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基于DNAzyme 10-23的核酸识别纳米机器

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DOI：

10.3791/66461

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2024年2月9日

 ,  ,  ,  , 
1ITMO University, 2University of Central Florida

本文内容

摘要

基于脱氧核酶的纳米机器可用于核酸的高选择性和高灵敏度检测。本文以EB病毒片段的检测为例，详细描述了利用免费软件设计含有10-23核心的脱氧核酶纳米机器的实验方案及其应用。

摘要

基于DNAzyme的纳米机器（DNM）是一种由寡核苷酸构成的多功能结构，可用于检测DNA和RNA序列（分析物）。其功能包括对分析物的紧密结合、高选择性识别、通过多次催化切割荧光报告底物实现荧光信号放大，以及吸引荧光底物以增强传感器响应。这些功能单元被连接至共同的DNA骨架上，以实现协同作用。切割RNA的10-23型DNM具有以下特征 与非催化杂交探针相比，灵敏度得到提升。DNM 的稳定性以及底物识别几率的增加得到了保障 通过一个双链DNA片段， 一种瓦片。DNA纳米机器（DNM）能够区分折叠RNA和双链DNA中单核苷酸差异的两种分析物，并且其检测灵敏度比其他无蛋白质的杂交探针高出约1000倍。本文阐述了DNA纳米机器活性在诊断应用中的原理，综述了DNM的设计、组装及其应用。 在核酸检测实验中。

引言

最早的方法之一 核酸检测是 选择性寡核苷酸与待分析的RNA或DNA序列之间的互补结合。该方法采用核酸片段（探针），其可与目标DNA或RNA分析物形成沃森-克里克碱基对1随后通过多种技术将复合物与分析物及未结合的探针区分开来。某些方法，例如Northern印迹法， 原位 杂交或qPCR，均基于 现象 互补结合2最常见的杂交探针存在两个显著缺陷：灵敏度低（仅能达到微摩尔至纳摩尔水平）以及对单核苷酸变异（SNV），包括点突变的选择性差。由于解决这两个缺陷的策略彼此冲突，该问题需要采用复杂的策略来应对3为了实现最佳选择性，检测用寡核苷酸应足够短，以便与错配的分析物形成不稳定的杂交体。然而，这类较短的寡核苷酸无法紧密结合靶向核酸并解开其二级结构，因此常常难以产生可检测的信号。在生物RNA或双链DNA（dsDNA）中检测富含CG的片段尤其具有挑战性。另一方面，较长的探针对单核苷酸变异（SNV）不敏感。3为打破僵局，二元探针的概念已被提出 已开发4.

二元传感器将单个检测探针分为两部分，并对这两个片段进行特化，使其中一段较长，以解开发夹结构或侵入双链DNA；另一段二元探针片段则保持较短，以对错配碱基保持敏感，从而实现对单核苷酸变异（SNV）的检测。当两个二元传感器片段连接在一起时，便会产生产生信号4完整的复合物可以被可视化 通过 FRET5，分子信标探针6,7或具有过氧化物酶样活性的G-四链体8,9,10，否则为RNA切割11,12,13 DNA酶。以10-23 DNA酶为核心构建的二元传感器已有大量报道，已被用于检测单链核酸片段 人工合成11或单链扩增产物14,15无需扩增也可实现检测，例如在从细胞培养物中提取的16S rRNA的情况下，因为该分子在细胞中含量丰富。12,16. 基于10-23 DNA酶核心的二元传感器也可用于非核酸类物质的检测，例如铅离子17然而，灵敏度低仍然是二元10-23 DNA酶传感器的主要缺点之一， 多种方法，包括级联反应18 或其他信号增强方法19，已开发出以解决此问题。然而，上述技术显著增加了传感器组件的成本和不稳定性，因此尚未投入实际应用。

