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用于研究生物工程材料的咀嚼肌体积性肌肉缺损啮齿动物模型

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DOI：

10.3791/66450

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2024年5月31日

 ,  , 
1Division of Plastic and Reconstructive Surgery, University of California San Francisco (UCSF)

本文内容

摘要

本文介绍了一种在大鼠咬肌中手术建立容积性肌肉缺损（VML）损伤的实验方案，为研究颅面肌损伤及其利用生物材料（如新型水凝胶）进行治疗提供了可重复且易于操作的模型。

摘要

颅面部容积性肌肉丧失（VML）损伤可由严重创伤、手术切除、炎症以及先天性或其他获得性疾病引起。颅面部 VML 的治疗通常涉及外科功能性肌肉移植。然而，这些手术方法无法恢复正常的肌肉功能、感觉或面部表情，且此类损伤更常被忽视而未予治疗。目前针对颅面部 VML 动物模型中骨骼肌再生的研究极为有限。本文描述了一种用于研究颅面部 VML 损伤的大鼠模型，以及一套用于评估治疗此类损伤的生物材料组织学反应的实验方案。在手术造成 VML 损伤的同时植入液态水凝胶或冻干支架材料，在长达 12 周的终末时间点处死动物并切除咬肌，该方法具有较高的组织保留率且并发症极少。采用苏木精-伊红（HE）、马松三色染色及免疫组织化学分析，评估骨骼肌再生情况以及材料的生物相容性和免疫调节作用。尽管本文以透明质酸基水凝胶为例进行研究，但该模型可用于后续多种材料在 VML 损伤修复中的评估。

引言

严重创伤、手术切除、炎症及其他后天性状况可能导致组织缺损程度超出骨骼肌内源性修复机制的代偿能力。负责主导再生过程的常驻细胞及结构的缺失，可引发病理性重塑和组织纤维化，造成持久性的功能与感觉障碍，此类情况被称为体积性肌肉缺损（VML）。1,2,3VML损伤的炎症反应涉及一个已有充分记录且复杂的机制，其中包括巨噬细胞、细胞因子和成肌细胞，为再生医学提供了诸多理论上的干预靶点4. 尽管许多 体外 已有研究在肢体创伤性肌肉缺损（VML）的动物模型中应用了这些靶点，但在颅面部创伤性肌肉缺损动物模型中，针对骨骼肌再生的研究仍缺乏。5,6,7.

颅面部组织缺损可能由前述情况引起，也可能出现在先天性状况中，例如唇腭裂，某些情况下伴有肌肉组织真正的容积性缺失。8,9由于颅面区域的肌肉在功能和美学外观方面均具有重要作用，因此肌肉体积缺失（VML）的长期影响可能带来显著的心理困扰。颅面骨骼肌在多个方面与源自体节的四肢骨骼肌存在差异，包括基因表达、胚胎起源、卫星细胞表型、卫星细胞数量、肌纤维组成以及肌肉结构。10,11,12,13这些差异可能导致血管肌肉病变（VML）对颅面肌的影响不同于体节来源的肌肉14,15迄今为止，在肢体VML动物模型中显示出促进再生效果的组织工程方法，尚未在颅面部VML动物模型中取得同等程度的转化效果。16这凸显了优化的必要性 体内 动物颅面VML模型的构建方法

尽管已开展多项关于颅面部位体积性肌肉缺损（VML）的体内研究，但这些研究规模较小，且在动物模型中建立稳定可靠的颅面肌肉缺损具有挑战性8,13。Kim 等人报道了一种小鼠咬肌 VML 模型的建立，但该研究仅在损伤后 28 天内评估了组织学变化，且在检测不同时间点间组织学结果差异方面的统计效能不明确17。Rodriguez 等人报道了一种绵羊颅面 VML 模型的建立，但他们指出实验组内变异度较高，提示初始手术损伤的严重程度存在异质性16。本文中，我们报道了我们所建立的大鼠咬肌 VML 模型的实验方案，并展示了其在评估组织工程策略中的应用价值。

方案

本研究严格遵循所有适用法规，包括遵守《实验动物护理和使用指南》中所述的建议。所有动物实验操作及术后护理均经加州大学旧金山分校（UCSF）机构动物护理和使用委员会批准（IACUC方案编号：AN195944-01）。

