本研究中介绍的实验方案展示了cAMP差异检测器In Situ通过两种方法检测cAMP的有效性。其中一种方法使用96孔板读数分光光度计结合HEK-293细胞进行检测；另一种方法则在荧光显微镜下观察单个HASM细胞。
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摘要
摘要
cAMP差异检测器 原位 (cADDis) 是一种新型生物传感器，可实现对活细胞内 cAMP 水平的连续检测。该生物传感器由一个经环状重排的荧光蛋白与 Epac2 的铰链区连接而成，形成单一荧光团生物传感器，其在结合 cAMP 后荧光信号增强或减弱。该传感器有红色和绿色荧光增强型，以及绿色荧光减弱型，并包含多种靶向亚细胞定位的红色和绿色版本。为展示该生物传感器的有效性，本研究采用了在结合 cAMP 后荧光减弱的绿色荧光减弱型。文中演示了两种使用该传感器的实验方案：一种利用 96 孔板读板式分光光度计 可与高通量筛选兼容，另一种则利用荧光显微镜进行单细胞成像。在酶标仪上，培养于96孔板中的HEK-293细胞经10 µM forskolin或10 nM isoproterenol刺激后，绿色向下型生物传感器的荧光信号迅速且显著下降。该生物传感器还可用于在荧光显微镜下监测单个人气道平滑肌（HASM）细胞内的cAMP水平。当使用forskolin或isoproterenol刺激时，绿色向下型生物传感器在细胞群体中表现出类似反应。该单细胞检测方法可在20倍和40倍放大倍数下观察生物传感器的定位。因此，该cAMP生物传感器具有高灵敏度和灵活性，可对永生化细胞和原代细胞、单个细胞或细胞群体进行cAMP的实时检测。这些特性使cADDis成为研究活细胞中cAMP信号动态的有力工具。
引言
腺苷3′,5′-单磷酸（cAMP）在细胞间通讯及多种生理过程的协调中发挥核心作用。cAMP作为第二信使，将来自激素、神经递质或其他细胞外分子的外部信号传递至细胞内，从而启动一系列胞内事件1此外，cAMP 参与多种信号通路，包括与G蛋白偶联受体（GPCRs）和腺苷酸环化酶相关的通路。理解cAMP在细胞信号传导中的作用，对于揭示正常细胞功能的复杂机制以及开发多种疾病潜在疗法至关重要。2.
过去，人们采用多种方法直接或间接地测定 cAMP，包括对细胞内 ATP 池进行放射性标记后通过层析纯化、高效液相色谱法（HPLC）、放射免疫分析法以及酶联免疫分析法1,2。这些传统检测方法的局限性在于它们属于终点检测，需使用大量样本才能构建出依赖时间的响应曲线。近年来，人们开发了荧光共振能量转移（FRET）传感器，可在活细胞中进行检测，获得实时动态数据，并可将传感器靶向定位于不同的亚细胞区域3。FRET 技术利用两种荧光基团，即一个荧光供体和一个荧光受体；当两者距离较近时，受体荧光基团可被供体发出的荧光能量所激发。最常用的两种荧光基团是青色荧光蛋白（CFP）和黄色荧光蛋白（YFP），因为它们具有相匹配的激发和发射特性。除了 CFP 和 YFP，绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP）也常用于 FRET 生物传感器。cAMP 的 FRET 生物传感器通过在 Epac2 cAMP 结合蛋白的两端分别连接供体和受体荧光基团来实现功能。当 cAMP 与 Epac2 结合后，会引起其构象改变，从而增加供体与受体荧光基团之间的距离3,4。这种构象变化表现为 FRET 信号的减弱，即供体荧光基团向受体荧光基团传递能量所引起的受体激发显著降低3。