本研究中描述的实验采用基于10-23 DNA酶的DNA纳米传感器，称为DNA纳米机器（DNM）20,21。这些结构包括二元传感器，以及 (1) 位于二元探针两侧的DNA辅助因子，可解开结构化区域并 侵入双链DNA； 和(2) 一个DNA瓦片结构，将所有DNM组分紧密地固定在一起，从而提高信号形成的概率（图1）。总体而言，基于10-23 DNA酶的DNM可将检测限（LOD）降低至皮摩尔（picomolar）范围21；可用于检测细胞裂解液中的16S rRNA22，或在无需扩增的情况下报告病毒RNA的存在23,24。同时，DNM对单核苷酸变异（SNV）仍具有敏感性，甚至可用于杂合生物中等位基因的基因分型25。DNM方法可作为任何类型扩增技术的补充手段，用于产物的可视化，或在复杂混合物中高选择性地识别产物。与传统的TaqMan探针和分子信标探针不同，DNM无需对样品加热，因此可用于终点检测方案，使整体检测更加经济高效。

本文描述了数字纳米镜（DNM）的in silico设计与开发，并演示了DNM的组装及其功能表征的操作流程。本研究采用了一段合成的爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr virus, EBV）片段，对应病毒DNA（OR652423.1）的13972-14154位点（参见材料清单）。

方案

1. DNM 设计

  1. 选择目标基因组中的一个独特区域。
    注意：本研究使用了爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr virus，EBV）基因组中位于13972-14154位置的区域（OR652423.1）。
  2. 为所选片段的扩增设计一对引物，例如， 通过 UGene 中嵌入的 Primer3 工具26.
  3. 打开 UNAFold 网络工具27 （参见 材料表）并插入选定区域。更改 将折叠温度设为55 °C，离子条件设为250 mM单价离子和200 mM Mg2+.
    1. 打开该ssDNA片段的二级结构结果，选择一个稳定的发夹结构。在DNA纳米机器的结合位点处定位 非结构化区域，或 alternatively，发夹结构的环区，以实现对目标更强的结合。
  4. 如果目标分析物位点折叠成茎环结构，则按如下方式放置臂1和臂2：确保臂2结合茎的一侧、环以及第二侧茎的3-5个核苷酸；臂1结合第二侧茎的一段片段。
  5. 打开 DinaMelt 工具28 （参见 材料表）并分析这些臂段及其反向互补序列的序列。使用 DinaMelt 工具确保 Tm 2号和3号臂的解链温度高于65 °C：至少比检测温度（55 °C）高10 °C。
    1. 保持 Tm 1号臂的温度至少应比反应温度（55 °C）高1-3 °C，以实现高识别选择性 待实现29.
  6. 将臂1和臂2序列与DNA酶核心的两半部分以及F-亚基结合片段组合13.
  7. 使用 UNAFold 分析设计的 DNA 链的二级结构27.
    注意：55 °C（检测温度），200 mM Mg2+，250 mM 一价离子（HEPES、Na+，K+).
    1. 仅当折叠 ΔG 低于 -4 kcal/mol 时才使用该设计。尽量避免过长的富含 CG 的序列。若二级结构过于稳定，可引入突变至 Arm 区域以提高折叠 ΔG30. 或者，将臂3置于距离臂2约2-3个核苷酸的位置，是改变臂3的另一种策略 序列以避免形成稳定的分子间结构。
  8. 为DNA瓦片片段创建一个与Arm 3等长的随机序列。将Arm 3序列与DNA瓦片序列组合 通过 (dT)4-6 或乙二醇（例如三乙二醇（TEG）或六乙二醇（HEG））。本实验中展示的DNM版本使用了(dT)6.
  9. 将臂2与步骤1.8中选定的DNA瓦片片段的互补序列连接 通过 一个连接子。
  10. 使用 UNAFold 网络应用程序分析所设计 DNA 链的二级结构。确保每条 DNA 链在 55 °C 下的折叠能量高于 4 kJ/mol，并避免出现较长的富含 CG 的序列。建议优先调整 DNA 瓦片序列。
  11. 使用任意可用的矢量图形软件绘制结构图。本文使用 BioRender 和 Pixelmator Pro 进行可视化（参见 材料表）。在5'端验证准确性>每条链的3'方向。
    注意：从可靠的商业供应商处获取序列。

