本研究展示了一种改进的单纤维肌电图（SFEMG）方案，用于在啮齿类动物模型中实现神经肌肉接头（NMJ）传递功能的体内测量。文中详细描述了SFEMG技术的逐步操作流程，以实现对大鼠腓肠肌中神经肌肉接头传递变异性和传递失败的定量评估。
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摘要
摘要
作为神经系统与肌肉之间的最终连接，神经肌肉接头（NMJ）处的信号传递对正常的运动功能至关重要。单纤维肌电图（SFEMG）是一种在临床上具有相关性且敏感的技术，通过测量单个肌纤维在自主收缩或神经刺激期间的动作电位反应，来评估NMJ的传递功能。对NMJ传递功能的评估与量化涉及两个参数：抖动（jitter）和阻滞（blocking）。抖动是指连续单纤维动作电位（SFAPs）之间在时间（潜伏期）上的变异性。阻滞则指NMJ传递失败，未能引发SFAP反应。尽管SFEMG在临床环境中是一项成熟且敏感的检测方法，但其在临床前研究中的应用相对较少。本报告概述了在啮齿类动物模型中进行刺激式SFEMG以量化抖动和阻滞所采用的操作步骤与判断标准。该技术可用于临床前和临床研究，以深入了解健康、衰老及疾病状态下的NMJ功能。
引言
单纤维肌电图（SFEMG）最初由 Stålberg 和 Ekstedt 在 20 世纪 60 年代开发，用于识别和分析单个肌纤维的动作电位，主要用于研究肌肉疲劳1。SFEMG 是评估神经肌肉接头（NMJ）传递功能最敏感的临床技术2。该技术通过选择性记录单纤维动作电位（SFAPs）来实现3。神经肌肉接头的传递功能可能因衰老4,5以及多种神经肌肉疾病（如重症肌无力和肌萎缩侧索硬化症）而受损6。此外，缺血、温度波动以及使用神经肌肉阻滞剂等情况也可能导致神经肌肉接头传递功能缺陷，表现为神经肌肉接头传递变异性的增加和传递失败的发生2。
记录单纤维肌电图（SFEMG）有两种方法：刺激法和自主收缩法。自主收缩SFEMG是在受试者主动收缩肌肉时，将同心针电极插入待测肌肉，记录来自同一运动轴突支配的两个神经肌肉接头（NMJ）的单纤维动作电位（SFAP）7。因此，自主收缩SFEMG需要受试者的配合，且仅能评估低阈值运动单位（即在弱收缩期间被激活的运动单位）3。刺激法SFEMG则通过一对刺激电极刺激运动轴突，同时使用插入待测肌肉的SFEMG针电极记录SFAP7。
在自发性和刺激性单纤维肌电图（SFEMG）中，抖动（jitter）和阻滞（blocking）是用于评估和量化神经肌肉接头（NMJ）传导功能的两个参数8。抖动描述的是连续单纤维动作电位（SFAP）之间在时间（潜伏期）上的变异性。在自发性SFEMG中，通过分析同一运动轴突支配的一对SFAP在连续50至100次放电中的潜伏期差异来量化抖动；在刺激性SFEMG中，则通过分析刺激时刻与SFAP起始之间在连续50至100次放电中的潜伏期差异来量化抖动。阻滞表示神经肌肉接头传导失败，未能引发SFAP反应，其可表现为在自发性SFEMG中每一对SFAP的缺失，或在刺激性SFEMG中每个神经肌肉接头处的反应缺失，可通过存在或缺失情况进行量化2,7。
尽管单纤维肌电图（SFEMG）在临床环境中是一种成熟且敏感的检测方法，但在临床前研究中却很少被应用4,5,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18。在本报告中，我们概述了在临床前啮齿类动物模型中进行和分析SFEMG记录的方法。此外，我们展示了代表性数据，这些数据突出了SFEMG上的典型发现，表明在给予非去极化型神经肌肉阻滞剂罗库溴铵后，神经肌肉接头（NMJ）传递功能出现障碍。
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方案
所有实验方案均经密苏里大学机构动物照护与使用委员会批准，并严格遵守其规定执行。
1. 动物准备与麻醉给药
- 穿戴适当的个人防护装备。
- 在操作前，测量大鼠体重，以确定基于体重的药物剂量和呼吸机参数设置。
- 使用 3%–5% 吸入式异氟烷诱导麻醉。一旦达到足够的麻醉深度，将大鼠置于俯卧位，并以 1%–3% 吸入式异氟烷维持麻醉。
- 用镊子轻压后肢足垫，观察是否出现回缩反应，以确认麻醉深度是否充分。
- 将体温维持在 37 °C。
- 在眼睛上涂抹兽医认可的石油基眼膏，防止干燥。通过观察呼吸频率以及使用镊子按压足垫时是否存在回缩反应，监测麻醉深度。
