半自动 8 臂径向迷宫中小鼠的食欲空间工作记忆任务，减少迷宫中的恐惧记忆联想

工作记忆¹ 是一种认知过程，可以在短时间内保存有限数量的信息，同时将其纵和用于计划和执行心理任务，例如记住电话号码或从不同位置前往目的地的路线。它与流体智力密切相关，流体智力是快速推理和抽象思考的能力。人们认为工作记忆训练可以提高流体智力².因此，工作记忆对于研究至关重要。

最流行的啮齿动物行为实验最初是在 1980 年代为大鼠设计的，今天的研究人员经常将这些协议应用于小鼠。然而，大鼠和小鼠之间存在一致的行为差异 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 .特别是，恐惧管理是影响实验结果的重要因素，因为与大鼠相比，小鼠更容易承受压力 3,4,5,6,7,10,11,12,13,14,15,16,17，^18,19.因此，在将这些方案应用于小鼠时，重要的是要考虑差异。在我们的协议中，我们试图在桡臂迷宫中的工作记忆任务中尽量减少压力因素。这是通过使用鼠标跟踪和迷宫控制软件仔细计时关门来完成的。此外，避免了在中心枢纽的会话结束时捕捉老鼠。这种方法允许小鼠选择它们的下一只手臂，而不会将位置与害怕被抓住联系起来。将捕获老鼠推迟到迷宫中收集完所有奖励后，可以确保最后的奖励与被捕获的经历无关。

陆地桡臂迷宫 （RAM） 是一种流行且常用的设备，用于评估空间和非空间学习和记忆，以及测试啮齿动物的工作和参考记忆。它是小鼠空间学习和记忆中最受欢迎的设备之一 20,21,22。RAM 利用啮齿动物除了觅食之外，还探索迷宫、发现新奇事物并反复试验学习空间信息的自然倾向。这种倾向可以通过限制他们的饮食并在迷宫中奖励他们喜欢的食物来增强。现在，RAM装置的几种变体被使用，例如，具有6、8、12或16臂和部分封闭或开放/升高的装置23,24,25。当今大多数协议都基于 Olton 等人的协议^20,26，^但使用更简单的（6 或 8 臂）迷宫 ^{9,24,27,28,29}。在径向手臂迷宫（6 或 8 只手臂）中测试工作记忆比 T 型迷宫（2 只手臂）更强大，因为动物有更多的手臂可供选择进行探索。

最初的RAM由Olton和Samuelson²⁰设计，用于评估使用食物诱饵进行正强化的大鼠的空间学习和记忆，这与使用负强化的莫里斯水迷宫和8臂径向水迷宫等水迷宫不同，即水浸20,30,31,32。Olton 和 Samuelson²⁰发现，老鼠在通过 RAM 时对地方有很好的记忆力。他们表明海马体参与空间信息处理。因此，他们在啮齿动物中引入了双记忆系统的概念，包括工作记忆和参考记忆。这种双记忆系统之前曾由 Honig³⁶ 根据鸽子实验提出。Olton等人发现海马体功能对于工作记忆至关重要。这是通过在内嗅区域、菌毛穹窿体、海马体、隔膜或连合后穹窿前方制造病变来实现的，以破坏海马结构 26,33,34,35 的每个主要外在纤维连接。穹窿-菌毛病变不影响参考记忆²⁶。

在现代协议中，动物习惯于环境，让它们连续3天每天自由探索迷宫10-15分钟，然后进行为期1-3周的迷宫训练，在所有手臂或固定选定的手臂末端使用首选食物，测试工作记忆，或工作记忆和同一实验中的参考记忆， 分别为^9、29、37。

通常，这些方案没有得到充分描述，并且没有充分考虑大鼠和小鼠之间的行为差异。在这里，我们详细介绍了我们的协议和经验，特别是如何避免根据大鼠和小鼠之间的恐惧管理差异将恐惧体验与地点和时间联系起来。该协议适用于想要研究空间工作记忆并将其应用于使用小鼠的电生理学、实时成像和组织学的研究人员。

