本文介绍了一种专为大鼠设计的独特可3D打印植入物，名为TD Drive，能够实现对称的双侧导线电极记录，目前可同时记录多达十个分布于全脑的脑区。
本文内容
摘要
摘要
大脑的大多数功能依赖于多个脑区之间的复杂相互作用。学习过程以及记忆的形成与巩固便是两个典型例子，它们在很大程度上依赖于全脑范围内的功能连接。此外，研究大脑半球间的相似性和/或差异性也与这些多脑区相互作用密切相关。因此，旨在进一步阐明这些复杂过程的电生理学研究，通常需要同时在多个脑区、且常常以双侧对称的方式记录脑活动。本文介绍一种适用于大鼠的3D打印可植入装置，名为TD Drive，能够实现对称的双侧导线电极记录，目前可同时覆盖多达十个分布于不同位置的脑区。该开源设计采用参数化设计原则构建，使潜在使用者仅需调整记录电极位置的前后向和内外侧坐标等高层参数，即可轻松根据自身需求修改驱动器设计。该植入装置的设计已在n = 20只Lister Hooded大鼠中进行了验证，这些大鼠执行了不同的行为任务。该装置适用于有线睡眠记录和开放场记录（物体探索），也可结合两种不同的商用记录系统和前置放大器，在大型迷宫中进行无线记录。因此，本文展示了一种可灵活调整的新一代电生理植入装置的设计与组装方法，有助于加快制备与植入过程。
引言
清醒和睡眠期间大脑相互作用具有多区域特性，这使得对持续生理过程进行全面研究变得困难。尽管功能磁共振成像（fMRI）和功能超声成像（fUS）等方法能够对全脑的脑活动进行采样1,2，但这些技术依赖神经血管耦合，通过血流动力学活动间接推断脑活动，从而限制了其时间分辨率2。此外，fMRI要求将受试者置于MRI扫描仪中，无法用于自由活动动物的实验。利用单光子或双光子成像技术对钙动力学进行光学成像，可同时记录数百个神经元的细胞类型特异性活动3。然而，诸如Miniscope3等头戴式显微镜虽然支持动物自由活动，通常仅限于对完整大脑的浅层皮层区域进行成像4。尽管其在皮层上的视场直径可达约1 mm，但这些头戴式显微镜的空间占用可能使得同时靶向多个区域（尤其是相邻区域）变得困难。因此，为了准确捕捉清醒和睡眠状态下的多区域脑动态，植入目标脑区电极的细胞外电生理记录成为首选方法之一，因其具有高时间分辨率和空间精确性5。此外，该方法可用于表征与人类脑电图（EEG）分析结果相兼容的睡眠动态，从而提升该方法的转化应用价值6。
传统上，使用细胞外电极记录脑活动的研究采用单根导线电极或电极束，例如四极电极7。目前先进的探针（如Neuropixels探针）8可实现多个脑区的同时记录，前提是这些脑区位于同一条轴线上，从而能够沿该轴线植入探针而不影响动物的正常活动。然而，对多个空间分离脑区进行精确的同步记录仍然具有挑战性，现有方法往往成本高昂或耗时较长。
近年来，立体光刻等增材制造技术已得到广泛应用。这使得研究人员能够开发出可适应其特定实验需求的新型电极植入体9，例如，简化对多个脑区的可重复定位操作。这些植入体设计通常还会以开源硬件的形式与学术界共享，以便其他研究人员根据自身需求进行调整。特定植入体的可适应程度，既取决于其设计方式，也与其共享方式有关。参数化建模10是计算机辅助设计中的一种常用方法，该方法通过相互关联的参数和明确的设计历史，将设计中的不同组件连接起来。在植入体设计中采用参数化方法，可显著提升其可重用性和可适应性10，因为修改单个参数即可自动更新整个设计，而无需进行复杂的手动重新建模。因此，设计本身必须以可编辑的格式共享，以保留其参数关系和设计历史。仅表示几何基元的文件格式（如 STL 或 STEP）无法保留这些参数关联，因而使已发布模型的后续参数化修改难以实现。
虽然四极超驱动装置11,12,13能够实现数十个四极电极的同时记录，但其组装和植入过程耗时较长，且记录质量在很大程度上依赖于研究人员个人的技术与经验。此外，这类装置通常将引导记录电极到达目标脑区的导管集中为一到两个较大的束状结构，从而限制了可高效靶向的脑区数量与分布范围。
其他植入装置14,15需要暴露完整的颅骨，以便自由放置多个携带记录电极的独立微型驱动装置。尽管在手术过程中放置独立的微型驱动装置16可最大程度地提高灵活性，但这会延长手术时间，并且由于各个微型驱动装置所需的空间限制，可能难以同时靶向多个相邻区域。此外，尽管这些植入装置是开源的，但仅以STL文件格式发布，使得修改变得困难。
一种更具内在参数化设计理念的驱动装置实例是 RatHat17。该装置通过提供覆盖颅骨整个背侧表面的手术模板，可在手术过程中无需使用立体定位仪即可精确定位多个脑区靶点。该装置支持多种植入式组件变体，适用于套管、光导纤维或四极电极。然而，尽管该驱动装置可免费用于学术研究，但其并未以开源形式发布，这为研究人员评估和使用该植入装置带来了障碍。