- 使用剪毛器剃除待评估后肢的毛发。在充分去毛后，使用胶带固定肢体，使踝关节处于约 90° 背屈位，膝关节伸展，髋关节外展。
- 在整个实验过程中持续监测大鼠的呼吸和心率。
注意：心率升高通常作为麻醉深度不足的指标。 - 给予 5% 或更高浓度的异氟烷实施安乐死，直至呼吸停止至少 3 分钟。通过断头法确认动物死亡。
2. 电极放置与设置
注意：使用肌电图（EMG）系统评估坐骨神经与腓肠肌的神经肌肉接头（NMJ）传递功能。参见材料表。
- 将一对带绝缘层的28 G单极针插入近端后肢区域以刺激坐骨神经，阴极置于近端后肢区域，阳极则置于覆盖骶骨的皮下组织更近端的位置。
- 确保刺激电极不要紧邻坐骨神经或插入过深，以避免对坐骨神经或其他邻近结构造成直接损伤。
- 将一次性接地电极置于对侧后肢或尾部。
- 小心地将一根专为单纤维肌电图（EMG）设计的27号、25 mm针电极插入右侧腓肠肌，该电极的记录表面由铂铱合金材料制成。确保每次使用前对单纤维肌电图（SFEMG）电极进行高压灭菌，以维持无菌状态。
- 将单纤维肌电图（SFEMG）针电极与腓肠肌肌纤维平行插入，以记录单纤维动作电位（SFAPs）。
- 在插入和操作单纤维肌电图（SFEMG）针电极时，应避免造成肌肉损伤。
3. 刺激单纤维肌电图（SFEMG）操作步骤
- 使用 0.3–10 mA 的刺激强度范围、0.1 ms 的脉冲持续时间，以 10 Hz 的频率对右侧坐骨神经施加恒定电流刺激。
- 将滤波器设置为低频滤波器 1 kHz、高频滤波器 10 kHz。调节增益至每格 200 µV 至 1000 µV，以便清晰显示电位。将扫描速度设为每格 500 µs。
- 调节刺激强度，以诱发并分离单纤维动作电位（SFAP），用于记录和后续分析。
- 为识别和分析一个反应是否为 SFAP，需满足以下特定标准：从基线峰值到负相的上升时间应小于 500 µs，最小幅度（基线峰值至负相）至少为 200 µV，且反应在多次刺激中表现出“全或无”行为（即反应的大小和形态保持稳定）。
注意：重复出现的反应必须具有稳定上升相，不得出现切迹或拐点。最后这一标准对于区分高质量信号与多个信号叠加至关重要。
- 为识别和分析一个反应是否为 SFAP，需满足以下特定标准：从基线峰值到负相的上升时间应小于 500 µs，最小幅度（基线峰值至负相）至少为 200 µV，且反应在多次刺激中表现出“全或无”行为（即反应的大小和形态保持稳定）。
- 在至少 50 次（50–100 次）刺激后，计算抖动（Jitter），即连续放电之间 SFAP 潜伏期（刺激与 SFAP 负相上升相之间的时间）的变异性，并评估和量化阻滞情况。
注意：阻滞可评估为每个突触处是否存在反应失败，或表示为未能引发单纤维动作电位的刺激所占百分比。抖动通过以下公式7计算（临床肌电图系统通常可自动计算抖动）：
MCD = 连续差值的平均值
IPI = 峰间间期 - 对其他 SFAP 反应重复上述过程。每只动物平均评估 10 个突触，计算抖动，并进一步确定每只动物的平均值。
- 在分析中排除抖动小于 4 µs 的 SFAP，以避免将可能由直接肌肉刺激诱发的电位纳入分析11。
- 当记录到显示间歇性阻滞的电位时，应增加刺激强度，以确认 SFAP 的缺失并非由次最大刺激所致。
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结果
为了展示在神经肌肉接头（NMJ）传递失败背景下抖动（jitter）增加和阻滞现象，进行了单纤维肌电图（SFEMG）刺激实验，分别在静脉给予罗库溴铵前后进行。罗库溴铵是一种中效、非去极化型神经肌肉阻滞剂，广泛用于临床手术或医疗操作中以诱导肌肉麻痹。其作用机制是通过竞争性结合于NMJ处的烟碱型乙酰胆碱受体19。在给予罗库溴铵前，成年野生型大鼠（Sprague Dawley）已按第1节所述方法完成准备并实施麻醉。由于罗库溴铵会引起麻痹，因此采用侵入性通气支持以获取代表性数据（与上述第1节中SFEMG记录期间通常使用的麻醉方法形成对比）。插入气管插管后，采用压力控制模式进行通气，呼吸频率维持在60次/分钟，压力设定为17 mmHg，呼气末正压为3 cm H2O，同时输送2%–3%异氟烷。在通气支持和麻醉状态稳定后，分别在给予罗库溴铵（静脉推注0.05 mg/kg罗库溴铵溴化物）前后记录单纤维动作电位。图1展示了来自成年大鼠同一NMJ的三个典型单纤维动作电位记录。图1A
