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方法文章

基于GEO数据集与网络药理学探讨湿毒膏治疗肛周湿疹的疗效及潜在作用通路机制

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DOI：

10.3791/66453

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2024年1月12日

 ,  ,  ,  , 
1Department of General Surgery, Tianjin Medical University General Hospital, 2Tianjin General Surgery Institute, 3Department of General Surgery, Zibo Municipal Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究旨在通过网络药理学与基因表达综合数据库（GEO）数据的协同整合，阐明外用药物给药的作用机制。本文评估了湿毒膏（SDG）治疗肛门湿疹的可行性、作用靶点及作用机制。

摘要

肛周湿疹是一种影响肛门周围区域的慢性复发性炎症性皮肤病。虽然病变主要发生在肛门及肛周皮肤，但也可能累及会阴或生殖器区域。研究发现，湿毒膏（SDG）对缓解肛门瘙痒、控制渗出、减少潮湿以及促进皮肤修复具有显著疗效。然而，湿毒膏在肛周湿疹中的基因靶点及其药理作用机制尚未得到系统阐明和深入探讨。因此，本研究采用网络药理学方法，并结合基因表达综合数据库（GEO）数据集分析相关基因靶点。此外，构建了蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI），在“药物-靶点-疾病”相互作用网络中最终确定了149个靶点，其中59个被认定为核心基因。

通过使用京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因本体（GO）分析，评估了SDG在治疗肛周湿疹中的基因功能。随后，采用分子对接方法验证了网络药理学分析所识别的SDG抗肛周湿疹作用及其潜在通路。SDG靶向基因和蛋白质在治疗肛门湿疹过程中主要涉及的生物学过程包括细胞因子介导的反应、炎症反应以及对脂多糖的反应等。通路富集和功能注释分析结果表明，SDG通过调控志贺菌病（Shigellosis）和单纯疱疹病毒1型感染通路，在预防和管理肛周湿疹中发挥关键作用。网络药理学与GEO数据库分析证实，SDG在治疗肛周湿疹中具有多靶点特性，特别是通过调控TNF、MAPK14和CASP3等关键枢纽靶点，这些靶点在TNF和MAPK信号通路中至关重要。这些发现为深入研究SDG治疗肛周湿疹的作用机制提供了明确方向，同时凸显了其作为该难治性疾病有效治疗策略的潜力。

引言

肛周湿疹是一种影响肛周区域及黏膜的过敏性皮肤病，具有多种临床表现1。其典型症状包括肛门红斑、丘疹、水疱、糜烂、渗出及结痂。这些症状大多由患处搔抓、皮肤增厚及粗糙引起2。

肛门湿疹病程较长，易反复发作，治疗困难，可能对患者的身心健康产生不良影响3。肛门湿疹的发病机制尚不明确，现代医学认为可能与局部肛门病变、饮食、环境、遗传及其他因素有关4。除避免接触刺激物和潜在过敏原外，肛门湿疹的治疗主要集中在抑制炎症、抗过敏和止痒等方法上5。

SDG 已被广泛用于治疗肛门湿疹及其他肛门疾病。SDG 可调节肛门皮肤渗出，减少潮湿，修复肛门皮肤，并有效缓解瘙痒6,7,8。此外，SDG 还可能通过调节肛周微生物群，从而改善肛门湿疹9,10。

网络药理学是一门新颖的、跨学科的前沿生物信息学方法，属于人工智能与大数据领域的研究范畴，为深入探索中医药提供了新的途径。该学科强调从生态网络的视角，系统阐述药物与疾病之间的分子关联规律。目前已被广泛应用于多个方面，包括鉴定中药提取物中的关键活性成分、解析其整体作用机制、设计药物组合以及研究方剂配伍规律等。传统中药方剂具有多组分、多靶点的特性，显示出其与网络药理学领域高度契合的优势。在该方法的推动下，复杂中医药体系的研究获得了全新的视角，为临床应用的合理化和药物创新提供了强有力的技术支持11,12,13,14。

本研究旨在探讨SDG治疗肛周湿疹的作用机制。该研究通过网络药理学与GEO数据集的协同整合，系统阐明了外用药物作用机制。研究结果为SDG在肛周湿疹管理中的疗效及其潜在机制提供了有价值的见解，表明其在该疾病治疗中具有良好的应用前景。本研究的详细工作流程图见图1。