本文介绍了TD Drive（见图1），一种用于大鼠细胞外电极记录的新型可3D打印植入装置。TD Drive旨在克服现有方案的一些局限性：它能够同时在双侧半球对称地靶向多个脑区，并使用独立的导线电极进行记录。由于其结构设计简单，经验较少的研究人员也能在数小时内以相对较低的成本完成组装。TD Drive以开源形式发布，采用易于修改的文件格式，便于研究人员根据自身特定需求进行调整。从设计初期即采用参数化3D建模方法，使得所需修改的参数得以抽象化：研究人员只需编辑代表其背腹向和前后向坐标的参数，即可更改靶向位置，而无需自行重新设计整个驱动装置。修改和制造TD Drive所需的文件可在https://github.com/3Dneuro/TD_Drive获取。
图 1：TD Drive 概览。 （A）带保护帽的 TD Drive 渲染图。（B）显示内部组件的渲染图。TD Drive 的特点包括（a）多个可参数化调节的记录位置，用于固定和可移动的电极丝；一个EIB，包含（b）高密度 Omnetics 连接器，可兼容常见的有线和无线数据采集系统；（c）针对 Intan/Open Ephys 系统优化的直观通道映射（见补充图 1）；以及（d）保护帽，用于在有线记录期间或未连接前置放大器时保护植入物。（C）TD Drive 底部的导向模板有助于引导套管的放置，并在手术过程中作为植入位置的冗余验证手段。请点击此处查看该图的放大版本。
该植入装置的设计在 n = 4 只大鼠中进行了初步测试，在 n = 8 只大鼠中进行了验证，并在 n = 8 只进行不同任务的 Lister Hooded 大鼠中得到确认。前 4 只动物用于开发驱动装置并调整参数。随后，使用 8 只动物进行了完整的初步实验（结果中已展示）。另有一组 8 只动物被纳入植入物存活率分析。该植入装置可兼容有线睡眠记录和开放场记录（物体探索），也可用于大型迷宫（HexMaze 9 m × 5 m）中的无线记录，且可配合两种不同的商用记录系统和前置放大器使用。两组各 8 只动物分别使用两种不同的采集系统进行记录——有线系统用于长时间睡眠记录，无线系统用于大型迷宫探索记录。我们可以得出结论：这种简单的导线驱动装置使得经验较少的研究人员也能对更大规模的动物群体开展长期实验，从而实现睡眠阶段分析以及多个脑区的振荡活动分析。这与迄今为止大多数电生理植入装置形成对比，后者由于操作复杂且耗时，通常只能用于较小的动物群体，且往往需要经验非常丰富的实验人员操作。然而，该驱动装置无法记录单个神经元活动，因此其应用仅限于局部场电位（LFP）和总和电活动的研究。
方案
本研究经荷兰中央动物实验委员会（CCD）批准，并依据《动物实验法》进行（方案编号：2020-0020-006 和 2020-0020-010）。实验使用到达时年龄为 9–12 周的雄性 Lister Hooded 大鼠。本方案中所用试剂和设备详见材料表。驱动构建过程的步骤参见补充图 1和补充图 2。
1. 调整和创建三维模型及电极接口板（EIB）数据
- 在 Autodesk Fusion 中打开驱动体设计。在 修改 选项卡下点击 更改参数。通过在 anteroPosteriorSite1 中输入前后坐标、在 medioLateralSite1 中输入内外侧坐标，来调整第一个记录位置的坐标。可通过调整 diameterSite1 来修改导管或电极孔的直径。对记录位置 2 和 3 重复上述操作，模型设计将自动更新。
注意：本方案中使用的三个记录位置分别为海马（HPC），包含可移动的导线束；以及前额叶（PFC）和压后皮层（RSC），二者均使用固定导线束（PFC 导线束同时靶向内侧前额叶皮层（PRL）和前扣带皮层（ACC））。表 1 列出了手动设定的控制记录位点内外侧坐标的参数限制。 - 通过在浏览器中右键单击驱动体并选择 另存为网格 来导出更新后的驱动体。选择类型为 STL（二进制），单位为 mm，精度为 高。
- 选择标准帽体的预置 STL 文件；如有需要（例如当靶点位置较外侧时），则选择大号帽体的预置 STL 文件。
- 根据所选帽体类型，选择相应的标准或大号 EIB 进行生产。两种 EIB 的 Gerber 生产文件均以压缩包形式提供，可直接发送至加工服务商。
2. 3D 模型打印与 EIB 制备
注意：本研究使用市售的3D打印机来制造部件（参见材料表）。当使用不同的打印机或将生产外包时，可能需要使用其他可比的树脂材料来制造部件。
- 使用立体光刻技术9，以高分辨率和常规或生物相容性树脂（例如透明、黑色或白色树脂），层高为 25 µm，打印驱动器主体和滑块。使用坚固耐用的树脂（例如 Tough 2000）打印帽部零件。
- 可自行在内部制造EIB，或由外部服务商加工生产。使用表面贴装器件（SMD）焊接技术将高密度连接器焊接到EIB上。
注意：若缺乏精细电子元件焊接经验，建议将焊接工作交由外部完成，例如在大学电子工作坊或商业供应商处进行。通过在连接器周围涂抹高强度环氧树脂来加固已焊接的高密度连接器。注意切勿将环氧树脂覆盖到电极孔位上。
3. 3D打印物体的后处理