1. VML 手术

  1. 使用异氟烷全身麻醉（流速为1%-5%）在密闭容器中麻醉12周龄、体重为276-300 g的雄性Sprague-Dawley大鼠 ，然后将其转移至无菌手术区域。
    1. 将啮齿动物置于左侧卧位，使颈部保持中立伸展状态，鼻部接入麻醉面罩，以便暴露面部右侧。
    2. 将异氟烷流速从诱导剂量逐渐降低至维持剂量（约2%）。
  2. 在啮齿动物的眼睛上涂抹眼科软膏。
  3. 使用脱毛膏清除手术区域的毛发，该区域以上下界分别为右口角至右耳根部的连线、右耳根部上方及下颌角下方所围成。
    1. 使用乙醇和聚维酮碘溶液以环形方式多次消毒手术区域。
      注：由于手术入路的大小和位置限制，本方案中不使用无菌巾单。操作应按照动物护理指南采用无菌技术进行。
  4. 从右侧下颌胡须垫至右耳做一条长3-4 cm的纵向切口。
    1. 抬起皮瓣，以暴露右侧咬肌以及面神经的颊支和下颌支（图1A）。
    2. 使用钝性分离法将皮肤与下方筋膜分离，并用手术钳固定皮肤边缘，使其处于牵拉状态，以便清晰观察下方肌肉组织。
  5. 在覆盖咬肌前部的筋膜上做一条长1-2 cm的横向切口。使用钝性分离法小心扩大筋膜与咬肌之间的间隙，同时保持剩余筋膜的整体完整性。
  6. 以筋膜切口作为通向浅层咬肌的窗口，使用灭菌的一次性穿孔活检器在肌肉上制造一个直径5 mm、深度5 mm的圆形损伤。确保缺损位于面神经颊支与下颌支之间中心位置，并注意避免对神经造成损伤（图1B）。
  7. 将生物材料植入圆形咬肌损伤区域（图1C）。
  8. 待材料就位后，使用单针5-0单股缝线缝合包裹肌肉的筋膜窗口，以防止材料移位。
    注：固态制剂可直接置入伤口，可轻柔扰动组织以促进血液浸润饱和；液态制剂则根据需要允许其原位凝胶化，或立即用筋膜覆盖固定以防止移位。本实验中使用的是一种丙烯化透明质酸基冷冻凝胶。
  9. 使用5-0单股缝线采用单纯间断或连续皮下缝合技术关闭皮肤切口。
    1. 在缝线上涂抹皮肤粘合剂，以帮助预防术后切口裂开。
  10. 将大鼠置于配备外部热源（笼下加热垫或笼内无菌暖手袋）的笼中恢复，并在术后观察30分钟。
  11. 将复方新诺明抗生素（每5 mL含200 mg甲氧苄啶和40 mg磺胺甲噁唑）按5 mL/200 mL水的比例稀释于饮用水中，在术后7天内供大鼠自由饮用。确保按照机构规程实施围手术期镇痛。
    注：本研究中，术前皮下注射0.25%布比卡因，麻醉苏醒前皮下注射0.05 mg/kg布托啡诺，麻醉苏醒前及次日清晨腹腔注射2 mg/kg美洛昔康。