尽管该过程看似简单，但用于 cAMP 研究的 FRET 生物传感器仍存在诸多局限性和问题5。其中之一是荧光蛋白的选择，例如 GFP 本身可自然形成二聚体，从而降低检测灵敏度6。基于 FRET 的 cAMP 生物传感器已被靶向特定微结构域7，但由于包含两个荧光基团的构建体体积较大，可能限制其应用6。另一个重要问题是 FRET 信号的信噪比较低，这是由于荧光基团的激发光与发射光之间存在光谱重叠，导致需要高频率采样，并使结果分析变得复杂4,5。
最近，一种新型生物传感器（cAMP差异检测器） 原位cADDis 在研究 cAMP 信号转导调控时，解决了上述及其他局限性8一个重要的改进在于仅依赖单一荧光染料。这能够实现快速而高效的信号检测，具有更宽的动态范围和更高的信噪比。因此，由于需要筛选的波长范围更窄，检测的准确性得以提高。8与FRET探针类似，该生物传感器已被靶向定位至细胞内特定区域，从而可用于研究区室化理论，并探索脂筏与非脂筏区域及其他亚细胞结构域9最重要的一点或许是单一荧光团生物传感器适用于高通量筛选，相较于基于FRET的生物传感器，其灵敏度和可重复性更高。该生物传感器被包装于BacMam载体中，可实现多种细胞类型的高效转导，并对蛋白表达进行精确调控。
表达调控 通过 BacMam 载体在使用来自不同物种的 GPCR 正交基因进行检测时尤为有用，有助于解释动物研究中的数据。此外，对受体表达水平的控制对于测量药物效应强度的差异（例如逆向激动剂和部分激动剂）至关重要，而较低的受体表达水平有助于模拟动物组织中天然存在的低表达状态。BacMam 是一种经过改造的杆状病毒载体，能够转导哺乳动物细胞，例如原代细胞培养物和 HEK-293 细胞系10. 显性可筛选标记使得BacMam系统相较于传统质粒转染具有更高的稳定性11此类特异性启动子可实现更高效的基因递送与表达。此外，添加曲古抑菌素A（一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂）可提高报告蛋白的表达水平。11表达水平可以被调控 通过 BacMam 病毒的滴度需根据每种细胞类型进行优化。对于该生物传感器，红色或绿色荧光蛋白分别连接在 Epac 的 N 末端和 C 末端。当 cAMP 结合时，生物传感器发生构象变化，使邻近荧光蛋白的氨基酸发生位移。这一变化导致在 400 nm 处的吸收从阴离子态转变为中性态，从而降低荧光强度。
单个细胞中表达有90至120种G蛋白偶联受体（GPCRs），可响应多种神经体液信号12因此，可以假设每个细胞中至少有数十种GPCR分别通过与Gs或Gi偶联来刺激或抑制cAMP。尽管目前已在实时监测这一第二信使方面取得进展（例如FRET技术），但仍需要更高效的方法。本文介绍了利用cADDis实时监测cAMP信号合成与降解的技术方法。可通过荧光酶标仪进行高通量检测，或通过荧光显微镜进行单细胞检测，以实时监测荧光变化。这些方法适用于广泛涉及GPCR信号转导的生物学问题研究 通过 cAMP
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方案
本研究中使用的所有试剂和设备的详细信息均列在材料表中。
1. 酶标仪高通量检测法
- 在96孔板中接种携带cADDis BacMam载体的HEK-293细胞（第1天）
- 在生物安全柜中分种并感染细胞。
- 温热的HEK培养基（表10.25% 胰蛋白酶-EDTA，置于 37 °C 水浴中。
