快速分离无颗粒细胞的斑马鱼I期卵母细胞

摘要

本方案描述了一种改良的快速分离方法，用于获取无颗粒细胞的纯净斑马鱼I期卵母细胞，从而为卵母细胞特异性研究提供了一种便捷的技术手段。

摘要

卵母细胞发育的研究在发育生物学中具有重要意义。斑马鱼（Danio rerio）被广泛用作研究从卵母细胞到胚胎早期发育过程的模式生物。在斑马鱼中，卵母细胞被单层体性颗粒细胞所包围。然而，将颗粒细胞与卵母细胞分离一直是一个挑战，因为获得纯净的卵母细胞对于精确分析至关重要。尽管已有多种方法被提出用于分离处于不同发育阶段的斑马鱼卵母细胞，但现有技术尚无法完全去除颗粒细胞，限制了仅针对卵母细胞进行基因组分析的准确性。在本研究中，我们成功建立了一种快速且高效的方法，用于分离纯净的I期斑马鱼卵母细胞，同时彻底清除颗粒细胞污染。该技术有助于生化和分子分析，尤其适用于探索卵母细胞特异性的表观遗传学和基因组结构特征。值得注意的是，该方法操作简便，可最大限度减少对卵母细胞的损伤，为后续研究和分析提供了切实可行的解决方案。

引言

斑马鱼是发育生物学中最重要的模式系统之一。近年来，大量研究利用斑马鱼作为模型，研究从卵母细胞到胚胎的重要生物学事件和调控过程。这些研究包括卵母细胞发育与成熟¹、母源基因功能²、母源-合子转换的调控³以及广泛的组学分析⁴。

颗粒细胞是包裹并滋养卵巢卵泡内发育中卵母细胞的体细胞^5,6，在这一发育过程中发挥关键作用。当原始生殖细胞（PGCs）发育为卵原细胞时，其周围会形成单层颗粒细胞⁷。卵母细胞与其周围的颗粒细胞以及外部的膜细胞共同构成成熟卵泡⁸。由于生殖细胞与体细胞之间存在根本性差异，获取纯净的卵母细胞样本至关重要，尤其是在进行基因组相关分析时。

在斑马鱼的卵泡结构中，颗粒细胞的直径通常仅有几微米⁸，强调颗粒细胞与卵母细胞之间的密切相互关联⁹这种紧密的关联性由于颗粒细胞在数量和体积上均存在显著差异，给完全分离带来了挑战 与 卵母细胞（数百个颗粒细胞相对于单个卵母细胞）^10,11即使仅有一个颗粒细胞的微量污染，也可能干扰针对卵母细胞的下游分析。因此，对于聚焦于基因组和表观遗传学特征的研究，必须去除颗粒细胞。

由于具有明确的形态学标准，可根据卵母细胞的直径区分其各个发育阶段¹¹。根据形态学和核型特征，斑马鱼卵子发生过程可分为五个阶段¹¹。I期卵母细胞（直径7–140 µm）涵盖从减数分裂开始至减数分裂I早期的卵母细胞。关键特征是这些卵母细胞呈透明状，可通过透射光观察到位于中央的细胞核（图1Ai）。II期卵母细胞（直径140–340 µm）逐渐变得泡沫化并呈半透明状。随着滤泡增大及皮层颗粒增殖，中央的生发泡变得难以辨认¹²（图1Aii）。III期卵母细胞（直径340–690 µm）逐渐积累卵黄蛋白原，新鲜滤泡变得愈加不透明（图1Aiii）。在IV期卵母细胞（直径690–730 µm）中，减数分裂继续进行，染色体进入减数分裂II中期并在此停滞（图1Aiv）。V期卵母细胞（直径730–750 µm）已完全成熟，准备排卵^7,11（图1Av）。

根据上述各个阶段的独特特征，已有研究提出一种方法，通过使用含有胶原酶I、胶原酶II和透明质酸酶的消化液处理斑马鱼卵巢，随后经特定孔径的细胞筛过滤，从而分离第I至第III阶段的卵母细胞¹³。然而，尽管该方法能够获得不同发育阶段的卵母细胞，却无法完全将卵母细胞与颗粒细胞分离。其他研究人员也提出了分离颗粒细胞与卵母细胞的方法，但这些方法主要依赖机械手段，容易造成卵母细胞损伤，耗时较长，且难以获得足够数量的卵母细胞用于分析^14,15。