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方案

本研究未涉及伦理审批及参与同意。本研究使用的数据来自基因数据库。

1. 疾病靶点的预测

  1. 访问 GeneCards 数据库（https://www.genecards.org）和在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM，https://www.omim.org），使用"肛门湿疹"作为搜索词查找疾病靶点。
  2. 下载疾病靶点的电子表格，删除重复的靶点，获得肛门湿疹相关靶点。

2. 活性组分的筛选

  1. 搜索关键词 "青黛、金松、煅石膏、炉甘石、五倍子" 在传统中医药系统药理学数据库（TCMSP； http://tcmspw.com/tcmsp.php）获取 SDG 候选活性成分及其作用靶点列表。
  2. 将该组分提交至瑞士ADME数据库（http://www.swissadme.ch/index.php），提取表现出相关特性的详细信息 "高" 胃肠道吸收，结合至少两种 "是" DL值作为活性元素。
    注意：通常，数据库中仅包含类药性（DL）值 ≥0.18 的成分作为活性成分。

3. 蛋白质相互作用网络的构建及核心蛋白的筛选

  1. 在 Venny2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）中，将 SDG 和肛门湿疹的作用靶点分别输入至 LIST1 和 LIST2。系统将立即生成交集的可视化图谱。点击共享区域，可在 结果部分查看共同靶点。
  2. 访问 STRING 数据库（https://string-db.org/），将靶点列表输入至 名称列表字段中。随后选择Homo sapiens作为物种，并点击搜索 > 继续。
  3. 结果返回后，打开高级设置，选择“在网络中隐藏未连接的节点”。在最低必需相互作用评分中，设置为最高置信度（0.900），然后点击更新。
  4. 点击导出，以 .png 和 .tsv 格式下载蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的文本文件。

4. 构建药物-成分-疾病-靶点网络

  1. 打开 Cytoscape 3.9.1，导入步骤 3.4 中提到的 .tsv 文件。在控制面板中点击 Style 栏，以优化网络节点的颜色、字体和大小。
  2. 进行网络拓扑分析时，使用 Analyze Network 功能。为获取枢纽基因，在 Cytoscape 软件中使用 CytoHubba。构建药物-成分-疾病-靶点网络。

5. GO 与 KEGG 富集分析

  1. 访问 Metascape 网站（https://metascape.org/）。选择一个文件或将基因列表粘贴到对话框中，然后点击 Submit 按钮。随后在Input as Species和Analysis as Species中均选择H. sapiens；之后启用Custom Analysis功能。
  2. 在富集分析选项中，选择GO 分子功能、GO 生物过程、GO 细胞组分以及KEGG 通路数据库。勾选选择性 GO 聚类，然后点击Enrichment Analysis按钮。当进度条完成后，点击生成Analysis Report Page以获取富集分析结果。

6. GEO 基因芯片数据集分析

  1. 使用 GEO2R 工具（https://ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）搜索并分析 GEO 基因芯片数据集（GDS3806），以研究不同数据组中核心基因的表达情况（对照组：非特应性皮炎；实验组：特应性皮炎）。
  2. 进入 GEO 数据库网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），输入关键词或 GEO 登录号，然后点击 搜索按钮。选择最匹配的结果，找到参考系列（GSE26952）。
  3. 进入 GEO2R 工具网站（https://ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/），在 GEO 登录号输入框中输入参考系列，然后点击设置按钮。选择特应性皮炎作为实验组，选择非特应性对照作为对照组，然后点击分析按钮。计算完成后，结果将显示出来。