2. 咬肌的采集、冷冻与分析

  1. 在预定时间点，通过给予过量化学试剂（如 CO2 麻醉诱导室中的麻醉剂
  2. 通过单次手术刀切口进行双侧胸廓切开术，确认啮齿类动物已被处死th 腹侧肋骨切开以穿刺肺部（双侧开胸术）。
  3. 重新切开手术切口，以暴露咬肌，并去除覆盖在咬肌表面的皮肤，便于操作。
  4. 从下颌角处开始，沿下颌骨表面分离并切除咬肌，确保剥离过程紧贴骨面，以完整获取咬肌的全层厚度。
    1. 沿下颌骨向前解剖，切断肌腱的附着点。然后，沿颧弓向后解剖（图1D最后，解剖后部附着处，因为此处出血风险较高。
  5. 用1×PBS在室温（RT）下冲洗切除的咬肌组织，并用纸巾彻底吸干标本以去除多余水分。
  6. 将肌肉置于冷冻模具中，浸入最佳切割温度（OCT）包埋介质，使前端朝下，后端朝上。
  7. 将异戊烷加入金属杯中，并通过将其浸入液氮中进行冷却，注意防止液氮进入杯内。
    1. 当异戊烷达到最佳温度（-140 至 -149 °C）并略微变稠后，将含有OCT包埋剂和咬肌的冷冻模具部分浸入异戊烷中，保持直至OCT完全冻结。将冻结后的冷冻模具置于干冰上，直至转移至-80 °C冰箱保存。
  8. 以咬肌样本的前极先被切到的方向进行冷冻切片，逐步向后极移动。将组织块温度设置为 -20 °C，切片刀温度设置为 -15 °C。每推进 200 µm，先切 4 张切片（其中 2 张为 10 µm 厚切片，2 张为 6 µm 厚切片），再向前推进 200 µm，继续切 4 张附加切片，重复此过程直至完成整个样本。
  9. 使用10 µm切片进行组织学分析（如Masson三色染色、苏木精-伊红染色、天狼星红染色等），使用6 µm切片进行免疫组织化学分析。
    注意：进行组织学实验时，也可使用 6 µm 的切片。
  10. 使用明场或荧光显微镜采集图像。
  11. 使用 Image J 软件测量咬肌中约 200 根肌纤维的横截面积。

3. 免疫组织化学分析

  1. 对于胚胎型肌球蛋白重链的免疫组织化学分析，将切片在4%多聚甲醛中室温固定1小时。
  2. 在PBS中室温洗涤切片3次，每次洗涤静置10分钟。
  3. 用0.5% Triton X-100在室温孵育15分钟，以通透组织。
  4. 在PBS中室温洗涤切片3次，每次洗涤静置10分钟。
  5. 在含2%正常山羊血清（NGS）的溶液中，加入来源于小鼠的单克隆一抗（1:200稀释），4 °C过夜孵育。
  6. 在PBS-Tween中室温洗涤切片3次，每次洗涤静置10分钟。
  7. 在含2% NGS的溶液中，加入来源于兔的荧光标记抗小鼠二抗（1:500稀释），室温孵育2小时。
  8. 在PBS-Tween中室温洗涤切片3次，每次洗涤静置10分钟。
  9. 放置盖玻片前，使用3滴DAPI荧光封片剂封片。

结果

使用生物材料评估颅面肌肉体积缺失（VML）及组织再生的效果时，所采用的结局指标包括定量和定性结果。

图2 展示了使用先前所述模型进行定性评估的一个示例。观察 从头合成 水凝胶内的肌纤维生长是一种定性的积极结果图2A）并表明生物材料能够提供足够的结构支撑以及生长因子或营养物质的递送。水凝胶在伤口床内的保留（图2B) 在HE染色中可见。可对生物材料内的其他组织进行定性评估，例如使用HE染色鉴定血管图2C）和马松三色染色（图 2D）。面神经的下颌支和颊支可见于图像的左上角和右上角 图2B，确认水凝胶在VML损伤区域的正确放置并提供定位参考。水凝胶上方可见一层筋膜，表明筋膜闭合成功，并在术后期间保持完整。此阶段若出现阴性结果，则表现为水凝胶完全丢失（图2E）或筋膜闭合丧失及创面床内组织外露（图 2F)，HE染色显示术后不同时间点的创面床或纤维化瘢痕。

免疫组织化学分析在评估用于治疗颅面部肌肉体积缺失（VML）的生物材料时至关重要，可用于识别细胞类型及细胞水平上的分子相互作用。由于VML会导致具有骨骼肌再生能力的常驻细胞及其结构的丧失，因此在损伤部位实现从头肌肉再生是治疗的重要结局指标4，也是基于生物材料的VML疗法疗效评估的关键内容。骨骼肌发育过程中的肌球蛋白同工型，包括胚胎型（MYH3）和新生儿型肌球蛋白（MYH8），会在再生的骨骼肌纤维中重新表达，可作为再生肌纤维的特异性标志物18,19。图3展示了免疫组织化学如何用于识别特定细胞类型的一个示例，本例中为胚胎型肌球蛋白重链。