鉴于现有方法的局限性和特定的研究需求，本研究旨在建立一种程序，以彻底分离卵母细胞和颗粒细胞，并获得足量且纯净的I期卵母细胞用于分析。在参考方法¹³的基础上，我们采用了一种改良的消化缓冲液（见材料表），该缓冲液更为温和，有助于卵母细胞的分散以及颗粒细胞的解离。随后，将卵母细胞通过细胞筛过滤，再经洗涤和进一步的显微筛选，从而获得大量纯净的I期卵母细胞。

方案

所有斑马鱼的饲养和操作均严格遵循相关国家和/或地方动物福利机构所规定的动物护理指南。鱼类的饲养与操作已获得当地主管部门及四川大学华西医院动物伦理委员会的批准（批准号：20220422003）。斑马鱼卵巢中含有多种发育阶段的卵母细胞，成年斑马鱼卵巢中各发育阶段均存在。然而，本研究选用幼年斑马鱼，原因是成年鱼卵巢中以晚期卵母细胞（II-III期）为主，这些细胞体积大且不透明。相比之下，幼年斑马鱼的卵巢扁平且细长，主要由I期卵母细胞组成（图1B）（图1B）。先前研究表明，成年与幼年斑马鱼在早期卵子发生过程中的形态特征高度一致，支持使用幼年斑马鱼的可行性¹³。下文所述步骤如图2所示，详细描述了从解剖到获得纯净I期卵母细胞的分离过程。为进一步参考，本研究中使用的试剂、缓冲液和设备列于材料表中。

1. 卵巢解剖

1. 选择标准体长（SL）在 10 mm 至 15 mm 范围内的多条雌性斑马鱼。
   注意：标准体长（SL）指从吻端到尾基部的长度（单位为毫米），是筛选合适个体的可靠标准。建议使用受精后 5 至 7 周（wpf）、标准体长在 10 mm 至 15 mm 之间的幼鱼进行本实验。幼年斑马鱼的卵巢主要由早期卵母细胞构成，有利于轻松获取 I 期卵母细胞（图 1B）。
2. 将幼年雌鱼置于冰水（0–4 °C）中实施安乐死。
   注意：为确保有效安乐死并最大限度减少斑马鱼在过程中所受痛苦，请遵循以下操作：使用温度计确认冰水温度处于 0–4 °C 范围内，迅速将斑马鱼转移至冰水中，并在鳃盖运动停止后继续维持至少 10 分钟^16,17,18。
3. 用吸水纸吸干鱼体表面多余的水分。
4. 在体视显微镜下对斑马鱼进行解剖，步骤如下：
   1. 使用显微剪刀沿鳃盖后缘剪去头部，沿泄殖腔处剪去尾部。将中间躯干转移至含有 2 mL L-15 培养基（含 L-谷氨酰胺）的 35 mm 培养皿中。
   2. 在 L-15 培养基中解剖中间躯干。沿腹部中轴切开，去除内脏和鳔。
      注意：斑马鱼的内脏相互连接，因此可夹住肛门区域附近的后肠并提起，即可完整移除整个内脏组织。
   3. 用镊子将两侧卵巢从腹部剥离。清除附着在卵巢上的脂肪组织、鳞片及其他体组织。
      注意：卵巢表面覆盖有脂肪组织，建议将其一并去除，以避免对卵母细胞造成机械损伤。
      警告：操作镊子时需小心，防止受伤。

2. 消化

1. 将卵巢转移至含有 2 mL Kinger 细胞解离液的 6 孔板中，在 28.5 °C 下孵育 2–3 小时 。每 30 分钟轻轻摇动 6 孔板一次，以促进细胞分散。
   注意：使用镊子将卵巢分离成小块组织，以提高消化效率。消化时间因样本而异；需定期在体视显微镜下观察，当大量 I 期卵母细胞分散出现时，应及时终止消化。Kinger 细胞解离液为工作液，可直接使用。分装后可在 −20 °C 长期稳定保存，使用前于低温（4 °C）条件下解冻。
2. 向消化液中加入预热至 28.5 °C 的 L-15 培养基，以终止消化反应。