- 用浸有乙醇的纸巾擦拭生物安全柜和材料以进行消毒。
- 用移液管吸除并弃去培养瓶中的 HEK 培养基。
- 加入 5 mL Mg2+ 和 Ca2+ 用移液管加入预热至37 °C的无钙镁杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS），倾斜培养瓶使其充分覆盖瓶底。随后用移液管吸除并弃去DPBS。
- 用血清移液管加入3 mL预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞。倾斜培养瓶，确保试剂完全覆盖瓶底。盖上瓶盖，静置3–5分钟，使细胞从培养瓶底部脱落 烧瓶
注意：本实验的优化条件适用于75 cm2 烧瓶；若使用不同规格的培养装置，可能需要调整试剂的体积。 - 吸取5 mL含抗生素的新鲜培养基。将培养基排出后重新吸入，重复冲洗培养瓶内壁，以物理方式使细胞脱落。
- 收集烧瓶中的全部体积（8 mL），转移至15 mL离心管中，在25 °C下以200 x g离心 g 5 分钟。
- 离心后，用血清移液管小心吸除上清液，注意不要扰动沉淀。
- 为在不扰动细胞沉淀的情况下洗涤细胞，加入 500 µL 不含 Mg 的 DPBS2+ 和 Ca2+ 将DPBS加入15 mL离心管侧壁。轻轻加入DPBS后，尽可能多地移除并弃去上清液，注意不要扰动沉淀。重复一次 更多时间。
- 计数细胞，并调整细胞密度至250,000个细胞/mL。
- 根据每孔所需的试剂体积，配制用于黑色透明底96孔板的预混液。这称为 "组织培养板" 参见以下卷册：
注意：以1个孔为例（总体积200 µL）：40 µL生物传感器BacMam载体（储存浓度为2 x 10⁸）10 病毒基因/mL），2 µL 曲古抑菌素A（储存液浓度100 µM；终浓度1 µM），158 µL 细胞密度为250,000 个细胞/mL的细胞悬液。10个孔的示例（总体积2 mL）：400 µL 生物传感器BacMam载体（储存液浓度2 × 10⁸ 病毒基因/mL）10 病毒基因/mL），20 µL 曲古抑菌素A（储存浓度100 µM），1,580 µL 培养基（细胞密度为250,000 个细胞/mL） - 每孔加入 200 µL 混合液。将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育。2 在平板读数分光光度计检测前，于培养箱中孵育24小时。
- 在生物安全柜中分种并感染细胞。
- 在酶标仪上运行
- 在实验台面上，小心吸去每个孔中的全部培养基，然后加入 180 µL 含镁的 DPBS2+ 和 Ca2+ 在37 °C下。
- 在显微镜下观察细胞以确认细胞状态良好。
- 用铝箔包裹培养板，在37 °C孵育30分钟至1小时。
- 孵育期间，将药物按1:10稀释（也称为10倍稀释），配制为所需终浓度。即配制100 µM forskolin和100 nM isoproterenol。
- 以柱状方式向透明的96孔板中每孔加入60 µL的每种药物（以下简称该板为 "药物平板").
注意：为获得适当的药物稀释度并优化读数，需将药物加入透明的96孔板中，该板被称为 "药物平板"，应在读取时转移到 "组织培养板" 使用96道多通道移液器，使药物能够同时加入所有孔中，并通过荧光分光光度计快速读取结果。
- 荧光酶标仪设置
- 调整荧光酶标仪的设置。
- 阅读模式： 荧光读取类型： 动力学波长读数： 494 nm 和 522 nm.