2. DNM 的功能测试

  1. 缓冲液与试剂的配制
    1. 制备 由50 mM HEPES（pH 7.5–7.8）、50 mM NaCl、150 mM KCl 和 200 mM MgCl 组成的反应缓冲液2. 用……填充 去离子水加至 50 mL。
    2. 制备 Dzb-Tile 和 Tile-Arm3 寡核苷酸的 10 µM 等分试样。在 RNase-free 水或无菌去离子水中配制 1 µM 的 Dza 溶液、100 µM 的 F-sub 溶液，以及 1 nM、10 nM 和 100 nM 的分析物溶液。寡核苷酸序列的详细信息见于 材料表.
  2. DNM组装
    1. 使用前将寡核苷酸溶液完全解冻。轻轻弹击混匀（切勿剧烈涡旋）。使用微量离心机快速离心数秒，使溶液沉降至管底。
    2. 在0.5 mL微量离心管中，将Dzb-Tile和Tile-Arm3各1 µM加入200 µL反应缓冲液中混合。
    3. 轻轻混匀试管，并离心收集溶液。
    4. 用石蜡膜包裹已关闭的管盖。或者，使用螺旋盖管。
    5. 将试管放入盛有沸水的500 mL烧杯中，孵育2分钟，然后关闭加热器，让温度过夜自然冷却。
    6. 制备12%非变性PAGE胶：混合1 mL 10×TBE缓冲液、3 mL 40%丙烯酰胺:双丙烯酰胺（AA:BA）、去离子水至总体积10 mL、50 µL过硫酸铵（APS）和5 µL四甲基乙二胺（TEMED）（参见 材料表将混合物转移至凝胶板中，使其聚合。
    7. 将1 µL每种样品（即组装好的DNM、Dzb-Tile和Tile-arm3）与1 µL 4x上样染料混合后，上样至凝胶中。
    8. 将胶板放入电泳槽中，加入1x TBE缓冲液，以80 V电压电泳90分钟。
    9. 用溴化乙锭染色凝胶，并使用凝胶成像系统进行观察（参见 材料表).
  3. LOD 检测
    1. 在反应缓冲液中配制 160 µL 的 200 nM F-sub 溶液。此步骤用于评估底物稳定性的基础背景值。
    2. 在反应缓冲液中配制7份预组装的DNM、F-sub和Dza混合物，每份160 µL，其中DNM和Dza浓度均为20 nM，F-sub浓度为200 nM。在7个离心管中，将第1管作为空白对照，用于评估DNAzyme核心的自发组装情况。
    3. 将分析物加入第2-7号试管中，终浓度分别为1 pM、10 pM、100 pM、200 pM、500 pM和1000 pM。
    4. 轻轻混匀，离心收集液体，并分类 将溶液分成三份，每份 50 µL，放入 黑色96孔板。使用光学透明膜密封平板。
    5. 将培养板置于55 °C水浴中孵育1小时。离心收集培养板中的液体。
    6. 在 525 nm（λ）处测定荧光ex = 495 nm）。计算每个数据点的平均值和标准差。
    7. 将含有 F-sub 和 DNM 的试管信号值除以仅含 F-sub 的试管信号值得到空白对照与基础信号的比值。确保该比值在 1.1–1.5 范围内。
    8. 通过将含有 F-sub、DNM 和分析物的试管信号除以仅含 F-sub 和 DNM 的试管信号，计算信噪比。若信号高于背景平均值加三倍标准差，则判定为真阳性。
    9. 重复实验两次，并确保分析重复之间的标准偏差小于0.5。

结果

第一个实验的目的是展示DNA纳米机器（DNM）在分析物合成片段之前的组装过程。将所有构成DNM的DNA链加入反应缓冲液中，并在烧杯中进行组装。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native PAGE）评估组装后的DNM复合物的大小和均一性。非变性PAGE结果显示：第1泳道为与分析物结合的组装DNM，第2和第4泳道为两条单独的DNM链。如果DNA纳米机器未能成功组装，则会出现2条或3条独立的条带，而不是单一的低迁移率条带（见图2A中第2泳道）。

本实验方案的第二部分涉及 DNM 性能的功能表征及靶核酸的检测。本研究中使用了 EBV 13972-14154 的合成片段。具体操作为：将预先组装的 DNM 片段与 Dza 一同在 55 °C 条件下，与不同浓度的分析物孵育 1 小时。测量了两个对照荧光信号值：一是不含分析物时预先组装的 DNM 片段与 Dzb 的信号（空白对照），二是来自 F-sub 的背景信号（基础对照）。每组实验进行三次技术重复。为进行统计分析，还独立重复了三次生物学重复实验。值得注意的是，本研究中镁离子浓度高于文献中通常报道的水平30。高浓度的镁离子会增强所有检测管中的信号，因为它可促进 F-sub 的自发性切割31。反应缓冲液组分的优化是在技术开发的初期阶段完成的，后续开展的每一项研究中均未重复此优化过程。