3. 过滤

1. 将100 µm细胞筛置于6孔板的另一个孔中，加入L-15培养基，确保培养基液面高于滤膜。
   注意：I期卵母细胞的理论直径小于140 µm。然而，直径较大的卵母细胞仍可能通过细胞筛。因此，本步骤选择使用孔径小于目标细胞直径的细胞筛。可根据具体实验需求调整筛网尺寸。
2. 用移液器将消化液通过细胞筛过滤。等待1–2分钟，直至所有I期卵母细胞均通过筛网，然后移除细胞筛。确保卵母细胞在整个转移过程中始终浸没于液体中。
   注意：将卵母细胞保持在培养基中有助于维持其完整性和最佳状态。若卵母细胞长时间暴露于空气中，可能会因干燥而受损，从而影响最终的分离效率。转移卵母细胞通过细胞筛时，应将移液器尖端置于液面以下，避免以悬浮方式直接加入。

4. 清洗

1. 使用移液器去除多余的培养基。加入 4 mL 新鲜的 L-15 培养基，轻轻重悬卵母细胞。静置 1–2 分钟后，吸除上清液。
   注意：应使用具有低吸附特性的器械，以防止对卵母细胞造成损伤。
2. 重复步骤 4.1 共 5–6 次，直至无其他杂质存在。
   注意：洗涤过程中操作务必轻柔，以避免卵母细胞受损。尽管在前步洗涤后可获得大量 I 期卵母细胞（每条斑马鱼可获得约 200–400 个 I 期卵母细胞），但样品中仍可能混有细胞碎片、其他发育阶段的卵母细胞，或由晚期卵母细胞破裂形成的微小颗粒。此外，由于酶消化不完全，部分卵泡细胞可能仍附着在某些卵母细胞表面。因此，对于基因组测序等对纯度要求较高的应用，需采取额外步骤以筛选出完全洁净的卵母细胞。为此，请继续执行步骤 5 和步骤 6。

5. 质量控制筛选

1. 将洗涤后的I期卵母细胞转移至含有新鲜L-15培养基的35 mm培养皿中。
2. 在显微镜下（放大倍数等于或超过10倍）使用可精确操作的工具（如钝头注射针）去除细胞碎片、其他时期的卵母细胞以及被颗粒细胞黏附的I期卵母细胞。
   注意：此步骤需要实验人员具备耐心，但可确保获得干净且完整的卵母细胞。
   警告：操作注射针时需小心，避免造成伤害。

6. 通过核染色进行验证

注意：为了进一步纯化分离的卵母细胞，使用 Hoechst 33342 染色以鉴定并去除在前一步骤中可能遗漏的附着有颗粒细胞的单个卵母细胞。

1. 向 L-15 培养基中加入终浓度为 5 µg/mL 的 Hoechst 33342，室温孵育 10 分钟。
2. 在紫外激光激发下，通过荧光显微镜观察 Hoechst 荧光。
   注意：Hoechst 通常在紫外光区激发，激发波长一般为 310 至 360 nm。建议在此过程中使用 80 倍至 100 倍的放大倍数。采用自动曝光模式。激发波长和曝光时间可根据具体显微镜型号和个人需求进行调整。
3. 使用针头小心挑出不符合预期标准的卵母细胞。
   注意：观察细胞时，卵母细胞中央可见较大的核染色质。若卵母细胞表面附着颗粒细胞，则可在卵母细胞边缘看到细小而明亮的细胞核（图 3）。需在显微镜下将其挑除。
4. 用 L-15 培养基反复彻底清洗卵母细胞，以去除多余的 Hoechst 染料。
5. 将鉴定为 I 期的卵母细胞直接用于后续提取，或在液氮中速冻后于 −80 °C 保存。
   警告：操作液氮和超低温冰箱时，须佩戴防护面罩和低温手套。

