用于研究生物工程材料的咀嚼肌体积性肌肉缺损啮齿动物模型

摘要

本文介绍了一种在大鼠咬肌中手术建立容积性肌肉缺损（VML）损伤的实验方案，为研究颅面肌损伤及其利用生物材料（如新型水凝胶）进行治疗提供了可重复且易于操作的模型。

摘要

颅面部容积性肌肉丧失（VML）损伤可由严重创伤、手术切除、炎症以及先天性或其他获得性疾病引起。颅面部 VML 的治疗通常涉及外科功能性肌肉移植。然而，这些手术方法无法恢复正常的肌肉功能、感觉或面部表情，且此类损伤更常被忽视而未予治疗。目前针对颅面部 VML 动物模型中骨骼肌再生的研究极为有限。本文描述了一种用于研究颅面部 VML 损伤的大鼠模型，以及一套用于评估治疗此类损伤的生物材料组织学反应的实验方案。在手术造成 VML 损伤的同时植入液态水凝胶或冻干支架材料，在长达 12 周的终末时间点处死动物并切除咬肌，该方法具有较高的组织保留率且并发症极少。采用苏木精-伊红（HE）、马松三色染色及免疫组织化学分析，评估骨骼肌再生情况以及材料的生物相容性和免疫调节作用。尽管本文以透明质酸基水凝胶为例进行研究，但该模型可用于后续多种材料在 VML 损伤修复中的评估。

引言

严重创伤、手术切除、炎症及其他后天性状况可能导致组织缺损程度超出骨骼肌内源性修复机制的代偿能力。负责主导再生过程的常驻细胞及结构的缺失，可引发病理性重塑和组织纤维化，造成持久性的功能与感觉障碍，此类情况被称为体积性肌肉缺损（VML）。^1,2,3VML损伤的炎症反应涉及一个已有充分记录且复杂的机制，其中包括巨噬细胞、细胞因子和成肌细胞，为再生医学提供了诸多理论上的干预靶点⁴. 尽管许多 体外 已有研究在肢体创伤性肌肉缺损（VML）的动物模型中应用了这些靶点，但在颅面部创伤性肌肉缺损动物模型中，针对骨骼肌再生的研究仍缺乏。^5,6,7.

颅面部组织缺损可能由前述情况引起，也可能出现在先天性状况中，例如唇腭裂，某些情况下伴有肌肉组织真正的容积性缺失。^8,9由于颅面区域的肌肉在功能和美学外观方面均具有重要作用，因此肌肉体积缺失（VML）的长期影响可能带来显著的心理困扰。颅面骨骼肌在多个方面与源自体节的四肢骨骼肌存在差异，包括基因表达、胚胎起源、卫星细胞表型、卫星细胞数量、肌纤维组成以及肌肉结构。^10,11,12,13这些差异可能导致血管肌肉病变（VML）对颅面肌的影响不同于体节来源的肌肉^14,15迄今为止，在肢体VML动物模型中显示出促进再生效果的组织工程方法，尚未在颅面部VML动物模型中取得同等程度的转化效果。¹⁶这凸显了优化的必要性 体内 动物颅面VML模型的构建方法

尽管已开展多项关于颅面部位体积性肌肉缺损（VML）的体内研究，但这些研究规模较小，且在动物模型中建立稳定可靠的颅面肌肉缺损具有挑战性^8,13。Kim 等人报道了一种小鼠咬肌 VML 模型的建立，但该研究仅在损伤后 28 天内评估了组织学变化，且在检测不同时间点间组织学结果差异方面的统计效能不明确¹⁷。Rodriguez 等人报道了一种绵羊颅面 VML 模型的建立，但他们指出实验组内变异度较高，提示初始手术损伤的严重程度存在异质性¹⁶。本文中，我们报道了我们所建立的大鼠咬肌 VML 模型的实验方案，并展示了其在评估组织工程策略中的应用价值。

方案

本研究严格遵循所有适用法规，包括遵守《实验动物护理和使用指南》中所述的建议。所有动物实验操作及术后护理均经加州大学旧金山分校（UCSF）机构动物护理和使用委员会批准（IACUC方案编号：AN195944-01）。