最后，可以利用 ImageJ 对组织学切片（包括免疫组织化学染色和 Masson 三色染色等特殊染色）的特征进行定量分析，以测量纤维化反应（图 4）。在 VML 损伤中，部分肌肉的缺失会改变肌肉的结构和组成，导致 I 型胶原沉积增加以及明显的组织间隔性纤维化2,3。许多评估基于生物材料的 VML 治疗方法的研究均会比较干预组与对照组之间的纤维化程度4。通过本文所述方法，可在 Masson 三色染色切片中将发生 VML 损伤动物的创面区域识别为纤维化瘢痕（图 4A）。利用 ImageJ 进行颜色解卷积，可分离并定量代表结缔组织的蓝色通道（图 4B），然后将其转换为灰度图像以进行测量（图 4C）。可使用 ImageJ 分离并测量瘢痕区域（图 4D），并依据图像上的比例尺进行校准，以获得准确的尺寸和可重复的面积数据。通过该方法，可对结缔组织的沉积量进行定量分析（图 4E）。

显示植入步骤和种植技术的组织手术流程。
图1：手术示意图展示各操作步骤。（A，B）咬肌VML损伤手术过程。（C）生物材料应用。（D）咬肌取材。（E）取材后肌肉形态。请点击此处查看该图的放大版本。

肌肉纤维的组织学检查，示意图显示了突出肌肉组织的显微镜图像。
图 2：HE 染色与 Masson 三色染色。（A）来自水凝胶-肌肉界面的HE染色大鼠咬肌切片，箭头所示为在形态学上鉴定为骨骼肌纤维的结构。（B）HE染色的大鼠咬肌切片，显示在整个水凝胶中广泛分布的骨骼肌纤维。（C）HE染色和（D）Masson三色染色组织，箭头所示为在形态学上鉴定为血管的结构。（E、F）阴性结果，分别显示水凝胶完全丢失，凝胶附着于咬肌表层而非创面床，以及水凝胶部分丢失且筋膜闭合不全。请点击此处查看该图的放大版本。

肌肉组织的荧光显微镜图像：术后2周与12周eMHC和层粘连蛋白的比较
图3：大鼠咬肌横切面胚胎型肌球蛋白重链（eMHC）和层粘连蛋白的免疫组织化学染色。（A）术后2周。（B）术后12周。与术后2周样本相比，术后12周样本中eMHC浓度升高。图像以20倍放大倍数采集。请点击此处查看该图的高清版本。

组织学分析、脑组织切片、颜色区分、灰度转换、面积计算
图 4：纤维化定量分析。 （A）Masson 三色染色的大鼠咬肌组织切片，用于量化结缔组织沉积，以评估 VML 损伤后 12 周的伤口纤维化程度。（B）使用 Image J 分离对应于结缔组织的蓝色通道。（C）将图像转换为灰度图进行分析。（D）分离出对应于纤维化瘢痕的区域，（E）并计算图像中白色（背景）和黑色（结缔组织）区域的横截面积及所占百分比。图像采用光学显微镜在 10 倍放大倍数下拍摄。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

在该方案中有多个关键步骤需要特别注意，以获得最佳结果。步骤1.4描述了皮肤与浅层咬肌筋膜之间的初始切口及钝性分离操作。进行钝性解剖时，应直接沿皮肤使用剪刀，且剪刀尖端应远离下方的肌肉和筋膜，以防止划伤或意外在筋膜上形成窗口。应避免操作浅层咬肌的尾侧区域，以防无意中损伤下颌下静脉或颈外动脉。步骤1.5和1.6分别描述了筋膜窗的建立以及VML缺损的制备。应注意确保筋膜切口为能够容纳穿孔活检工具通过所需的最小尺寸，因为筋膜倾向于从切口处回缩，若切口过大，则在步骤1.8中可能难以定位其边缘。此外，在筋膜下方进行钝性分离时，仅需分离至足以使穿孔活检工具进入并以适当角度垂直于下颌骨即可。在建立VML损伤时，重要的是要识别出面神经下颌支与颊支之间的最大无神经区域。下颌神经远端分为上、下两个分支，上分支从下分支分出并向面神经颊支走行的位置存在个体差异。由于该分支走行方向偏上，部分动物的下颌神经上分支可能正好位于拟创建缺损的咬肌肌腹内。在此类情况下，不应将该动物用于分析，因其很可能造成周围神经损伤，从而干扰实验数据。在进行穿孔活检时，可能需要轻微旋转以穿透完整的5 mm深度。步骤2.4描述了洗涤组织样本后对其进行吸干以去除多余水分的操作。此步骤旨在防止组织冷冻过程中形成冰晶，从而减少组织学检查中的冷冻伪影20。