注意：帽盖和推杆通常无需后处理。根据 3D 打印的质量，可能需要轻微打磨或去除残留的支撑痕迹。在打磨和钻孔时，注意不要损坏驱动体的壁。如有必要，使用异丙醇、软布和/或压缩空气清洁经过后处理的部件。
- 使用安装在手摇钻上的0.5 mm钻头，在驱动体的顶部和底部钻出导管孔。这可确保各部位的尺寸准确且一致。
- 使用安装在手摇钻上的2 mm钻头，在驱动体上钻出两个沉头孔（如图2E所示），用于安装穿梭用黄铜嵌件。
- 用压缩空气清除沉头孔中的钻屑。然后使用M1丝锥对穿梭螺钉的导向孔（即沉头孔的延伸部分）进行攻丝。攻丝应分两次或更多次完成，每次之间需清除丝锥和孔内的碎屑。可选择性地在丝锥上涂抹一滴矿物油作为润滑。
- 用压缩空气清除驱动体上钻孔和攻丝过程中产生的碎屑。
图2：TD驱动装置的三维渲染图。（A,B）TD驱动装置在大鼠颅骨模型上的状态：（A）未安装保护帽，（B）已安装保护帽。（C）聚酰亚胺导管正确插入六个记录位点中的每一个。（D）一个独立的、已完成的穿梭体组件，包含导向螺钉、3D打印的穿梭体以及焊接的黄铜嵌件。（E）TD驱动装置主体，其中已插入两个穿梭体。红色标记部分为：（a）穿梭体的沉头孔，（b）穿梭体导槽，（c）驱动主体的中央基座，（d）导向模板。（F,G）驱动装置主体顶部（F）和底部（G）上可能存在需要在3D打印后进行后处理的关键位置，分别用红色箭头标出。请点击此处查看该图的放大版本。
4. 转运组件
- 将一个3D打印的滑块套入M1×16螺丝上。使用M1黄铜嵌件固定3D打印滑块的位置。嵌件安装后，滑块必须能够自由旋转，但不能上下移动。
注意：以下步骤存在烫伤风险（涉及焊接）。根据所使用的焊料和助焊剂，可能接触呼吸道刺激物和铅。焊接时务必佩戴护目镜（因焊料可能飞溅），并遵循有关安全处理潜在有害物质的适当指南，包括对工作区域进行充分通风以排除焊接烟雾。请遵守当地法规和操作规程，或参考在线可用的相关资料18,19。 - 使用少量焊锡膏，将黄铜嵌件焊接到螺丝上。注意不要过度加热嵌件和螺丝，以免熔化3D打印的滑块。根据滑块3D打印所用树脂的不同，少量熔化（进而导致滑块粘附于嵌件）较难完全避免。
注：若使用不锈钢螺丝，可能需要使用焊剂。建议使用黄铜或机械钢螺丝，因其更易于焊接。 - 滑块组件冷却后，轻轻将3D打印滑块在螺丝上多次旋转。若焊接过程中滑块与嵌件发生粘连，此操作可将其分离。
注：确保滑块能自由旋转且无晃动。若存在晃动，请丢弃该滑块组件并重新制作。仔细尝试旋转黄铜嵌件。若嵌件相对于螺丝发生转动，则需重复焊接过程。
5. 组装驱动装置
- 将市售的聚酰亚胺管切割至约 25 mm 长度，但至少应足够长以贯穿整个驱动体。
- 将聚酰亚胺导向管插入驱动体中。每根管应从驱动体顶部的一个孔插入，并对应穿过驱动体底部导向模板上的相应孔（图 2E 中的“d”）。插入时应使导向管与驱动体顶部齐平。
- 使用细针或牙签，从驱动体顶部的孔处施加少量液态氰基丙烯酸酯胶水，以固定导向管。应从驱动体底部一侧施加胶水，避免胶水流入导向管内。胶水将通过毛细作用被吸入驱动体与导向管之间的间隙，从而实现粘接。
- 在驱动体底部，于导向管与导向模板的接口处施加少量氰基丙烯酸酯胶水。注意避免胶水堵塞导向管。静置数分钟使胶水干燥。
注意：所需确切时间取决于驱动体材料以及驱动体与导向管之间的间隙。通常情况下，5–10 分钟已足够。 - 将驱动体翻转倒置，从底部切割聚酰亚胺导向管，使其超出驱动体中心支柱约 1 mm（见 图 2E 中的“c”和 补充图 2）。在此配置下，植入时导向管末端将与脑表面齐平。
注意：该驱动体设计用于靶向脑深部区域。若目标为浅层皮质区域，则可能需要更短的聚酰亚胺导向管，以防初始脑肿胀时损伤脑表面。 - 将两个推移组件插入驱动体中。在将其旋入带螺纹的导向孔时，确保螺钉与推移导向槽保持平行（图 2E 中的“b”）。用手指轻轻将推移组件与导向槽对齐。
- 将推移组件完全旋入沉孔，以确认推移组件中的黄铜嵌件不会卡在驱动体内或与聚酰亚胺导向管发生碰撞。本方案要求至少完成 16 圈全旋。若未达到此圈数，需进一步切除驱动体顶部的聚酰亚胺管以腾出空间。切勿过度拧紧推移组件，以免损坏驱动体内的嵌入螺纹或推移组件的焊点连接。
注意：若推移组件卡住，应将其完全取出并检查焊点是否松动。若焊点已松动，请更换新的推移组件。若推移组件与导向管发生碰撞，应缩短导向管使其不再超出驱动体。 - 使用 M2.5×5 聚酰亚胺螺钉将 EIB 固定至驱动体。在驱动体与 EIB 之间滴加数滴氰基丙烯酸酯胶水。注意勿堵塞用于电极连接的通孔。
6. 准备保护罩
- 将一个不锈钢M2螺母插入左半侧帽盖的凸出部分，并用氰基丙烯酸酯胶水固定。
- 如有需要，使用装在小手钻中的M1钻头钻通左帽盖前端的孔；用M1丝锥攻右半侧帽盖前端的孔。
7. 准备导线电极
- 准备两块金属板作为制作电极丝束的表面。这些金属板将作为平整、稳定且可移动的平台，用于进行丝束的组装、粘合和切割操作。将绘图纸贴在第一块金属板上，并在第二块金属板上固定两条粘性朝上的胶带。