7. 分子对接

  1. 打开TCMSP数据库，下载所选成分的3D结构。使用 化学名称 在搜索框中输入所选成分名称，以下载对应的 mol2 格式 3D 结构文件。
  2. 打开 RCSB 蛋白质数据库（http://www.pdb.org/），下载关键靶标的晶体结构。在搜索框中输入靶标名称，查找并下载相应的 pdb 格式晶体结构文件。
  3. 将原料和目标结构文件导入分析软件。通过点击删除水分子 编辑 > 删除水. 通过点击添加氢原子 编辑 > 氢原子 > 添加将组分设为配体，选择整个靶标作为受体，进行盲对接。
  4. 确定分子对接的范围。
    1. 依次选择受体和配体。单击 网格 > 网格盒 调整网格框以包含整个模型。单击 文件 > 关闭 保存当前设置以保存网格框状态。以 gpf 格式保存文件。
    2. 点击 运行 > 运行 Autogrid4 > 参数文件名 > 浏览，选择 gpf 文件，然后单击 启动 按钮。
  5. 使用 AutoDock 4 进行分子对接。
    1. 点击 对接 > 大分子 > 设置刚性文件名 选择受体。单击 分子对接 > 配体 > 打开/选择 选择配体。
    2. 点击 对接 > 搜索参数 设置操作算法并 分子对接 > 对接参数 设置对接参数。选择 dpf 文件，然后点击启动按钮。以 dpf 格式保存文件。
    3. 点击 分析 > 对接 > 开放，选择 dlg 文件，点击 分析 > 大分子 要打开受体，请单击 分析 > 构象 > 播放, 按能量排序 分析结果。点击 设置播放 > 撰写复杂内容 以 pdbqt 格式保存结果。
  6. 将对接文件导入 PyMOL 软件以构建进一步的可视化图像。
    1. 选择配体， 和 点击 动作 > 查找 > 极性接触 > 物体中其他原子 以显示配体与外部环境之间的氢键。点击 c 以更改颜色。
    2. 点击 动作 > 提取对象. 点击 显示 > 棍棒 展示受体的棍状结构。鉴定与配体相连的残基，并显示其棍状结构。
    3. 点击 隐藏 > 棍棒 以隐藏受体的棍状结构。单击 向导 > 测量 并依次点击两个原子。点击 标记 > 残基 以显示残基的标签。如有需要，调整背景颜色和透明度。点击 文件 > 导出图像为 保存图片。

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结果

肛门湿疹相关基因、SDG 靶基因及共同靶点
在 Genecards 数据库中筛选出 958 个潜在基因候选，在 OMIM 数据库中筛选出 634 个，排除重复项后。为全面了解肛门湿疹相关基因，整合多个数据库的结果，共获得 958 个不同的基因。据此，精心构建了针对肛门湿疹的蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI）。SDG 由五味中药组成，分别为青黛、黄柏、煅石膏、炉甘石和五倍子15,16。其中，煅石膏的主要成分为无水硫酸钙（CaSO4），炉甘石的主要成分为碳酸锌（ZnCO3）。青黛、黄柏和五倍子成分较为复杂。通过 TCMSP 数据库查询，这些药物共含有 92 种化合物成分，获得 867 个可靠的药物作用靶点（表 1）。

通过叠加两个目标基因数据集，共确定了149个频繁共现的目标基因（图2A），...

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讨论

特应性皮炎是一种与湿疹具有共同潜在机制的特定类型湿疹。被认为与此疾病相关的枢纽基因包括TNF、MAPK14和CASP3。SDG对肛周湿疹的治疗作用主要归因于其通过这三个枢纽基因作用于TNF和MAPK信号通路17。

SDG 包含五种不同的药物：青黛、黄柏、煅石膏、炉甘石和五倍子。在中医理论中，煅石膏和炉甘石具有促进伤口愈合和燥湿的作用，而青黛、黄柏和五倍子则具有清热、解毒、燥湿的功效。这些药材配伍使用，可达到祛湿、促进伤口愈合、清热和祛风的效果18。

既往研究表明，SDG的主要成分具有抗炎特性。靛玉红（IN）已被证实可用于治疗结肠炎、银屑病和急性早幼粒细胞白血病19,20,21。IN的作用机制可能与其抑制TLR4/MyD88/NF-kB信号转导通路有...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AutoDockToolsAutoDockhttps://autodocksuite.scripps.edu/adt/
Cytoscape 3.9.1 Cytoscapehttps://cytoscape.org/
GeneCards 数据库 GeneCardshttps://www.genecards.org
GEO 数据库美国国家生物技术信息中心https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
GEO2R 工具 美国国家生物技术信息中心https://ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/
MetascapeMetascapehttps://metascape.org/
人类孟德尔遗传在线数据库OMIMhttps://www.omim.org
RCSB 蛋白质数据库 RCSB 蛋白质数据库 (RCSB PDB)http://www.pdb.org/
STRING 数据库 STRINGhttps://string-db.org/
Swiss ADME 数据库 瑞士生物信息学研究所http://www.swissadme.ch/index.php
中药系统药理学数据库 (TCMSP)中药系统药理学数据库与分析平台http://tcmspw.com/tcmsp.php
Venny 2.1BioinfoGPhttps://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html

参考文献

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