- 阅读时间：输入 3 分钟 用于基线荧光读数 7 分钟 用于药物添加后的处理。"间隔" 被输入为 00:00:30 每次读取之间间隔 30 s。
注意：读取时间可根据所需时间进行优化和延长。
- 调整荧光酶标仪的设置。
- 数据采集
- 从培养箱中取出组织培养板，移除铝箔和板盖，将组织培养板放入酶标仪中。关闭酶标仪抽屉，使组织培养板静置并平衡至仪器温度（37 °C）。
- 将装有药物稀释液的透明96孔板（药物板）置于96道移液器下方，练习从各孔中吸取20 µL液体。确保移液器吸头中吸入的药物体积均匀一致。
- 启动一个 "基线" 测量运行。
注意：40 RFU 及以上被视为有效数据。若数据低于此值，应终止并弃用该实验。 - 组织板将在基线运行结束时从读板机中弹出。迅速而小心地从透明药物板中吸取20 µL液体，加入黑色组织板中。随后立即开始 "治疗" 运行。添加药物后，组织板在读板仪外停留的时间不应超过30秒。
注意：若加药速度过快，细胞会从培养板上脱落，导致实验无法使用。此外，细胞已感染光敏感绿色荧光蛋白，因此必须迅速且及时地加入药物并立即开始第二次读数，以避免遗漏反应的早期阶段。 - 第二次读数完成后，确保组织板已从读板机中弹出，且数据收集已结束。
注意：在处理组织板之前，最好先确认细胞仍然附着在板上。在显微镜下观察细胞。如果细胞脱落，则结果无效，应予以弃用，实验需重新进行。 - 将生成的数据导出为 Excel 文件。
- 打开来自酶标仪的导出的可读 Excel 数据，将相关信息复制并粘贴到 Excel 转换模板中。数据将从酶标仪的原始格式转换为单孔格式，复制数据右侧将显示各列的读数结果。
注意：随时间变化的荧光值列以相对荧光单位（RFU，列为转换标题）表示，并以相对于初始读数时RFU读数的小数变化形式表示（t0 命名为ΔF）。在Excel模板中，ΔF表格设定为加药前的最后一次基线读数。这是第6次th 数据采集点 - 数据转换后，将Delta F的数据复制并粘贴到数据分析软件中，作为随时间变化的荧光衰减或相对衰减进行分析。
- 将 X 轴标题更改为 "时间（s）" 以及Y轴标题设为“ΔF/F”0" 用于相对小数数值。
2. 使用倒置荧光显微镜进行单细胞检测
- 在35 mm培养皿中用cADDis BacMam载体转导HASM细胞（第1天）
- 在生物安全柜中分装并感染细胞。
- 预热 HASM 培养基（表1)，置于37 °C水浴中消化0.25%胰蛋白酶-EDTA。
- 用浸有乙醇的纸巾对生物安全柜及材料进行消毒，并擦拭生物安全柜表面。
- 用血清移液管移除并弃去烧瓶中的 HASM 培养基。
- 加入 5 mL Mg2+ 和 Ca2+ 用新的移液管加入预热至37 °C的无钙镁磷酸盐缓冲液（DPBS），倾斜培养瓶使缓冲液冲洗瓶底。
- 用血清移液管加入3 mL预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞。倾斜培养瓶，确保试剂完全覆盖瓶底。静置3–5分钟，使细胞从培养瓶表面脱落。
- 吸取5 mL含抗生素的新鲜培养基，用移液器反复吹打以使细胞从培养瓶底部脱落。
- 将烧瓶中的全部体积（8 mL）转移至离心管中，在200 × g条件下离心5分钟。
- 离心后，用血清移液管小心吸除上清液，注意不要扰动沉淀。
- 在不扰动沉淀的情况下，加入500 µL不含Mg的DPBS2+ 和 Ca2+ 将DPBS加入离心管侧壁。尽可能吸除并弃去液体，再重复一次。
注意：本实验针对75 cm2 烧瓶；若使用不同规格的培养装置，可能需要对试剂的体积进行调整。 - 计数细胞并调整至40,000个细胞/mL的细胞密度。
- 根据35 mm培养皿每孔所需的试剂体积配制主混合液。参见下方体积：
注意：1个孔的示例（总体积500 µL）：20 µL生物传感器BacMam载体（储存浓度为2 x 1010 病毒基因/mL），5 µL 曲古抑菌素A（储存液浓度100 µM，终浓度1 µM），500 µL 细胞密度为40,000 个细胞/mL的培养基。4孔示例（总体积2 mL）：80 µL 生物传感器BacMam载体（储存液浓度为病毒基因/mL），20 µL 曲古抑菌素A（储存液浓度100 µM，终浓度1 µM），2000 µL 细胞密度为40,000 个细胞/mL的培养基。 - 每孔加入 500 µL 混合液。将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育。2 在继续实验前孵育24小时。