结果

图1展示了成年和幼年斑马鱼中观察到的卵巢形态，呈现了处于不同发育阶段的卵母细胞，以作为参考。图1A以图示方式展示了各发育阶段卵母细胞的形态和大小，从初级生长期（I期）开始，到排卵期卵子（V期）结束。图1Ai-v展示了与卵母细胞I至V期相对应的直径。图1B（左图）显示了幼鱼（6周龄，标准体长1.5 cm）的卵巢图像。值得注意的是，幼年卵巢呈现出明显的分叶状结构，主要特征是大量透明的I期卵母细胞，并伴有少量II期卵母细胞。I期卵母细胞的高丰度使其易于观察和获取。右图展示了成年鱼（6个月龄）卵巢的形态，其中可见处于不同发育阶段的卵母细胞。然而，卵巢中以不透明的晚期卵母细胞（II-III期）为主。

图2 展示了从解剖到获得纯净I期卵母细胞的代表性操作流程。图3 展示了使用参考方法和改良方法所获得的I期卵母细胞。经Hoechst染色后，在紫外光下卵母细胞和颗粒细胞的细胞核均呈现蓝色荧光。在使用参考方法获得的图像中（图3A），卵母细胞表面被大量染色的颗粒细胞核密集包围；相比之下，采用改良方法分离的I期卵母细胞（图3B）则完全暴露且表面洁净，无颗粒细胞核染色现象。

我们的研究结果证明了所提出方法在分离I期卵母细胞方面的有效性。硬骨鱼类卵母细胞的发育过程表现出若干共同特征⁷。为评估该方法的跨物种适用性，我们进一步对其他鱼类物种进行了分析。实验所用雌性泥鳅购自当地市场，按照相同操作流程分离出早期卵母细胞（直径 <100 µm）。泥鳅的卵巢组成同样包含多个发育阶段的卵母细胞混合物，其卵母细胞形态和大小在该发育阶段与斑马鱼极为相似。如图4A所示，成年雌性泥鳅的卵巢主要由不透明的晚期卵母细胞构成，其间散布着透明的早期卵母细胞。在卵母细胞表面可观察到一层清晰的单层颗粒细胞。与我们在斑马鱼中的观察结果一致，直径小于100 µm的泥鳅卵母细胞对应于双线期之前的发育阶段。图4B展示了通过改进方法获得的清洁泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）卵母细胞。与斑马鱼卵巢相比，泥鳅卵巢更难解离。经过6–7小时的消化后，更多的早期卵母细胞得以分离。尽管如此，这一调整后的方法仍成功获得了理想的洁净且裸露的卵母细胞。斑马鱼属于鲤科，而泥鳅则归类于鳅科。这两个科在分类学上亲缘关系较远，但其卵巢发育阶段和形态却极为相似，表明该方法可普遍适用于多种鱼类卵母细胞的分析。

图1：不同发育阶段斑马鱼卵巢和卵母细胞的代表性图像。（A）各发育阶段（St）卵母细胞的形态和大小。i-v 表示从第I至第V阶段卵母细胞的图像及其直径。比例尺 = 200 µm。（B）成体与幼体斑马鱼的卵巢形态。比例尺 = 500 µm。请点击此处查看此图的放大版本。

图 2：从解剖到获得纯净的I期卵母细胞的分离流程代表性图像。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：通过两种方法获得的 I 期卵母细胞。（A）通过参考方法分离的 I 期（St I）卵母细胞。（B）通过改进方法分离的 I 期卵母细胞。卵母细胞和颗粒细胞的细胞核经 Hoechst 染色，并用紫外光激发。比例尺 = 100 µm。BF = 明场。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：通过改良方法获得的池塘泥鳅早期卵母细胞。（A）池塘泥鳅卵巢及卵母细胞的代表性图像。i、ii表示不同放大倍数下的池塘泥鳅卵巢，iii–iv表示池塘泥鳅的早期卵母细胞。比例尺：i（500 µm）；ii（200 µm）；iii、iv（100 µm）。（B）从池塘泥鳅中分离的早期卵母细胞。卵母细胞和颗粒细胞核经Hoechst染色，并用紫外光激发。比例尺 = 100 µm。BF = 明场。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本研究建立了一种分离纯净且无颗粒细胞污染的I期卵母细胞的方法，可用于后续分析（特别是基因组学分析）。与参考方法¹³相比，采用该方法获得的I期卵母细胞形态完整、数量充足，且无其他体细胞污染，适用于多种后续研究与分析。此外，与其他机械分离方法^14,15相比，该改进方法操作更简便，有助于获取更多数量的卵母细胞，并可避免卵母细胞损伤。