孵育1小时后，使用荧光分光光度计测量样品的荧光信号（参见材料表）。为确认DNM对目标DNA的检测效果，我们比较了含有目标DNA的传感器与阴性对照（未添加任何分析物）的荧光信号。信号与空白值之比（含分析物孔的平均相对荧光单位与不含分析物孔的平均相对荧光单位之比）应不低于1.5，以确认检测成功32。空白值与基础值之比（无分析物时传感器响应的荧光值除以仅含F-sub对照的荧光值）应在1.1–1.5范围内；该比值可通过调整DNM和Dzb的浓度进行优化（通常每种成分的浓度范围为5–20 nM）。在本实验中，检测限（LOD）定义为趋势线与空白均值加三倍标准差交点所对应的浓度（图2B）。若LOD <100 pM，则认为DNM有效33。若LOD高于100 pM，则需重新设计DNM。

DNAzyme核心结构示意图、DNA瓦片构建、序列相互作用、分析物结合过程。
图1：本研究中使用的三臂DNM结构。 三条寡核苷酸Dza、Dzb-Tile和Tile-Arm3分别标记为绿色、蓝色和紫色。 请点击此处查看该图的放大版本。

凝胶电泳DNA分离（A）和荧光强度与浓度关系图（B）分析结果。
图2DNM 表征 (ADNM 的组装 通过 12% 聚丙烯酰胺凝胶中进行天然电泳，80 V 电泳 1 小时，使用 50 bp+ DNA 标准分子量标记。B60分钟孵育后合成DNA的检测限 55 °C水平线表示阈值，垂直线表示检测限。数据以三次独立测量的平均值加减一个标准差表示。 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

DNA机器的设计原理简单直接，但需要具备设计 杂交探针或功能性DNA纳米结构的相关经验。为尽量减少可能的二级结构并简化DNM对二级结构的侵入，应尽可能缩短分析物片段的长度。CG含量最好低于60%，以避免形成稳定的分子内结构。DNM的成功组装需通过缓慢降温实现。在某些情况下，DNM可在试管中自发组装，从而可省去退火步骤。DNM组装可在热循环仪中以0.1–0.3 °C/min的速率进行，也可在大量冷却水中完成。若DNM组装效果不佳，建议在退火过程中进一步降低温度变化速率。

为测定检测限（LOD），至少需要七个分析物浓度点：0 pM 分析物浓度（即 F-sub + DNM）以及六个不同的分析物浓度，例如在 1 nM 至 1 pM 范围内，以观察线性依赖关系（图 2B）。通常，为获得更高的准确性，会使用超过七个浓度点。每个浓度点应进行三次技术重复（每次 50 µL）。因此，每个浓度点的总体积为 160 µL（额外预留 10 µL，以补偿移液误差）。

DNM技术相较于其他基于杂交的系统对单核苷酸变异（SNVs）具有更高的灵敏度。对单核苷酸变异的高选择性在以下方面可能具有重要意义 某些目标，例如 与细菌基因分型相关的点突变鉴定22 或植物中杂合子的筛选25非特异性分析物需要采用相同的实验步骤。为避免对SNV产生任何误解 低浓度分析物时，我们建议将实验中未知分析物的信号与其对照的信号进行比较 相同浓度下已知完全互补分析物的信号。