注意：细胞数量可能因细胞系不同而有所差异。为避免分析时细胞重叠，请使用较低的细胞数量。
- 在生物安全柜中分装并感染细胞。
- 制备药理学试剂（第2天）
- 小心吸出每孔中的培养基，替换为 450 µL 含 Mg 的 DPBS2+ 和 Ca2+ 37 °C
- 用铝箔包裹培养皿，并将35 mm的培养板在37 °C下孵育30分钟至1小时。
- 在显微镜下观察细胞以确认细胞状态良好。
- 同时，准备比目标终浓度高1个对数单位（即高10倍）的药物溶液。因此，配制100 µM的forskolin和100 nM的isoproterenol。
- 对于对数剂量滴定，将药物配制为 10 mM，并通过系列稀释获得 100 µM 的佛司可林和 100 nM 的异丙肾上腺素。
- 数据采集
注意：以下设置适用于荧光倒置显微镜。不同显微镜配套的软件可能有所差异；此处描述的是本实验方案中使用的一般设置。- 打开中央控制台，然后打开倒置荧光显微镜。
- 打开将用于采集的软件并选择 延时拍摄 选项
- 将一个35 mm培养皿样品台放置在显微镜载物台上。
- 将物镜设置为 x20.
- 使用 自动对焦 尽可能获得清晰的图像。如果难以找到单个细胞，可先从4x物镜开始，再切换至20x物镜。若显微镜不具备自动对焦功能，需手动调节焦距。
注意：若需要更显著的细胞形态学细节，可使用40倍放大。 - 调整以下设置以获得最佳的数据采集效果： 自动亮度 （曝光） 激发波长, 黑平衡 （以降低背景噪声） 自动聚焦.
- 在找到多个细胞质发出荧光的视野区域后，以每30秒一次的频率进行延时成像，持续采集数据20分钟。
- 点击 开始 开始读取。
- 运行3分钟以采集基线数据。采集3分钟捕获数据后，立即向相应孔中轻柔加入50 µL药物。药物加入后，培养皿中的终浓度为10 µM forskolin和10 nM isoproterenol。
注意：必须小心添加药物；移液器吸头不得接触培养板，以免移动已设定的视野，导致样本无法被分析。 - 继续实验，再运行17分钟，每30秒采集一次数据。
- 测试完成后，确保数据已准备好进行分析。
注意：尽管当前方案未包含对焦漂移的对照，但在实验中加入此类对照可能具有益处。例如，使用细胞核染料有助于在显微镜分析过程中管理对焦漂移，尤其是在长时间捕获活细胞图像时。cADDis生物传感器通常在细胞内广泛分布，因此采用较宽的焦平面进行成像效果最佳，从而减少对控制对焦漂移的需求。9.
- 分析数据
注意：每台显微镜配套的软件可能不同，因此此处描述的是分析所采集图像时应使用的一般设置。- 打开实验过程中采集的图像文件。
- 使用 多边形 或 圆形 用于选择每个细胞的感兴趣区域以进行分析。分析应提供每个细胞在每个时间点的亮度值。
注意：最佳操作是选择单个细胞，避免选择接触培养皿壁或其他细胞的细胞，以确保获得最佳的数据采集效果。每种条件下至少选择5个细胞进行分析，并至少重复实验三次。 - 分析数据后，将数据导入 Excel 表格，从添加药剂或溶剂前的那张图片开始，计算每种条件下每张照片的平均亮度。在此示例中，为第 3 分钟或第 6 分钟th 显微镜下拍摄的照片，因为每张图像每隔30秒拍摄一次。
- 计算 ΔF/F0 每种条件下的每个平均值。
- 载入统计分析软件并绘制 ΔF/F 图像0 随时间（秒）的变化
注意： 图1 提供了各实验方案主要步骤的示意图概览。
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结果
本研究通过酶标仪和显微镜检测验证了胞质生物传感器的功能。细胞表达生物传感器后，分别用10 µM佛司可林（腺苷酸环化酶的直接激活剂）、10 nM异丙肾上腺素（ß1AR和ß2AR的激动剂）或溶剂对照处理（图1）。每30秒采集一次荧光变化，以反映cAMP的生成情况。
数据被转换为初始荧光值的荧光变化量（ΔF/F）0). 采用单一位点衰减模型对荧光数据进行拟合，以量化不同条件下cAMP水平的时间变化图2 和 图3）。这些衰减曲线的参数可用于量化药物在特定浓度下的反应。采用衰减速率（k）与平台值的乘积作为量化药物反应的单一指标，并在施加同一药物的多个浓度时，利用该指标绘制浓度-反应曲线。13.