1. VML 手术

1. 使用异氟烷全身麻醉（流速为1%-5%）在密闭容器中麻醉12周龄、体重为276-300 g的雄性Sprague-Dawley大鼠 ，然后将其转移至无菌手术区域。
   1. 将啮齿动物置于左侧卧位，使颈部保持中立伸展状态，鼻部接入麻醉面罩，以便暴露面部右侧。
   2. 将异氟烷流速从诱导剂量逐渐降低至维持剂量（约2%）。
2. 在啮齿动物的眼睛上涂抹眼科软膏。
3. 使用脱毛膏清除手术区域的毛发，该区域以上下界分别为右口角至右耳根部的连线、右耳根部上方及下颌角下方所围成。
   1. 使用乙醇和聚维酮碘溶液以环形方式多次消毒手术区域。
      注：由于手术入路的大小和位置限制，本方案中不使用无菌巾单。操作应按照动物护理指南采用无菌技术进行。
4. 从右侧下颌胡须垫至右耳做一条长3-4 cm的纵向切口。
   1. 抬起皮瓣，以暴露右侧咬肌以及面神经的颊支和下颌支（图1A）。
   2. 使用钝性分离法将皮肤与下方筋膜分离，并用手术钳固定皮肤边缘，使其处于牵拉状态，以便清晰观察下方肌肉组织。
5. 在覆盖咬肌前部的筋膜上做一条长1-2 cm的横向切口。使用钝性分离法小心扩大筋膜与咬肌之间的间隙，同时保持剩余筋膜的整体完整性。
6. 以筋膜切口作为通向浅层咬肌的窗口，使用灭菌的一次性穿孔活检器在肌肉上制造一个直径5 mm、深度5 mm的圆形损伤。确保缺损位于面神经颊支与下颌支之间中心位置，并注意避免对神经造成损伤（图1B）。
7. 将生物材料植入圆形咬肌损伤区域（图1C）。
8. 待材料就位后，使用单针5-0单股缝线缝合包裹肌肉的筋膜窗口，以防止材料移位。
   注：固态制剂可直接置入伤口，可轻柔扰动组织以促进血液浸润饱和；液态制剂则根据需要允许其原位凝胶化，或立即用筋膜覆盖固定以防止移位。本实验中使用的是一种丙烯化透明质酸基冷冻凝胶。
9. 使用5-0单股缝线采用单纯间断或连续皮下缝合技术关闭皮肤切口。
   1. 在缝线上涂抹皮肤粘合剂，以帮助预防术后切口裂开。
10. 将大鼠置于配备外部热源（笼下加热垫或笼内无菌暖手袋）的笼中恢复，并在术后观察30分钟。
11. 将复方新诺明抗生素（每5 mL含200 mg甲氧苄啶和40 mg磺胺甲噁唑）按5 mL/200 mL水的比例稀释于饮用水中，在术后7天内供大鼠自由饮用。确保按照机构规程实施围手术期镇痛。
    注：本研究中，术前皮下注射0.25%布比卡因，麻醉苏醒前皮下注射0.05 mg/kg布托啡诺，麻醉苏醒前及次日清晨腹腔注射2 mg/kg美洛昔康。

2. 咬肌的采集、冷冻与分析

1. 在预定时间点，通过给予过量化学试剂（如 CO₂ 麻醉诱导室中的麻醉剂
2. 通过单次手术刀切口进行双侧胸廓切开术，确认啮齿类动物已被处死^th 腹侧肋骨切开以穿刺肺部（双侧开胸术）。
3. 重新切开手术切口，以暴露咬肌，并去除覆盖在咬肌表面的皮肤，便于操作。
4. 从下颌角处开始，沿下颌骨表面分离并切除咬肌，确保剥离过程紧贴骨面，以完整获取咬肌的全层厚度。
   1. 沿下颌骨向前解剖，切断肌腱的附着点。然后，沿颧弓向后解剖（图1D最后，解剖后部附着处，因为此处出血风险较高。
5. 用1×PBS在室温（RT）下冲洗切除的咬肌组织，并用纸巾彻底吸干标本以去除多余水分。
6. 将肌肉置于冷冻模具中，浸入最佳切割温度（OCT）包埋介质，使前端朝下，后端朝上。
7. 将异戊烷加入金属杯中，并通过将其浸入液氮中进行冷却，注意防止液氮进入杯内。
   1. 当异戊烷达到最佳温度（-140 至 -149 °C）并略微变稠后，将含有OCT包埋剂和咬肌的冷冻模具部分浸入异戊烷中，保持直至OCT完全冻结。将冻结后的冷冻模具置于干冰上，直至转移至-80 °C冰箱保存。
8. 以咬肌样本的前极先被切到的方向进行冷冻切片，逐步向后极移动。将组织块温度设置为 -20 °C，切片刀温度设置为 -15 °C。每推进 200 µm，先切 4 张切片（其中 2 张为 10 µm 厚切片，2 张为 6 µm 厚切片），再向前推进 200 µm，继续切 4 张附加切片，重复此过程直至完成整个样本。
9. 使用10 µm切片进行组织学分析（如Masson三色染色、苏木精-伊红染色、天狼星红染色等），使用6 µm切片进行免疫组织化学分析。
   注意：进行组织学实验时，也可使用 6 µm 的切片。
10. 使用明场或荧光显微镜采集图像。
11. 使用 Image J 软件测量咬肌中约 200 根肌纤维的横截面积。