- 将HPC束中四根导线中的三根以60度角斜切，以在背腹方向上形成偏移。这将便于分别将导线置于海马锥体层上方、层内和层下方。为便于切割，可在绘图纸上画一条清晰的60度角直线（60度线）。
- 每个HPC电极束，剪取4段电极导线，每段长度为4.5 cm。每个PFC和RSC电极束，剪取4段电极导线，每段长度为3.5 cm。
- 用指尖轻轻触碰4根导线（导线会粘附在指尖上），并将它们尽可能紧密地并排放置在美纹纸上，注意不要将导线相互重叠。
- 在显微镜下，使用镊子将导线尽可能紧密地并置。在束线上端的前2 cm处涂抹一层薄薄的液体氰基丙烯酸酯胶水。对于HPC束线，使用胶水 > 2 cm 和 < 3.5 cm 的导线。等待胶水干燥。
- 用镊子在显微镜下轻轻触碰导线。如果导线不分离，则表明胶水粘合正确。作为验证步骤，需确保胶层在显微镜照明下呈现光泽。
- 完全干燥后，将导线束从胶带上取下，并转移至带有绘图纸的载板上。在显微镜下检查导线束顶部及侧面是否有 excess 胶残留，并用手术刀片小心去除。
- 对于RSC束，在阵列底部沿垂直于导线方向进行直线切割。
- 对于HPC束，将阵列放置在绘图纸上，使其与60度线相交，并以该线为引导，沿与导线方向成60度角进行切割。
- 然后，使用手术刀片小心地将四根导线中最短的一根从束中分离出来。沿垂直于导线方向将其切断，使其长度比束中第二长的导线缩短约 0.75 mm。
- 对于PFC束，将阵列底部分成两个2线束。确保两根导线粘合牢固。通过垂直于导线方向切割，将其中一个2线束缩短1 mm。参见 补充图1 （底部）和 补充图2b 用于切割后线束的图像。
8. 准备接地线和脑电图导线
- 从一个间距为1.27 mm的SIP/DIP插座条中推出至少10个SIP/DIP引脚。
- 剪取2段长度为6 cm的接地（GND）导线，再剪取8段长度为6 cm的脑电（EEG）导线。使用手术刀片小心地将所有导线两端的部分绝缘层去除。
- 将一颗M1×3不锈钢螺丝固定在第三只手工具中，使螺丝头部下方尽可能留出操作空间。将一段去除了绝缘层的GND或EEG导线缠绕在螺丝杆上，紧靠螺丝头部下方。
- 用细针或牙签涂抹少量助焊剂，然后将导线焊接到螺丝上。注意不要意外堵塞螺丝头部的槽口。
- 将一个SIP/DIP引脚放入第三只手工具中，使其插座端（母端）朝上便于操作。将导线另一端去除了绝缘层的部分插入该SIP/DIP引脚中。涂抹少量助焊剂，并将导线焊接到引脚上。
- 将焊接好的螺丝-导线组件从夹具中取出。该组件将在植入手术期间植入颅骨中。
- 将另一个SIP/DIP引脚以180度旋转方向放入夹具中（即露出插针端，公端朝上）。涂抹少量助焊剂，并将另一根导线的去绝缘端焊接到该引脚的公端上。
- 将焊接好的导线-引脚组件从夹具中取出。该组件后续将连接至EIB，而在植入手术过程中，螺丝-导线组件与导线-引脚组件将通过各自的两个引脚相互连接。
- 为增强焊点连接的牢固性，可在导线与引脚的连接处涂抹少量氰基丙烯酸酯胶水。
- 待胶水完全干燥后，检查两个组件的SIP/DIP引脚是否能够顺畅连接。使用万用表的通断检测功能，验证当两个组件连接时，螺丝与导线-引脚组件的去绝缘导线端之间是否存在连续通路。可选地，可使用指甲油（见材料表）对每组导线进行颜色编码，以便在植入手术期间简化正确连接。
9. 将导丝束装入驱动装置
- 将驱动器固定到支架上。此步骤中需注意不要对EIB施加过大压力，以免损坏高密度连接器。
- 当驱动体处于稳定位置后，取其中一束导线，用手或精细镊子小心地将其滑入相应的聚酰亚胺管中。确保导线阵列方向正确（例如，前额叶皮层阵列中，阵列的两条较长导线应朝向内侧），并注意避免弯曲导线阵列。
- 对所有其他线束重复最后一步操作。
- 使用细镊子夹住其中一根导线，小心地将其弯向要插入的孔。插入后，用一根金针将其固定在EIB孔中。对束中的所有导线以及所有导线束重复此操作。
- 确保在此阶段，导线在EIB上方形成一个整齐的环路（这样仍可上下移动聚酰亚胺管内的导线束，以调节管底部的长度），并防止从聚酰亚胺管底部伸出的电极阵列意外弯曲。务必记录下每束导线中各根导线与EIB上各个通道的对应连接关系。参见 补充图1 有关TD Drive通道映射的详细说明。
注意：或者，在装载每束导线后（步骤 9.2），可直接将导线连接至 EIB（步骤 9.4），然后对剩余导线束重复执行步骤 9.2 和 9.4。具体操作可根据实验人员的个人偏好进行调整。参见 补充图2b 以一个已加载的TD驱动器为例。
- 确保在此阶段，导线在EIB上方形成一个整齐的环路（这样仍可上下移动聚酰亚胺管内的导线束，以调节管底部的长度），并防止从聚酰亚胺管底部伸出的电极阵列意外弯曲。务必记录下每束导线中各根导线与EIB上各个通道的对应连接关系。参见 补充图1 有关TD Drive通道映射的详细说明。
- 通过轻轻推拉导管中的导线束，调节其长度以准确定位记录位置（参见 补充图2d).