该方法可成功应用于单链DNA、miRNA、折叠RNA或双链DNA扩增子。长链RNA或双链DNA片段，尤其是 富含CG的序列可能需要配备4-6个分析物结合臂的DNA纳米机械（DNM），而对于二级结构不稳定（折叠自由能ΔG高于-10 kcal/mol）的单链分析物，两个分析物结合臂已足够。该方法可用于PCR、SDA或LAMP扩增产物的检测。DNM可用于不经扩增直接检测经煮沸处理的细菌培养样品中的rRNA，无需提取总RNA。22,34,35该技术在浓度低至飞摩尔水平或在侧翼区域CG含量高于65%的双链DNA片段中可能效果不佳。CG含量可通过例如Biologics CG含量计算器进行估算。36我们建议添加钩状部件37 以优化DNP设计，提高灵敏度，或在高CG含量情况下将双链DNA（dsDNA）转化为单链DNA（ssDNA）。该方法的另一局限性在于DNP对样本质量敏感，因此核酸需经过仔细纯化。这一点同样适用 因此建议验证每批寡核苷酸供应品的稳定性和纯度，以确保DNA纳米机械（DNMs）寡核苷酸序列的质量。与传统扩增技术相比，DNMs的设计需要专门技能，且截至本文发布之时，设计过程几乎完全依赖人工。在将DNMs应用于实际的DNA或RNA样本之前，需先对其在合成片段上进行一些初步测试，从而延长了整个检测系统的开发周期。

该方法具有多功能性，可采用不同类型的报告探针。该技术可实现多重检测38，若将F-sub替换为可形成G-四链体的底物，则可转化为比色法检测形式39。由于聚合酶的存在可能导致链延伸过程中产生错误，因此该方法相较于传统的实时PCR、数字PCR以及其他依赖核酸酶的技术（如SHERLOCK和DETECTR）具有优势，原因在于其无需使用易失活的蛋白酶，且检测过程稳健、操作简便40,41。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢 Ekaterina V. Nikitina 慷慨提供 EBV 的基因组 DNA。Muhannad Ateiah、Maria Y. Berezovskaya 和 Maria S. Rubel 感谢俄罗斯联邦科学与高等教育部（项目编号 FSER-2022-0009）以及“优先 2030”计划的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 离心管BiofilCFT011015
100 bp+ DNA MarkerEvrogenNL002
100-1000 µL 移液器KirgenKG-Pro1000
10-100 µL 移液器KirgenKG-Pro100
1-10 µL 移液器KirgenKG-Pro10
20-200 µL 移液器KirgenKG-Pro200
2-20 µL 移液器KirgenKG-Pro20
4x 上样缓冲液EvrogenPB020
丙烯酰胺 4KAppliChemA1090,0500
过硫酸铵Carl Roth2809447
BiorenderBiorenderhttps://www.biorender.com
双丙烯酰胺Molekula22797959
硼酸TechSnabH-0202
ChemiDoc 成像系统BioRad12003153
Costar 96 孔黑色聚苯乙烯板CorningCOS3915
DinaMeltRNA Institutehttp://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php
EDTAAmrescoAm-O105
溴化乙锭BioLabMixEtBr-10
HEPESAmrescoAm-O485
氯化镁AppliChem131396
Mini Protean Tetra 电泳槽BioRad1658001EDU
10 µL 移液器吸头KirgenKG1111-L
1000 µL 移液器吸头KirgenKG1636
200 µL 移液器吸头KirgenKG1212-L
Pixelmator ProPixelmator Teamhttps://www.pixelmator.com/pro/
氯化钾Carl Roth1782751
PowerPac Basic 电源BioRad1645050
无 RNase/DNase 水Invitrogen10977049
PCR 板密封膜SovtechP-502
氯化钠VektonHCh (0,1)
Spark 多功能酶标仪TecanSpark- 10M
T100 PCR 仪BioRad10014822
TEMEDMolekula68604730
三羟甲基氨基甲烷AmrescoAm-O497
UNAFoldRNA Institutehttp://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php
水浴锅LOIPLB-140
所用寡核苷酸
分析物：Evrogen直接订购，标准脱盐纯化
GAGCACTTGGTCAGGCACACGG
ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG
TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG
GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG
CGGACTACGCCTTCGTTGC
Tile-Arm3：Evrogen直接订购，标准脱盐纯化
CCG GGCTGCTGTGCCATTTT
TTGCTGACTACTGTCACCTCT
CTGCTAGTCT
Dzb-Tile： AGACTAGCAGAGAGGTGACAG
TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC
CGCTGACCACAACGAGAGGAA
ACCTT		Evrogen直接订购，标准脱盐纯化
Dza： TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT
GTCCGTGTGCCTGACCA		Evrogen直接订购，标准脱盐纯化
F-亚基寡核苷酸： AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU
CCCTGGGCA-BHQ1		DNA-Syntez直接订购，HPLC 纯化

参考文献

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基于DNAzyme 10-23的核酸识别纳米机器
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