所有小鼠实验均已获得伦敦大学学院伦理委员会的预先批准，并根据 1986 年《动物（科学程序）法》和英国政府随后的立法获得授权。

1. 在软件应用程序上准备自动迷宫控制程序

注意：使用了自动径向臂迷宫，如图 1A-C 所示，以及图 1D 中的房间布局。

1. 准备关门实验工作流程，如 图 2 所示。
2. 在软件应用程序上设置习惯阶段 1（图 2A）的开始。为此，请按照以下步骤作。
   1. 设置试用和视频录制的开始时间，并关闭软件上的所有手臂。软件识别出迷宫中央集线器中的鼠标后 5 秒，它开始跟踪并打开所有门。
   2. 当鼠标进入手臂内并且距离中央轮毂门最近的门 4 厘米时，关闭所有门。然后，在关闭所有门后，立即打开鼠标选择的手臂门。
   3. 鼠标返回中央集线器后，关闭门并将其限制在中央集线器上 5 秒。重复此作 30 分钟。
   4. 30分钟后停止视频录制和跟踪，鼠标返回中央集线器。
      注意：让老鼠随心所欲地自由探索迷宫。
3. 习惯阶段 2（图 2B）
   1. 在相关软件中设置试用和视频录制的开始时间，然后关闭所有门。
   2. 软件识别出迷宫中央枢纽中的鼠标后 5 秒，开始跟踪并打开所有门。
   3. 如果小鼠至少两次或在 30 分钟后进入每只手臂，然后返回中央集线器，则结束试验。让鼠标随心所欲地自由探索迷宫。
4. 习惯阶段 3（图 2C）
   注意：此阶段是第 1 阶段和第 2 阶段的组合。
   1. 设置软件开始试用和视频录制并关闭所有门。
   2. 设置软件在软件识别出中央集线器中的鼠标后5秒控制迷宫门。此时设置跟踪的开始并打开所有门。
   3. 当鼠标进入臂内并且距离中央轮毂门最近的门 4 厘米时，关闭所有门。然后打开手臂的门。
   4. 当鼠标完全进入中央集线器时，关闭门，并将鼠标限制在中央集线器中 3 秒。重复此序列30分钟或直到鼠标至少进入每只手臂一次。
   5. 在满足条件后，以及鼠标完全进入中央集线器时设置试用结束时间。
      注意：让鼠标随心所欲地自由探索迷宫。
5. 工作记忆任务（图 2D、E）
   1. 设置软件开始试用和录制，并关闭所有门。
   2. 软件识别出中央集线器中的鼠标后5秒，设置软件开始跟踪。
   3. 启动强制运行阶段。将伪随机选择的 4 只手臂一一呈现给小鼠。
   4. 当鼠标进入第一个臂并距离中央轮毂 3 厘米时，确保门关闭并将其限制在臂中 15 秒。
   5. 让门打开，让鼠标回到中央集线器。
   6. 关上门，然后打开第二臂。
   7. 重复此作，直到第四只手臂。
   8. 当鼠标在强制运行阶段的第四个臂后返回中央集线器时，将其限制在中央集线器上 5 秒。
   9. 让所有的门打开并开始自由运行阶段。
   10. 当鼠标在收集所有奖励/至少进入所有武器一次后返回中央集线器时结束试炼。

2. 为个人住房准备家庭笼子

1. 使用标准套料为新实验设置新笼子。
   1. 为每只小鼠放入新的垫料、锯末、纸冰屋、纸隧道、纸筑巢条纹和木咬块放入新笼子中进行实验。
   2. 放置食物料斗并盖上盖子。
      注意： 如果老鼠没有食物料斗，它们可能会损坏通风部件。