注意：由于导管被切割至与脑表面齐平，因此导丝束超出导管的距离对应于目标区域的背腹向位置。可移动的海马（HPC）导丝束应与导管底部齐平，固定的后扣带回（RSC）导丝束应超出导管1.5 mm，固定的前额叶皮层（PFC）导丝束应超出导管3.5 mm。在推进或拉动导丝组件时，需小心操作，避免将单根导丝从顶部的EIB接口中拉出，或使导丝束底部发生弯曲。 - 当固定导线阵列（RSC 和 PFC）对齐后，在导管顶部涂抹少量高强度环氧胶，将导线束固定到位。在环氧胶固化过程中，确保导线束底部仍保持正确对齐。
- 为固定可移动的HPC线阵列，首先将穿梭装置移至所需最高位置（本文所述实验中，至少高于最低位置16整圈/4 mm）。然后将导线束推入穿梭装置的U形开口中，并用少量高强度环氧树脂胶将其粘牢。
注意：确保环氧树脂不会沿束体流入聚酰亚胺管内。待环氧树脂固化后，在同一位置施加第二层环氧树脂以增强连接，并在移动穿梭装置时降低连接断裂的风险。 - 将接地线（GND）的导线-插针组件的开口端小心插入标记为 GND 的通孔之一，并使用金色插针固定。
注意：当使用将接地（GND）与参考（REF）通道短接的前置放大器时，若更方便，也可使用REF通道。 - 从支架上取下驱动装置，注意不要弯折任何导线组件。将驱动装置的前部重新安装到同一支架上，并将4根脑电图（EEG）导线针组件插入对应EEG通道的通孔中（标记为2、4、29、31），每个通道用一枚金针固定。
- 对于所有接地（GND）和脑电图（EEG）导线，使用万用表的通断测试模式，检测EIB上的金针与相连导线-针组件的针脚之间是否具有连续导通性。
- 储存驱动器。例如，可通过将盖子安装到驱动器本体上，并将其倒置存放来完成。
注意：手术植入前，使用乙醇对驱动器底部进行灭菌。所有骨螺钉和接地/脑电图导线组件均应在乙醇中灭菌。手术器械应进行灭菌 通过 高压灭菌器
10. 驱动植入手术
注意：此步骤简要概述了植入 TD Drive 的手术流程。更详细的植入方案，包括工具描述以及药物剂量和浓度，详见补充文件 1。
- 根据当地机构指南对手术器械进行灭菌，并清洁和消毒手术区域。为灭菌植入物，将电极导线中将与脑组织接触的部分置于乙醇中至少一分钟。
注意：长时间暴露于乙醇或其蒸气可能削弱氰基丙烯酸酯胶水。若乙醇蒸气未被密闭，应延长导线在乙醇中的浸泡时间。为验证胶水的完整性，建议使用未用于实际实验的测试植入物确定最佳浸泡时间。 - 根据机构和当地指南，给予必要的术前镇痛、抗生素和气体麻醉（异氟烷）。
- 将大鼠置于立体定位仪中。剃除头部顶部毛发，并用聚维酮碘对皮肤进行消毒。皮下注射局部麻醉剂（利多卡因），并在颅骨中线顶部做一小切口。
- 将皮肤向一侧牵拉以暴露颅骨。清除颅骨表面的结缔组织，干燥并清洁颅骨表面。轻柔分离颅骨侧面的肌肉，以便安装固定螺钉。
- 测量前囟（bregma）和后囟（lambda）坐标。为实现精确定位，通过测量前囟与后囟在背腹方向（dorsoventral）位置的差异，确保颅骨表面与立体定位仪的前后-左右平面平行。若两坐标存在差异，可通过升高或降低立体定位仪的咬合器来调整大鼠的位置。
- 标记目标脑区的开颅位置（前边缘皮层（AP +3.5 mm，ML + -1 mm）、压后皮层（AP +5.8 mm，ML +-1 mm）和海马（AP -3.8 mm，ML + -2.5 mm））。
- 为接地/脑电图（GND/EEG）螺钉和固定螺钉钻孔。插入螺钉后用液态牙科丙烯酸树脂覆盖。钻开颅窗，小心去除硬脑膜。通过滴加无菌生理盐水防止颅窗干燥。
- 将TD Drive小心放置于颅窗上方，确保导管与颅骨表面平齐。用凡士林保护导管，并使用牙科丙烯酸树脂将TD Drive固定于颅骨上。
- 将靶向海马（HPC）的导线阵列从初始位置（距脑表面约1.5 mm DV）缓慢下移至海马CA1区的锥体细胞层。在大鼠术后恢复期间的信号检测过程中，逐步推进至锥体细胞层。
- 在驱动装置周围安装保护帽。
- 关闭气体麻醉，将大鼠从立体定位仪中取出。将其放入加热舱内的清洁笼具中，并提供湿粮和水以助恢复。持续监测大鼠，直至其恢复活动能力，能够在笼内移动、进食和饮水。
- 将大鼠送回饲养室。根据机构指南提供术后镇痛和护理。例如，参见补充文件1中的手术方案示例。
11. EIB 回收
- 实验结束后，回收探针装置并移除保护盖。
- 取下金针，并小心连接电极导线。将EIB从探针主体上拧下。通过将软头镊子轻轻插入EIB与探针主体之间，或用手小心抬起EIB，释放残留的氰基丙烯酸酯粘合剂，使EIB与主体分离。
- 清洁EIB和金针，以便在后续的TD探针植入手术中重复使用。在重复使用EIB之前，应检查金针通孔和高密度连接器是否有磨损。只有当通孔保持足够完整，能够确保金针、电极导线与EIB之间形成良好连接，且高密度连接器与前置放大器之间的连接仍足够稳定时，方可重复使用该EIB。
结果