该方法的优点之一是易于接触浅层咬肌，并且在手术过程中较少遇到高风险结构。由于血管从肌肉的尾端进入，因此在大多数情况下可以避免大量出血。这一点非常重要，因为它不仅降低了发病风险，还提高了实验的标准化程度，并减少了缺血对肌肉再生产生混杂影响的可能性。由于存在筋膜包被，本方案可用于评估液态或固态形式的生物材料。尽管本方案以无细胞水凝胶为例进行说明，但该方法也可复制用于测试含有干细胞的生物材料，正如先前在肢体肌肉缺损（VML）研究中使用免疫缺陷大鼠所开展的工作那样21。

本研究并未正式定义创伤性肌肉缺损（VML）中的临界尺寸损伤，即内源性修复机制无法再再生肌肉的精确临界点仍不明确。尽管可以合理推测该定义可能涉及去除一定百分比的肌肉体积，且事实上常引用20%这一数值，但现有证据存在矛盾，数据表明其他因素，包括损伤部位与几何形状、动物年龄等，也可能产生影响16,21,22,23。尽管如此，在损伤后12周观察到纤维瘢痕形成以及肌肉边界明显收缩的现象（图4A）表明已发生病理性重塑，强烈提示本研究所采用的损伤达到了标准定义下的临界尺寸。

由于人类的颅面肌（如手部固有肌）与近端肢体肌肉相比体积较小，且执行更为精细的运动，因此其功能更容易受到肌肉体积缺失（VML）的影响。本方案选择咬肌作为研究对象，因其具有足够的组织体积用于检测，且易于操作。然而，损伤的几何形态和位置是评估 VML 时的重要因素，由此模型得出的结论可能无法直接推广至其他颅面肌。咬肌属于咀嚼肌，虽然在儿童期其对表情活动有一定贡献24, ，但其在成年期参与面部表情的功能逐渐减弱24。其他面部肌肉（如颧大肌）的损伤可能因在人的一生中更直接地参与面部表情运动，导致 VML 后产生更显著的心理影响，相较于咬肌尤甚25,26。此外，本研究未评估肌肉的体内 力量产生能力，这是当前领域内亟待解决的一个局限性。迄今为止，尚未有可重复、灵敏度足够用于比较不同治疗组的颅面肌功能检测方法被报道，而面部复杂多样的代偿性肌肉进一步增加了检测难度。未来对该实验方案的改进将致力于引入可直接测量单个面部肌肉力量的技术方法。

在啮齿类动物模型中，针对咬肌体积性肌肉缺损（VML）的组织学分析替代方法非常有限。Kim 等人开发了一种可穿戴式肌电图（EMG）系统，用于评估小鼠咬肌 VML 损伤后的功能状态。然而，该研究的终点时间为 4 周，未在组织学图像中展示生物材料的可视化结果，未描述筋膜闭合方法，且研究重点主要集中于验证其 EMG 系统，而非分析肌肉再生过程及基于生物材料治疗方案的生物相容性17。目前仍需开发新的治疗方法以应对颅面部体积性肌肉缺损问题，而该咬肌 VML 模型具有足够的可重复性，可用于评估肌肉对 VML 损伤的反应，并研究治疗干预对损伤后早期（尤其是伤后前 3 个月）肌肉再生、纤维化及挛缩的影响。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由加州大学旧金山分校（UCSF）年度研究奖学金项目和C-Doctor跨学科转化研究项目资助。感谢加州大学旧金山分校Pomerantz实验室及颅面生物学项目成员的贡献。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
F1.652 肌球蛋白重链（胚胎型）单克隆抗体DSHBF1.652
山羊抗小鼠 IgG2b 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647 标记InvitrogenA-21242
山羊抗兔 IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 标记InvitrogenA-11034
Integra 标准活检打孔器，一次性标准活检打孔器；5 mm，直径：0.19 英寸，0.5 cmIntegra12460411
含 DAPI 的封片介质——水性，FluoroshieldAbcamab104139
兔抗小鼠 IgG H&L（Alexa Fluor 647）预吸附抗体Abcamab150127
磺胺甲噁唑/甲氧苄啶口服混悬液，樱桃味，473 mLMed-Vet InternationalSKU: RXBAC-SUSP

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