在酶标仪上，用10 ...
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讨论
准确且灵敏地测量cAMP对于理解其在多种细胞过程中的作用以及研究cAMP依赖性信号通路的活性至关重要。目前常用的cAMP检测方法包括ELISA、放射免疫分析法、FRET生物传感器和GloSensor cAMP检测法14,15,16,17,18。每种cAMP检测方法都有其优势与局限性。本方案可实现对活细胞内cAMP动态变化的实时检测与监测，时间范围从数分钟至数小时，并且无需添加磷酸二酯酶抑制剂即可完成测量。这一点对于致力于研究磷酸二酯酶亚型在调控cAMP信号中作用的研究人员尤为关键19。该生物传感器已有商业化产品（见材料表），提供多种版本：一种绿色荧光蛋白在结合cAMP后荧光强度降低，一种红色荧光蛋白在结合cAMP后荧光增强，以及一种绿...
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披露
作者无竞争性财务利益。
致谢
本研究由国家心肺血液研究所（NHLBI）（HL169522）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96孔板（透明） | Fisherbrand | 21-377-203 | |
| 35 mm 培养皿 | Greiner Bio-One | 627870 | 带玻璃底的细胞培养皿 |
| 96孔板 | Corning | 3904 | 黑色，带透明平底 |
| 抗生素-抗真菌素（100倍浓度） | Gibco | 15240062 | 用于HEK和HASM培养基 |
| BZ-X荧光显微镜 | Keyence | ||
| 氯化钙（IM） | Quality Biological Inc | E506 | 用于HASM培养基 |
| 离心管（15 mL） | Thermo Scientific | 339651 | |
| DMEM（1倍浓度） | Gibco | 11965092 | HEK培养基 |
| 含Mg2+和Ca2+ 的DPBS | Gibco | 14040-133 | |
| 不含Mg2+和Ca2+的DPBS | Corning | 14040-133 | |
| 胎牛血清（FBS） | R&D systems | S11195 | 用于HEK和HASM培养基 |
| 福斯科林（Forskolin） | Millipore | 344270 | 药物 |
| Green Down cADDis cAMP检测试剂盒 | Montana Molecular | #D0200G | 试剂 |
| Ham's F-12K | Gibco | 21127022 | 用于HASM培养基 |
| HEPES（1 M） | Gibco | 15630080 | 用于HASM培养基 |
| 异丙肾上腺素（Isoproterenol） | Sigma | I6504 | 药物 |
| L-谷氨酰胺（200 mM，100倍浓度） | Gibco | 25030-081 | 用于HASM培养基 |
| 微量离心管（2 mL） | Eppendorf | 22363352 | |
| Primocin | Invitrogen | ant-pm-1 | 用于HASM培养基的抗生素 |
| RNA酶清除剂（RNAse away） | Thermo Scientific | 700511 | 试剂 |
| 氢氧化钠溶液 | Sigma | S2770 | 用于HASM培养基 |
| SpectraMax M5酶标仪 | Molecular Devices | ||
| 曲古抑菌素A（Trichostatin A） | TCI America | T2477 | 试剂 |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200-056 | 试剂 |
参考文献
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