根据方案中提供的说明，多位实验人员均可轻松构建 TD Drive。在完成驱动器开发（n = 4）后，使用8只动物开展了完整的预实验。另有一批8只动物接受了植入手术，并进行了实验数据采集。由于这些动物的数据分析尚未完成，因此仅将其纳入生存分析，而未纳入其他分析（如靶向性或组织学分析）。植入手术在动物到达后2周进行（见 图3A 用于初步实验的目标位置）。植入手术采用常规外科手术方法进行，持续时间约为3小时。由一名经验丰富的外科医生完成初期植入，并可指导有经验及无经验的研究人员，经过2-3次手术后即可独立操作。
图 3：植入手术、睡眠数据与宽带活动。（A）示意图概述，显示颅骨开窗的目标位置（蓝色圆圈）和颅骨螺钉（绿色：EEG，蓝色：GND，灰色：固定螺钉；注意两个固定螺钉位于颅骨侧面）。（B）动物植入后在清醒和睡眠期间通过有线头戴装置连接的实物照片。（C）来自有线连接动物的前额叶皮层（PFC，前肢部）和海马（HPC，Ca1）的睡眠数据示例，分为REM睡眠（含θ波）和非REM睡眠（含δ波、纺锤波和涟波）。Y轴：微伏，X轴：秒。该数据可用于睡眠分期，或振荡事件的检测与分析。（D）清醒动物中无线记录的宽带活动示例（左侧噪声较大的通道未连接）。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：植入物耐久性、delta波检测及组织学结果。（A）植入物在两轮长期实验中的生存曲线。值得注意的是，在第85天，n = 8的动物已完成实验，计划进行灌注。（B）信号稳定性的数据示例。图中显示了在记录日（约每周3天）海马通道中delta波检测次数的变化。每只动物的检测结果均随睡眠量呈现正常波动，但信号及检测结果未表现出随时间的总体漂移。（C）代表性组织学切片，显示一只大鼠的双侧靶向效果。左列：左半脑；右列：右半脑。AP坐标表示所示脑片的前后坐标，箭头指示靶向区域的损伤位置。放大倍数：1.6x。请点击此处查看该图的放大版本。
所有动物术后恢复良好，并耐受了植入物（图3B）。额叶和压后皮层电极被固定，而海马电极束则可移动。海马电极束植入的背腹向深度为 2 mm，并在术后恢复的两周内根据睡眠适应期间的实时信号监测进行调整，以最大化覆盖海马区（HPC）。在8只动物中的7只，至少在一侧半球成功到达所有目标位点（命中率见表2，代表性组织学结果见图4C）。清醒和睡眠状态下的记录均成功完成，包括在记录箱中进行的有线记录，以及在较大迷宫中进行的无线记录（示例数据见图3C、D）。动物可保留植入物约2个月，之后个别动物开始脱落植入物；然而，大多数动物一直保留植入物至实验结束，即植入后第85–100天（图4A）。在此期间，局部场电位（LFP）保持稳定，如示例分析中检测到的delta振荡所示（图4B）。信号在时间上存在正常变异，但在任何记录的脑区（包括CA1区的锥体细胞层）均未出现系统性漂移。建议实验在术后10–15周内结束。所有EIB均得以回收。
我们主要应用该植入物来测量学习及其他干预措施引起的睡眠阶段和睡眠振荡。例如，口服大麻二酚（CBD）如何影响脑区之间振荡的发生率和相干性（参见 Samanta 等人20）。
| 参数 | 最小值 (mm) | 最大值 (mm) |
| medioLateralSite1 | 0.75 | 2 |
| medioLateralSite2 | 1.5 | 5 |
| medioLateralSite3 | 0.75 | 2 |
表1：手动设定的控制记录位点内外侧坐标的参数限制概览。
| 半球 | PFC | RSC | CA1锥体神经元 |
| 右 | 8 of 8 | 8 中的 5 | 8 中的第 6 个 |
| 左侧 | 8 of 8 | 8 中的 7 | 8 中的 7 |
表2：8只动物预实验的命中率。 在8只动物中的4只，所有电极均被正确放置。然而，在8只动物中的7只，至少在一个半球的所有脑区均被准确定位（仅1只大鼠未命中CA1锥体层）。
补充图1：TD Drive 架构。（上）使用 Intan RHD32 头级时 TD Drive 的通道映射概览。（下）线束配置的额外示意图。请点击此处下载该文件。
补充图2：TD驱动器在构建过程中多个阶段的额外图片。 请点击此处下载该文件。
补充文件 1：TD Drive 植入的示例方案。 具体操作步骤和靶向位置需根据作者的研究问题及所在机构的政策进行调整。请点击此处下载该文件。
讨论
本文介绍了一种可调节的植入装置，可用于自由活动大鼠的双侧对称多区域金属丝电极记录。
通过更改预设参数来轻松调整植入体是TD Drive设计的动机之一。在力求最大化参数调整灵活性的同时，参数之间固有的相互关系必然会对这种适应性施加一定的限制。默认情况下，前后方向的参数不设限制，这些坐标由各记录位点之间的逻辑相互作用以及驱动体的整体尺寸决定。所有记录位点的内外侧坐标参数则受到手动设定的限制（见表1）。在众多参数选项背后，存在大量设计特征之间的相互作用。这些相互作用在某些条件下可能会变得不协调。理想情况下，所有可能的参数值组合都应是有效的。然而，考虑到TD Drive更为复杂的设计，决定将内外侧坐标限制在已测试的范围内。原则上，选择超出测试范围的坐标是可行的。但不建议进行此类更改，因为这可能导致设计完整性受损，且在保持超出限制的坐标的同时恢复设计完整性可能需要CAD建模经验。这是驱动体生产便捷性与灵活性之间权衡的固有结果——更大的自由度确实会使驱动体的参数定义更加复杂，并可能导致过于精细且不符合预期的结果（例如，驱动体设计的微小变化即需制作不同的EIB）。