3. 动物收容室的处理、称重和饮食限制（第 -7 天至第 0 天）

1. 用手轻轻地将鼠标引导至家庭笼中提供的纸质隧道。
2. 用手使用纸隧道 38,39,40 将鼠标从分组笼子中提起，将其保持在胸部高度几秒钟。或者，让鼠标自愿爬到手上。
   注意：以最小的压力处理动物对于行为实验至关重要。永远不要抓住它们的尾巴，这对老鼠来说是压力很大。让小鼠习惯于实验者也很重要。老鼠需要好好习惯和放松，否则后面在迷宫里学不好。
3. 始终使用相同的处理方法握住鼠标。将鼠标放在体重秤上进行体重监测并记录其体重。
   注意：不要通过快速身体运动或发出大声声音来给小鼠带来压力。最好在安静的环境中进行。否则，它们可能会从秤上跳下来或从实验者的手上跳下来。此外，如果小鼠受到压力，它们会眯起眼睛，发出吱吱声，并可能咬住实验者的手^41,42。
4. 称重后，将鼠标放入之前准备好的新笼子中。
5. 在暴露于桡臂迷宫之前，让小鼠在一周内进行限制量的饮食。这促使他们在迷宫中寻找提供的食物奖励。实验过程中的食物奖励是稀释的甜炼乳。
6. 将2~3克标准食物放入笼中，并在整个实验过程中将体重保持在起始体重的85~90%之间。
   注意：C57BL/6 小鼠每天吃 3-4 克标准食物⁴³.
7. 观察一夜之间体重的下降，以标准化第二天的食物量。从那时起，每天给予足够量的标准食物，以在整个实验过程中保持其起始体重的 85-90%。
   注意：这些动物需要慢慢减肥。监测他们的体重和面部表情以避免压力。
8. 在家庭笼子中的一个小塑料杯中提供1mL稀释的炼乳（奖励;甜炼乳：水= 1：1），以使小鼠习惯化，直到习惯阶段1结束。确保老鼠吃掉奖励。如果小鼠品系对所呈现的食物表现出新恐惧症，则改变奖励食物。
   注意：从习惯阶段 2 开始，不要在家庭笼子里提供奖励。如果任何小鼠的体重低于起始体重的 80%，则应根据 IACUC 和国家/地区特定指南将其安乐死。如果小鼠在第一次体重检查时不在所使用的小鼠系的正常体重范围内（8-12周龄时为20-30克），则不应将其考虑在队列中，以避免以后难以将其体重维持在所需范围内。

4. 将老鼠带到测试室

1. 用手推车慢慢地将小鼠带到行为测试室。
2. 将小鼠放在手推车上5分钟。

5. 房间布置

1. 使用暖白光灯泡将间接照亮中央集线器的房间照明设置为 80 勒克斯，并播放在中央集线器测量的 70 dB 的白噪声。注意：众所周知，暴露于中等强度的白噪声会导致大鼠在几何复杂的迷宫中表现更好^44,45。白噪声似乎不仅仅是掩盖环境中不可避免的噪音;70 dB白噪声增加了大鼠多个大脑区域的胆碱摄取，包括前额叶皮层，下丘脑和海马体（但不在纹状体中）⁴⁶，已知RAM工作记忆性能取决于海马体，额叶皮层和前脑之间胆碱能通路的完整性^32,47.众所周知，动物使用远端和近端视觉线索在环境中准确导航。然而，在空间学习过程中，小鼠更多地依赖远端视觉线索而不是近端线索来导航⁴⁸。在该实验中，将印在一张小纸上的近端线索引入 8 臂 RAM 所有臂的后壁，但它们并没有减少菊花链行为。另一方面，几何不对称的远端视觉线索（在房间的天花板和墙壁上）减少了菊花链，对于 RAM 中的空间导航至关重要。

