本文介绍了一种在大鼠咬肌中手术建立容积性肌肉缺损（VML）损伤的实验方案，为研究颅面肌损伤及其利用生物材料（如新型水凝胶）进行治疗提供了可重复且易于操作的模型。
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本文内容
摘要
摘要
颅面部容积性肌肉丧失（VML）损伤可由严重创伤、手术切除、炎症以及先天性或其他获得性疾病引起。颅面部 VML 的治疗通常涉及外科功能性肌肉移植。然而，这些手术方法无法恢复正常的肌肉功能、感觉或面部表情，且此类损伤更常被忽视而未予治疗。目前针对颅面部 VML 动物模型中骨骼肌再生的研究极为有限。本文描述了一种用于研究颅面部 VML 损伤的大鼠模型，以及一套用于评估治疗此类损伤的生物材料组织学反应的实验方案。在手术造成 VML 损伤的同时植入液态水凝胶或冻干支架材料，在长达 12 周的终末时间点处死动物并切除咬肌，该方法具有较高的组织保留率且并发症极少。采用苏木精-伊红（HE）、马松三色染色及免疫组织化学分析，评估骨骼肌再生情况以及材料的生物相容性和免疫调节作用。尽管本文以透明质酸基水凝胶为例进行研究，但该模型可用于后续多种材料在 VML 损伤修复中的评估。
引言
严重创伤、手术切除、炎症及其他后天性状况可能导致组织缺损程度超出骨骼肌内源性修复机制的代偿能力。负责主导再生过程的常驻细胞及结构的缺失，可引发病理性重塑和组织纤维化，造成持久性的功能与感觉障碍，此类情况被称为体积性肌肉缺损（VML）。1,2,3VML损伤的炎症反应涉及一个已有充分记录且复杂的机制，其中包括巨噬细胞、细胞因子和成肌细胞，为再生医学提供了诸多理论上的干预靶点4. 尽管许多 体外 已有研究在肢体创伤性肌肉缺损（VML）的动物模型中应用了这些靶点，但在颅面部创伤性肌肉缺损动物模型中，针对骨骼肌再生的研究仍缺乏。5,6,7.
颅面部组织缺损可能由前述情况引起，也可能出现在先天性状况中，例如唇腭裂，某些情况下伴有肌肉组织真正的容积性缺失。8,9由于颅面区域的肌肉在功能和美学外观方面均具有重要作用，因此肌肉体积缺失（VML）....
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方案
本研究严格遵循所有适用法规，包括遵守《实验动物护理和使用指南》中所述的建议。所有动物实验操作及术后护理均经加州大学旧金山分校（UCSF）机构动物护理和使用委员会批准（IACUC方案编号：AN195944-01）。
1. VML 手术
- 使用异氟烷全身麻醉（流速为1%-5%）在密闭容器中麻醉12周龄、体重为276-300 g的雄性Sprague-Dawley大鼠 ，然后将其转移至无菌手术区域。
- 将啮齿动物置于左侧卧位，使颈部保持中立伸展状态，鼻部接入麻醉面罩，以便暴露面部右侧。
- 将异氟烷流速从诱导剂量逐渐降低至维持剂量（约2%）。
- 在啮齿动物的眼睛上涂抹眼科软膏。
- 使用脱毛膏清除手术区域的毛发，该区域以上下界分别为右口角至右耳根部的连线、右耳根部上方及下颌角下方所围成。
- 使用乙醇和聚维酮碘溶液以环形方式多次消毒手术区域。
注：由于手术入路的大小和位置限制，本方案中不使用无菌巾单。操作应按照动物护理指南采用无菌技术进行。
- 使用乙醇和聚维酮碘溶液以环形方式多次消毒手术区域。
- 从右侧下颌胡须垫至右耳做一条长3-4 cm的纵向切口。
- 抬起皮瓣，以暴露右侧咬肌以及面神经的颊支和下颌支（图1A）....
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结果
使用生物材料评估颅面肌肉体积缺失（VML）及组织再生的效果时，所采用的结局指标包括定量和定性结果。
图2 展示了使用先前所述模型进行定性评估的一个示例。观察 从头合成 水凝胶内的肌纤维生长是一种定性的积极结果图2A）并表明生物材料能够提供足够的结构支撑以及生长因子或营养物质的递送。水凝胶在伤口床内的保留（图2B) 在HE染色中可见。可对生物材料内的其他组织进行定性评估，例如使用HE染色鉴定血管图2C）和马松三色染色（图 2D）。面神经的下颌支和颊支可见于图像的左上角和右上角 图2B，确认水凝胶在VML损伤区域的正确放置并提供定位参考。水凝胶上方可见一层筋膜，表明筋膜闭合成功，并在术后期间保持完整。此阶段若出现阴.......
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讨论
在该方案中有多个关键步骤需要特别注意，以获得最佳结果。步骤1.4描述了皮肤与浅层咬肌筋膜之间的初始切口及钝性分离操作。进行钝性解剖时，应直接沿皮肤使用剪刀，且剪刀尖端应远离下方的肌肉和筋膜，以防止划伤或意外在筋膜上形成窗口。应避免操作浅层咬肌的尾侧区域，以防无意中损伤下颌下静脉或颈外动脉。步骤1.5和1.6分别描述了筋膜窗的建立以及VML缺损的制备。应注意确保筋膜切口为能够容纳穿孔活检工具通过所需的最小尺寸，因为筋膜倾向于从切口处回缩，若切口过大，则在步骤1.8中可能难以定位其边缘。此外，在筋膜下方进行钝性分离时，仅需分离至足以使穿孔活检工具进入并以适当角度垂直于下颌骨即可。在建立VML损伤时，重要的是要识别出面神经下颌支与颊支之间的最大无神经区域。下颌神经远端分为上、下两个分支，上分支从下分支分出并向面神经颊支走行的位置存在个体差异。由于该分支走行方向偏上，部分动物的下颌神经上分支可能正好位于拟创建缺损的咬肌肌腹内。在此类情况下，不应将该动物用于分析，因其很可能造成周围神经损伤，从而干扰实验数据。在进行穿孔活检时，可能需要轻微旋转以穿透完整的5 mm深度。步骤2.4描述了洗涤组织样本后对其进行吸干以去除多余水分的操作。此步骤旨在防止组.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由加州大学旧金山分校（UCSF）年度研究奖学金项目和C-Doctor跨学科转化研究项目资助。感谢加州大学旧金山分校Pomerantz实验室及颅面生物学项目成员的贡献。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| F1.652 肌球蛋白重链（胚胎型）单克隆抗体 | DSHB | F1.652 | |
| 山羊抗小鼠 IgG2b 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647 标记 | Invitrogen | A-21242 | |
| 山羊抗兔 IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 标记 | Invitrogen | A-11034 | |
| Integra 标准活检打孔器，一次性标准活检打孔器；5 mm，直径：0.19 英寸，0.5 cm | Integra | 12460411 | |
| 含 DAPI 的封片介质——水性，Fluoroshield | Abcam | ab104139 | |
| 兔抗小鼠 IgG H&L（Alexa Fluor 647）预吸附抗体 | Abcam | ab150127 | |
| 磺胺甲噁唑/甲氧苄啶口服混悬液，樱桃味，473 mL | Med-Vet International | SKU: RXBAC-SUSP |
参考文献
- Gilbert-Honick, J., Grayson, W. Vascularized and innervated skeletal muscle tissue engineering. Adv Healthc Mater. 9 (1), 1900626(2020).
- Aguilar, C. A., et al. Multiscale analysis of a regenerative therapy for treatment of volumetric muscle los....
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