TD Drive 的此次实现中，参数选择依据当前实验人员的偏好而定。例如，选择增加 TD Drive 基座的高度，以方便手术期间的植入操作，代价是最终植入物略高。然而，该植入物仍远小于带有可独立移动的四极电极的驱动装置，并且动物对其耐受良好。用于固定驱动装置的两个基座（"c" 在 图 2E) 被刻意放置在中心平面，与大鼠颅骨的中线缝合线平行。这将记录位置限制在内外侧坐标范围内 > 0.75 mm。在解剖结构上，矢状窦位于中线以下，通常也对开颅手术的范围施加了类似的限制。TD驱动器的当前设计是在Autodesk Fusion中完成的。尽管这是目前最先进的参数化三维计算机辅助设计程序之一，并且在发表时确实为学术用途提供免费许可，但该程序的商业性和基于云的性质可能会影响设计文件的自由获取。因此，有必要将该设计迁移至真正的开源参数化CAD软件。21，例如 FreeCAD，可能在未来的迭代中是必要的。
TD Drive 手术可在 2-3 小时内完成。导线的目标位置通过立体定位标记（PFC：+3.5 AP，靠近中线；HPC：-3.8 AP，±2.5 ML；RSC：-5.8，靠近中线），参考这些位置放置螺钉电极、接地电极（GND）以及用于增强稳定的额外颅骨螺钉。尽管 TD Drive 模板提供了立体定位坐标，但聚酰亚胺管放置的不精确性以及使用刚性较低的导管材料可能会导致电极位置出现微小偏差。因此，建议钻取较小的颅骨开窗（而非使用与导向管匹配的 0.5 mm 直径钻孔），以应对这种位置变异。在本手术中，为 RSC 和 HPC 目标区域钻取一个较大的单一颅骨开窗。对于 PFC 和 RSC，选择将导线束以固定深度植入。PFC 导线束包含两条不同深度的导线，用于记录前边缘皮层和前扣带皮层的信号。HPC 导线束可移动，由三条不同高度的导线构成，便于到达 Ca1 锥体层及辐射层；其中最短的一条导线可用于记录后顶叶皮层（PPC）。在手术过程中，当最长的电极导线推进至目标深度（即脑表面下方 2 mm）时，对海马 Ca1 区的定位效果最佳；术后两周内通过实时信号检测进行微调，仅需小幅调整即可适应个体差异及术后脑组织肿胀。
在大鼠中使用大型植入物（例如四极超驱动器）存在的一个问题是植入物稳定性可能下降，导致动物丢失植入物。对于TD驱动器，个体失败案例在植入2个月后因稳定性下降而出现（16只动物中有3只）。因此，建议TD驱动器用于预期最长持续8周的实验。我们证明，在此时间段内，信号是稳定的——即使是精确的海马锥体层记录——并且不会出现影响局部场电位（LFP）记录的系统性漂移或显著晃动。实现这种长期稳定性的因素之一是使用多个颅骨螺钉（见图3A）。在某些情况下，使用的颅骨锚定螺钉数量增加可能会提高感染风险22。然而，这种情况可能主要与头部固定的大鼠相关，因为在这些动物中，头部固定装置对头帽及相连锚定螺钉的反复应力可能导致植入物退化，从而促进感染。另一个增加植入失败风险（并可能引起行为动物不适）的因素是植入物的重量。完整的TD驱动植入物（包括锚定螺钉和牙科水泥）重量约为7 g，其中3D打印部件和EIB约占总重量的一半。由于TD驱动器重量较低（不足其他大型四极超驱动器的1/3），过重的植入物不太可能是TD驱动器失败的重要因素。通常，实现稳定且无感染植入的主要因素是无菌手术操作，以及覆盖在植入物、锚定螺钉和颅骨上的牙科水泥具有良好的粘附性23。我们仅评估了TD驱动器在局部场电位记录方面的应用，未尝试获取单细胞单位活动。尽管我们预计该植入物总体上足够稳定以支持此类记录，但在不同记录会话中持续追踪同一神经元单位可能需要优化穿梭装置的稳定性，例如通过优化穿梭导轨（图2E中的"b"）。在其他记录位点增加可移动穿梭装置，将可进一步使用可移动的金属丝电极，这是确保单位记录中更优长期信号质量的首选方法。
TD Drive 的总组装时间约为 3 小时，手术时间约为 2–3 小时，介于四极超驱动装置与更简单、可调性较低的多导丝植入装置之间，提供了一种折中方案24。通过选定的目标区域，使用 6 组导线实现了来自 10 个脑区的记录。与其他用于不可移动导线束的植入装置相比，记录位点的对称布置带来了另一优势：若无需考虑侧化效应，同时在双侧半球植入导线可使成功靶向目标区域的概率以及每只动物的数据产出量提高一倍。在初步实验中，8 只动物中有 4 只双侧均成功靶向全部 5 个目标位点（包括前额叶皮层（PFC）中的前边缘（PRL）和前扣带（ACC）皮层、后压部皮层（RSC）、后顶叶皮层（PPC）以及海马（HPC）的 Ca1 锥体层），而 8 只动物中有 7 只至少在一侧实现了每个脑区的记录。因此，对于希望采用一种快速、易于构建的方法来记录局部场电位（LFP）的研究人员而言，该驱动装置尤为适用，尤其适用于需要较高动物数量的研究，例如睡眠研究。相比之下，许多高端的四极超驱动装置虽可记录单个神经元活动，但即使技术娴熟且经验丰富的研究人员每年也只能制作并植入 2–6 个装置，其中许多无法成功到达任何目标脑区。要达到更高的成功率需要多年的训练，即便如此，能够高效记录的动物数量仍然有限。