6. 习惯阶段 1 - 无奖励（第 1 - 2 天）

注意：迷宫中没有奖励。这个阶段是让老鼠习惯迷宫门和它们的声音。

1. 通过单击开始鼠标跟踪和视频录制 Start 开始 软件上的按钮并将鼠标带到迷宫中，而不会造成压力。当鼠标在实验者手中时，通过缓慢移动并缓慢改变高度来做到这一点。将鼠标放在中央集线器中。
   注意：如果小鼠在实验者的手上摇晃，请放慢动作。这是害怕的表现。小鼠在开始强制奔跑阶段之前，在中央枢纽的 5 秒限制期间四处走动。当它们放在中央轮毂时，它们可以面向任何一侧。
2. 继续观察鼠标在远离迷宫或迷宫墙以下的 PC 显示器上的行为。如果老鼠试图爬上墙来逃离迷宫，只需从椅子上站起来以显示实验者的存在，然后走向它，观察它们的性能。在最坏的情况下，将鼠标推回迷宫。
   注意：通常，小鼠在接近迷宫时听到实验者衣服的摩擦声后会回到迷宫。这需要尽快完成。如果实验者继续这样做，小鼠将在习惯阶段 1 到 3 后留在迷宫中。如果老鼠不断跳出迷宫，建议将它们从进一步的实验和分析中移除。
3. 试验结束后，让老鼠自愿爬到实验者的手上，另一只手捂住手臂以防止其跳出迷宫，从而从迷宫的一只手臂上收集老鼠。
4. 刷掉老鼠粪便，用干纸巾擦拭迷宫，去除任何奖励痕迹。然后，用湿纸巾擦拭并用干纸巾擦干迷宫（约 2 分钟）。
5. 对每只鼠标依次执行此作，持续两天。
   注意：30分钟后，小鼠可能没有访问迷宫的所有8个臂。这是正常现象，不是问题。小鼠倾向于以非系统、非顺序的模式访问手臂并谨慎移动，在每只手臂上花费的时间不均匀。在这个阶段，老鼠可以爬上迷宫的墙壁和/或跳出迷宫。如果发生这种情况（例如，老鼠试图爬上墙壁），请通过确保实验者通过接近迷宫并发出一些声音（例如衣服沙沙作响）让老鼠意识到他/她的存在来防止这种情况发生。因此，可能需要仔细观察鼠标在 RAM 中的行为并快速采取行动。重复此过程几次后，老鼠将留在迷宫中。尽管如此，如果鼠标在习惯期间没有留在 RAM 中，请将其从分析中删除。

7. 习惯阶段 2 - 奖励（第 3 - 4 天）

注意：此阶段是为了鼓励老鼠自由探索迷宫以获得食物奖励。

1. 将 70 μL 食物奖励放入每只手臂的每个食物孔中。
2. 单击软件上的 “开始” 按钮，然后将鼠标放在迷宫中央集线器上，如 6.1 中所述，开始鼠标跟踪和视频录制。
3. 从远处继续观察鼠标在 PC 显示器上的行为，并在必要时将其写下来，例如爬墙或跳下迷宫。当小鼠进入每只手臂至少两次或经过30分钟时结束试验。
4. 试验结束后，让老鼠自愿爬到实验者的手上，另一只手捂住手臂，防止其跳出迷宫，将小鼠从迷宫中收集起来。
5. 按照 6.4 中的描述清洁迷宫（习惯阶段 1;约 2 分钟）。
6. 每天对每只小鼠轮流执行此作两次，持续两天。
   注意：在这个阶段，小鼠可能会表现出菊花链行为，但无需担心，因为工作记忆任务中额外的 4 个手臂条目可能会阻止这种运动。在这一步中，老鼠可以在不消耗奖励的情况下停在手臂上。在第4天，小鼠应该比第3天训练得更多，但仍可以停在手臂中间。

8. 习惯阶段 3 - 奖励（第 5 - 6 天）

注意：这个阶段是为了让小鼠适应阶段1和2组合的环境。

1. 用70μL的奖励诱饵所有食物井。
2. 通过单击软件的开始按钮并将鼠标放在迷宫的中央集线器上，开始鼠标跟踪和视频录制。
3. 从远处继续观察鼠标在 PC 显示器上的行为，直到鼠标至少进入每只手臂一次或 30 分钟。如果老鼠试图逃离迷宫，请按照习惯阶段 1 （6.2） 中所述快速行动。
4. 试验结束后，让老鼠自愿爬到实验者的手上，另一只手捂住手臂，防止其跳出迷宫，将鼠标从迷宫中移开。
5. 按照 6.4（习惯阶段 1）（约 2 分钟）中所述清洁迷宫。
6. 每天对每只小鼠执行两次此作，持续两天。
   注意：在这个阶段，最好从分析中删除任何试图逃离迷宫的小鼠。