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讨论
单纤维肌电图（SFEMG）常用于疑似自身免疫性、获得性及遗传性神经肌肉接头（NMJ）疾病患者的诊断检测。SFEMG被认为是诊断NMJ功能障碍（如重症肌无力）最敏感的检测方法20,21。重复神经刺激（RNS）是另一种在临床诊断中更常用的方法，该方法通过一连串电刺激刺激周围神经，并量化所支配肌肉的复合肌肉动作电位总和反应5,22。与SFEMG相比，RNS的敏感性始终显著较低23,24。SFEMG的优势在于能够选择性地评估单个肌纤维，并不仅可量化NMJ传递失败（阻滞），还可量化传递变异度（抖动）2,25,26。...
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披露
W. David Arnold 获得了 NMD Pharma 和 Avidity Biosciences 的研究资助，并为 NMD Pharma、Avidity Biosciences、Dyne Therapeutics、Novartis、Design Therapeutics 和 Catalyst Pharmaceuticals 提供咨询服务。
致谢
作者感谢 Stony Brook University 生物医学工程系的 Arash Karimi 在计算方面的协助，以及 NMD Pharma 的 Martin Brandhøj Skov 博士在罗库溴铵剂量方面的宝贵建议。本研究部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 WDA（R01AG067758 和 R01AG078129）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 27 G 可重复使用单纤维针电极 | Technomed | 202860-000 | 单纤维记录电极 |
| 2 mL 玻璃注射器 | Kent Scientific Corporation | SOMNO-2ML | |
| 可拆卸电缆 | Technomed | 202845-0000 | 用于连接记录电极与电诊断仪器 |
| 一次性 2" x 2" 带导线盘状电极 | Cadwell | 302290-000 | 接地电极 |
| 一次性 28 G 单极针电极 | Technomed | 202270-000 | 阴极和阳极刺激电极 |
| EMG 针电缆（放大器/刺激切换盒） | Cadwell | 190266-200 | 用于将单极电极连接至电诊断刺激器 |
| 带铁底座的“Helping Hands”鳄鱼夹 | Radio Shack | 64-079 | 用于固定记录电极位置 |
| 异氟烷（250 mL 瓶装） | Piramal Healthcare | NA | |
| Monojec 曲头冲洗注射器 | Covidien | 81412012 | 用于涂抹电极凝胶 |
| PhysioSuite 生理监测系统，配备 RightTemp 恒温加热装置 | Kent Scientific Corporation | PS-RT | 包含红外加热垫、直肠探头和垫面温度探头 |
| Oster Pro 修剪器宠物美容套装 | Oster | 078577-010-003 | 用于毛发去除的剪毛器 |
| 大鼠气管插管（16 G） | Kent Scientific Corporation | ||
| 罗库溴铵溴化物 | Sigma | PHR2397-500MG | 神经肌肉阻滞剂 |
| Sierra Summit EMG 系统 | Cadwell Industries, Inc., Kennewick, WA | NA | 便携式电诊断系统 |
| SomnoSuite 低流量数字麻醉系统 | Kent Scientific Corporation | SOMNO | 包含防溢、防蒸气瓶顶适配器；Y 型连接管；活性炭吸附过滤器 |
| 兽用石油基眼用软膏 | Puralube | 26870 | 麻醉期间使用以避免角膜损伤 |
参考文献
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