总之，TD Drive 提供了一种易于构建且快速成型的六束导线驱动装置，可轻松调整以容纳不同的记录位点以及其他植入物，如套管和光纤。
披露
TS 和 PvH 是位于荷兰奈梅亨的 3Dneuro 公司的员工。3Dneuro 公司共同开发并生产 TD Drive。
致谢
作者感谢Angela Gomez Fonseca为开发该驱动装置提供的灵感，以及所有参与动物预实验的学生，包括Milan Bogers、Floor van Ravenswoud和Eva Severijnen。本工作由荷兰研究理事会（NWO；交叉计划17619 "INTENSE"）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 mm 钻头 | 麦克马斯特 | 2951A38 | |
| 1.27 mm 间距互连 SIP/DIP 插座（Mill-Max） | Mouser 电子 | 575-003101 | 用于脑电图的组装与连接 &和 GND 螺丝 |
| 5分钟环氧树脂 | 野牛 | 市售的 | 普通市售环氧树脂 |
| 氰基丙烯酸酯胶水 | Loctite | 超级胶水-3 | |
| 脑电图导线 | Science Products GmbH | 7SS-2T | |
| 电极导线 | Science Products GmbH | NC7620F | |
| 乙醇 | LC | 用于驱动装置的标准术前消毒程序 | |
| 精细镊子（5） | FST | 91150-20 | 用于线束的制备与操作 |
| 表 3B | Formlabs | 使用3D打印机打印TD驱动器的自打印部件 | |
| 金针（小型） | Neuralynx, Inc. | 9885 | 将电极导线连接至EIB板 |
| 接地线 | Science Products GmbH | SS-3T/A | |
| 高密度连接器 | LabMaker GmbH/Omnetics | A79026-001 | |
| Lister Hoded大鼠 | 查尔斯河实验室 | Crl:LIS | 我们使用了到达时年龄为9至12周的雄性大鼠 |
| M1 黄铜嵌件 | 速卖通 | 市售的 | https://aliexpress.com/item/33047616164.html |
| M1 螺纹孔 | 麦克马斯特 | 2504A33 | |
| M1x16 螺钉 | Bossard | 1096613 | |
| M1x3 不锈钢螺钉 | 螺钉及其他配件 | 84213_14985 | |
| M2.5×5 聚酰亚胺螺钉 | 螺钉及其他部件 | 7985PA25S_50 | |
| 矿物油 | 麦克马斯特 | 1244K14 | |
| 指甲油 | 埃托斯 | 市售的 | 用于对脑电图（EEG）和接地（GND）导线进行颜色编码 |
| 美纹纸胶带 | 伽马 | 市售的 | 用于线束制备 |
| 手摇钻夹 | 麦克马斯特 | 8455A16 | |
| 绘图纸 | 坎松 | 市售的 | 用于线束制备 |
| 聚酰亚胺管 | 亚马逊 / 小部件 | TWPT-0159-30-50 | AWG，0.0159" ID，0.0219" OD，0.0030" 壁，30" 长度 |
| RHD 32通道头部固定装置，带加速度计 | Intan Technologies, LLC | C3324 | 在睡眠箱中进行固定记录 |
| RHD 3英尺（0.9米）标准SPI电缆 | Intan Technologies, LLC | C3203 | 从换向器到前置放大器 |
| RHD 6 英尺（1.8 米）标准 SPI 电缆 | Intan Technologies, LLC | C3206 | 从 OpenEphys 盒到换向器 |
| 带法兰滑环 | Adafruit | 1196 | 换向器：直径22 mm，12根导线 |
| 焊剂 | Griffon S-39 50 ml | 市售的 | 用于脑电图焊接 & GND 螺丝 |
| 焊锡膏 | 亚马逊 | B08CBZ5HC5 | |
| 不锈钢M2螺母 | 麦克马斯特 | 93935A305 | |
| 拴系式记录装置 | OpenEphys | 采集板 | |
| 无线记录仪 | SpikeGadgets | miniLogger 32 | 用于任务中的无线记录 |
| 无线记录装置 | SpikeGadgets | 主控单元（MCU），包括分线板和射频收发器 | 用于任务中的无线记录 |
参考文献
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