9. 工作记忆任务 - 奖励（第 7 天 - 第 15 天）

1. 用 40 μL 奖励诱饵所有手臂。将奖励放在靠近中央枢纽的每种食物中，使老鼠难以从中央枢纽看到。
2. 通过单击软件的开始按钮开始鼠标跟踪和记录，然后将鼠标放在迷宫中央集线器上，而不会施加压力。
3. 在中央枢纽的 5 秒限制期间，走开并坐在远离迷宫的地方。监控鼠标的行为并记下鼠标在迷宫中访问的手臂的顺序（参见 补充文件 1）。
4. 当老鼠收集到所有八种食物奖励时，停止记录手臂访问序列，这是工作记忆任务的结束，然后让它访问四个额外的手臂。
   注意：通过这样做，小鼠在被捕获之前可以有更多的时间，这使小鼠能够专注于工作记忆任务。这一步还允许老鼠强化这样一个事实，即奖励一旦收集就不会补充。
5. 在四次额外的手臂访问之后，在最后一次手臂访问结束时，让鼠标爬到手上，同时用另一只手盖住手臂，将鼠标从迷宫中取出。
   注意：通过不在中央枢纽中捕捉小鼠，小鼠不会将被捕获与中央枢纽联系起来，小鼠决定下一步去哪只手臂。一旦老鼠熟悉了这项任务，包括额外的手臂访问，它们就可以在最后一个食物井附近自由移动或在中央枢纽中度过一段时间。但是，他们应该在 3 分钟内完成 4 次额外的手臂访问。如果他们没有在 5 分钟内完成，请将它们放回家庭笼子。
6. 选择下一个笼子，通过点击笼子来调整唤醒水平以进行下一次试验。
7. 按照 6.4（习惯阶段 1）（约 2 分钟）中所述清洁迷宫。
8. 转到下一只鼠标，对每只鼠标依次重复 6 次，持续 9 天。
   注意：在以后的试验中，四次额外手臂访问的平均持续时间应该变得更长，因为小鼠学会识别何时没有进一步的奖励或没有新的、未访问的手臂可以进入。

10. 评分

1. 计算“每日成功率得分”（%） = 4（进球数）/（手臂总条目数[4+错误]）x 100。
   注意：强行奔跑后，只有四只手臂装满了奖励，即目标。如果它们进入小鼠在强制运行中访问的手臂，则将其计为一个错误，以及自由运行中的重复手臂。
2. 计算 6 次试验中的“完美试验率分数”（%） = [（完美试验次数） / 6 ] x 100
   注意：满分意味着没有工作记忆错误。
3. 在软件中选择鼠标的速度、距离和加速度进行分析，并计算每天的平均值。确保从这些分析中排除四次额外的手臂访问。此外，通过在实验后查看小鼠跟踪视频来测量四次额外手臂访问的持续时间。
   注意：小鼠可以在进入手臂后立即快速转身。不要将其计为条目并评分，因为它是快速错误更正，这意味着工作记忆有效⁴⁹。但是，如果鼠标越过手臂的中点或在手臂中停留超过 3 秒，则对条目进行计数并评分。每日成功率分数表示小鼠的学习曲线，完美试用率分数表示工作记忆保留效率。

11. 统计

1. 如果研究对照和敲除小鼠系之间的差异，如上一篇出版物⁵⁰ 中所做的那样，请执行如下所述的统计。
   1. 使用重复测量双向方差分析与事后分析（例如，Bonferroni 检验）[在 9 个不同时间点测量每个受试者]比较对照组和实验组的结果数据。
   2. 如果比较组，则在每组中至少测试10只，最好是~20只小鼠。如果基因作、制造病变或药物治疗的效果明显，则样本量可以更小。

该协议在我们之前的出版物中使用，其中我们询问了使用 MyRF cKO 小鼠和对照50 的空间工作记忆任务表现是否需要新的少突胶质细胞和髓鞘。我们发现，对照小鼠的工作记忆任务性能有所改善，但 MyRF cKO小鼠的工作记忆任务表现没有改善。工作记忆任务刺激和促进野生型小鼠与工作记忆处理相关的大脑区域的少突胶质细胞前体细胞 （OPC） 增殖和分化，以及少突胶质细胞 （OL） 髓鞘形成。我们还执行了 T 迷宫奖励交替任务来评估空间工作记忆。执行此任务以检测 MyRF cKO 小鼠的工作记忆缺陷。然而，在组织学分析中，进行T迷宫奖励交替任务的小鼠组与家庭笼对照组之间没有观察到显着差异。因此，我们得出结论，这里提出的协议在研究工作记忆方面比 T 迷宫奖励交替任务更有效。

每只小鼠每天进行 6 次工作记忆任务试验，总共持续一小时。因此，该协议允许队列中最多有8只小鼠。在习惯化的早期，老鼠在迷宫臂中度过的时间不均匀，动作缓慢。他们在手臂的末端停留了很长时间。直到迷宫习惯的第 5 天结束，他们在迷宫臂中度过了不同的时间，并且可以在不接触奖励的情况下返回中央枢纽（图 3A）。然而，在第六天，动物在 8-15 分钟内至少进入每只手臂一次，在每只手臂中度过了相似的时间，这表明动物已经习惯了迷宫并准备好执行任务（图 3A，第 6 天下行和 图 3B）。