此外，除了能够有效分离I期斑马鱼卵母细胞外，该方法还可应用于塘鳢，表明其在多种鱼类中具有广泛的适用性。为了研究颗粒细胞污染对基因表达和表观遗传分析的影响，我们对采用参考方法和改进方法获得的卵母细胞进行了RNA测序（RNA-seq）和CUT&Tag分析。尽管RNA-seq仅鉴定出少量差异表达基因，但仍检测到一些在颗粒细胞中特异性表达的基因（数据未显示）。分析还发现，不同方法分离的卵母细胞在组蛋白修饰方面存在显著差异（数据未显示）。这些结果凸显了该方法在准确进行基因表达和表观遗传分析时，完全分离卵母细胞与颗粒细胞的重要性。

在实施所提出的方法时，需注意以下几个方面：（1）选择合适体型的斑马鱼至关重要。这不仅能确保获得足够的卵母细胞，还能减少后续的洗涤步骤。斑马鱼体长（SL） <10 mm的个体无法提供足够的卵母细胞，因此需要更多数量的鱼来满足取样需求，从而增加繁育压力。相反，标准体长（SL）大于15 mm的斑马鱼逐渐形成第II-III期卵母细胞，其膜在消化反应中容易破裂。（2）使用较大个体时，受损卵母细胞可能导致细胞内容物泄漏，从而引起污染，在一定程度上抑制消化反应。在此情况下，建议移除旧的消化缓冲液，用L-15培养基清洗，然后加入新的Kinger's细胞解离液进行进一步消化。（3）若具备合适的设备，消化过程中进行振荡可增强细胞分离效果。

在步骤 3.1 中，较小的颗粒细胞可能随卵母细胞一起通过细胞筛网。然而，实际观察表明，最终收集的卵母细胞样本中不含颗粒细胞。除部分卵母细胞因消化不完全而残留少量颗粒细胞外，系统中未检测到其他经 Hoechst 标记的颗粒细胞。我们推测，由于颗粒细胞体积较小、质量较轻，可能持续悬浮于培养基中，并在后续多次洗涤步骤中被去除。此外，通过计算 Hoechst 染色后附着颗粒细胞的卵母细胞比例与洁净卵母细胞比例，对分离效率进行了定量分析。在含有 1000 个卵母细胞的样本中，观察到洁净卵母细胞率高达 98%。

尽管该方法具有诸多优势，但也存在一些值得注意的局限性。首先，该方法仅针对DNA或RNA提取、测序以及完整活细胞的即时检测进行了验证，而将其拓展至其他检测领域的可行性与可靠性仍有待验证。另一个局限性在于，该方法目前仅适用于分离I期卵母细胞，因为对其他发育阶段卵母细胞的分离效率不理想。因此，仍需进一步努力以提高该方法的效率和适用性。此外，未来的研究应着重探索该方法是否可用于高效分离其他发育阶段的卵母细胞，从而拓宽其应用范围。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
King's细胞解离液	PlantChemMed	PC-33689	King's细胞解离液在包装后可于-20 °C稳定保存，低温（4 °C）解冻后即可使用。可直接用于解离斑马鱼卵巢，最适温度为28.5 °C，时间约为2–3小时。可根据具体解离情况调整时间，适当缩短或延长（https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689）。
细胞筛（100 μm）	Falcon	352360
荧光显微镜	Zeiss	Axio Zoom.V16
镊子	Dumont	#5
玻璃毛细移液针	/	/	用打火机烧制钝化
Hoechst染料	Yesen	40732ES03
低吸附移液器吸头（10 μl）	Labsellect	T-0010-LR-R-S
Leibovitz’s L-15培养基（含L-谷氨酰胺）	Hyclone	SH30525.01
冰桶	/	/	使用冰水对斑马鱼实施安乐死
培养箱	WIGGENS	WH-01
幼鱼	/	/	受精后5–6周，标准体长[SL]为10–15 mm
塑料培养皿（35 mm）	SORFA	230101
体视显微镜	Motic	SMZ-161
组织培养板（6孔）	SORFA	0110006
Vannas弹簧剪	Fine Science Toosl	#15000-00