Biscayne Pharmaceuticals 的股权。Biscayne Pharmaceuticals 未为本研究提供资金支持。JH 报告拥有一项心脏细胞治疗技术的专利。他持有 Vestion Inc. 的股权，并以顾问及董事会和科学顾问委员会成员身份与 Vestion Inc. 保持专业关系。JH 担任 Longeveron 公司的首席科学官、有偿顾问及顾问委员会成员，并持有 Longeveron 的股权。JH 还是授权给 Longeveron 的知识产权的共同发明人。Longeveron LLC 和 Vestion Inc. 均未参与资助本项工作。JH 的上述关系已向迈阿密大学披露，并已制定相应的管理方案。

致谢

我们感谢Penncore和NHLBI基因治疗资源项目（GTRP）为生成工作提供资助 本项目中使用的腺相关病毒。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）（1R01HL140468）和迈阿密心脏研究所资助，资助对象为LS。MW于2020至2022年获得NIH多样性补充资助奖（R01HL140468-03S1）。JH获得以下资助：1R01 HL13735、1R01 HL107110、5UM1 HL113460、1R01 HL134558、5R01 CA136387（来自NIH）、W81XWH-19-PRMRPCTA（来自美国国防部）以及Starr、Lipson和Soffer家族基金会。

材料

本文使用的材料清单
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腺相关病毒9-心肌肌钙蛋白T-低密度脂蛋白受体（AAV9-cTnT-LDLR）宾夕法尼亚大学病毒载体核心实验室，由美国国家心肺血液研究所基因治疗项目（GTRP）资助转基因质粒和腺相关病毒（AAV）颗粒由美国宾夕法尼亚大学载体中心（U. Penn Vector Core）制备，该中心由美国国家心肺血液研究所基因治疗项目（NHLBI Gene Therapy Program, GTRP）资助。AAV以杜尔贝科改良培养基（Dulbecco）提供’含0.001% Pluronic F68的磷酸盐缓冲液（PBS）。核心实验室通过数字滴定聚合酶链式反应（ddPCR）测定AAV滴度，并通过SDS-PAGE检测所有制备样品的衣壳蛋白比例，同时检测内毒素的存在。载体包含由3X HA标签标记的人源（h）转录本，宾夕法尼亚大学载体核心（RRID: SCR_022432）。AAV9-cTNT-hLDLR质粒编码全长人源LDLR蛋白（2664 bp）。
配备高频换能器探头 MS400 的成像系统 （VisualSonics，加拿大安大略省多伦多市）Vevo 2100 或 3100
异氟烷Akorn动物健康公司NDC：59399-106-01
LabChart  软件ADInstruments专业版 8.1.5
泊洛沙姆 407Sigma-Aldrich16758
PV导管米勒仪器PVR 1035
超声分析软件 Vevo Lab
129J 背景的野生型（WT）小鼠 杰克逊实验室 

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