3. 免疫组织化学分析

1. 对于胚胎型肌球蛋白重链的免疫组织化学分析，将切片在4%多聚甲醛中室温固定1小时。
2. 在PBS中室温洗涤切片3次，每次洗涤静置10分钟。
3. 用0.5% Triton X-100在室温孵育15分钟，以通透组织。
4. 在PBS中室温洗涤切片3次，每次洗涤静置10分钟。
5. 在含2%正常山羊血清（NGS）的溶液中，加入来源于小鼠的单克隆一抗（1:200稀释），4 °C过夜孵育。
6. 在PBS-Tween中室温洗涤切片3次，每次洗涤静置10分钟。
7. 在含2% NGS的溶液中，加入来源于兔的荧光标记抗小鼠二抗（1:500稀释），室温孵育2小时。
8. 在PBS-Tween中室温洗涤切片3次，每次洗涤静置10分钟。
9. 放置盖玻片前，使用3滴DAPI荧光封片剂封片。

结果

使用生物材料评估颅面肌肉体积缺失（VML）及组织再生的效果时，所采用的结局指标包括定量和定性结果。

图2 展示了使用先前所述模型进行定性评估的一个示例。观察 从头合成 水凝胶内的肌纤维生长是一种定性的积极结果图2A）并表明生物材料能够提供足够的结构支撑以及生长因子或营养物质的递送。水凝胶在伤口床内的保留（图2B) 在HE染色中可见。可对生物材料内的其他组织进行定性评估，例如使用HE染色鉴定血管图2C）和马松三色染色（图 2D）。面神经的下颌支和颊支可见于图像的左上角和右上角 图2B，确认水凝胶在VML损伤区域的正确放置并提供定位参考。水凝胶上方可见一层筋膜，表明筋膜闭合成功，并在术后期间保持完整。此阶段若出现阴...

讨论

在该方案中有多个关键步骤需要特别注意，以获得最佳结果。步骤1.4描述了皮肤与浅层咬肌筋膜之间的初始切口及钝性分离操作。进行钝性解剖时，应直接沿皮肤使用剪刀，且剪刀尖端应远离下方的肌肉和筋膜，以防止划伤或意外在筋膜上形成窗口。应避免操作浅层咬肌的尾侧区域，以防无意中损伤下颌下静脉或颈外动脉。步骤1.5和1.6分别描述了筋膜窗的建立以及VML缺损的制备。应注意确保筋膜切口为能够容纳穿孔活检工具通过所需的最小尺寸，因为筋膜倾向于从切口处回缩，若切口过大，则在步骤1.8中可能难以定位其边缘。此外，在筋膜下方进行钝性分离时，仅需分离至足以使穿孔活检工具进入并以适当角度垂直于下颌骨即可。在建立VML损伤时，重要的是要识别出面神经下颌支与颊支之间的最大无神经区域。下颌神经远端分为上、下两个分支，上分支从下分支分出并向面神经颊支走行的位置存在个体差异。由于该分支走行方向偏上，部分动物的下颌神经上分支可能正好位于拟创建缺损的咬肌肌腹内。在此类情况下，不应将该动物用于分析，因其很可能造成周围神经损伤，从而干扰实验数据。在进行穿孔活检时，可能需要轻微旋转以穿透完整的5 mm深度。步骤2.4描述了洗涤组织样本后对其进行吸干以去除多余水分的操作。此步骤旨在防止组...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
F1.652 肌球蛋白重链（胚胎型）单克隆抗体	DSHB	F1.652
山羊抗小鼠 IgG2b 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647 标记	Invitrogen	A-21242
山羊抗兔 IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 标记	Invitrogen	A-11034
Integra 标准活检打孔器，一次性标准活检打孔器；5 mm，直径：0.19 英寸，0.5 cm	Integra	12460411
含 DAPI 的封片介质——水性，Fluoroshield	Abcam	ab104139
兔抗小鼠 IgG H&L（Alexa Fluor 647）预吸附抗体	Abcam	ab150127
磺胺甲噁唑/甲氧苄啶口服混悬液，樱桃味，473 mL	Med-Vet International	SKU: RXBAC-SUSP