在习惯阶段，它们经常用后肢站立，从手臂或中央枢纽向上看。在工作记忆任务中观察到类似的行为，但它们不一定朝同一方向移动（例如，2 -> 3-> 5 -> 8 [顺时针] 或 8 -> 5 -> 3 ->2 [逆时针]）。他们可以改变方向（例如，5 -> 4 -> 6 -> 1）。个体小鼠没有明显的选择手臂序列的公共倾向。在自由运行中，小鼠往往花更多的时间选择最后一个奖励手臂，而不是第一个奖励手臂。这可能是因为他们在自由运行的第一选择中有四个选项可供选择，而最后一个奖励只有一个选项。在自由奔跑开始前至少50（15 + 15 + 15 + 5）秒将强制奔跑阶段的第一只手臂呈现给小鼠。因此，如果没有工作记忆错误，这项工作记忆任务就不容易执行。 补充视频 1 显示了一只小鼠在工作记忆任务训练的第 8 天进行完美试验。

使用任一评分系统，我们发现它们的性能在 9 天 RAM 测试期的前 3 天几乎持平，但之后显着提高（图 4A、B）。经过6天的习惯化和9天的迷宫训练，雄性C57BL / 6小鼠从第8天开始定期达到≥80%的每日成功率分数，定义为4 /（4 + E），其中E是错误数。随着时间的推移，自由滑的平均行驶距离变短，但平均速度和加速度每天都相当恒定（图 4C-F）。小鼠可能在四次额外的手臂访问中产生了被抓住的恐惧记忆，这可能是小鼠在实验结束时花费更多时间的原因之一（图4G）。

在该协议中，习惯步骤持续6天，这可能导致调整实验的生物钟，即使动物设施中的明/暗循环没有逆转。

图 1：RAM 规格和功能。 （A） 从天花板安装的 CCD 和侧面看迷宫的视图以及尺寸。（B）将食物井沉入迷宫地面以下1.5厘米处，使老鼠无法在>10厘米外看到内容物。（C） 迷宫竞技场设置。显示了中央轮毂和臂 1-8。（D） 实验室示意图和带有房间照片的外部视觉线索。 请点击此处查看此图的大图。

图 2：迷宫控制程序的流程图。 （A） 习惯阶段 1（第 1 天和第 2 天）。（B） 习惯阶段 2（第 3 天和第 4 天）。（C） 习惯阶段 3（第 5 天和第 6 天）。（D） 工作记忆任务（第 7-15 天）。（E） 工作记忆任务范式的模式。小鼠经过伪随机选择的四个强制奔跑臂，被限制在中央枢纽中 5 秒，然后进行自由奔跑以收集剩余的奖励。 请点击此处查看此图的大图。

图 3：6 天习惯期间的热图和燕窝图。 （A）三只小鼠在习惯第1-6天期间小鼠轨迹的热图。在习惯第3-6天，小鼠每天进行两次试验;上面的热图显示第一次试验，下面的热图显示第二次试验。（B） 习惯第 6 天的燕窝图。上面三个显示了小鼠1,2和3的第一次试验，下面三个显示了小鼠1,2和3的第二次试验。下表列出了同一三只小鼠的试验持续时间。 请点击此处查看此图的大图。

图 4：RAM 工作内存任务。 （A） 平均每日成功率分数 （%） 由 [4/（自由运行期间的手臂进入次数）x 100] 计算。对当天的6项试验的分数进行平均。（B） 任务 9 天内的试用满分。（C） 个人行驶距离和平均值。（D）任务中小鼠的个体运行速度和平均值。（E）小鼠的个体加速度和平均值。（F）小鼠的个体减速和平均值。（G） 额外 4 次手臂访问的个人和平均持续时间。 请点击此处查看此图的大图。

补充视频1：小鼠在工作记忆任务训练的第8天进行了完美的试验。 请点击此处下载此文件。

补充文件 1：示例记录表。在观察鼠标行为的同时写下手臂访问的顺序。 请点击此处下载此文件。

作者没有需要披露的利益冲突。