通过腰池注射在幼年大鼠中进行鞘内载体递送

摘要

本文描述了一种对幼年大鼠腰池进行注射的外科手术方法。该方法已用于基因治疗载体的鞘内递送，但预计也可适用于多种其他治疗剂，包括细胞和药物。

摘要

基因治疗是一种强大的技术，可通过向患者体内递送新基因来治疗疾病，无论是引入功能性基因、失活毒性基因，还是提供一种其产物可调节疾病生物学过程的基因。治疗性载体的递送方式有多种，从用于全身递送的静脉输注，到直接注射至靶组织。对于神经退行性疾病，通常希望将转导偏向大脑和/或脊髓。靶向整个中枢神经系统的侵入性最小的方法是将药物注射至脑脊液（CSF）中，从而使治疗剂能够到达中枢神经系统的大部分区域。将载体递送至脑脊液中最安全的方法是腰椎鞘内注射，即通过穿刺针进入脊髓的腰池。该技术也称为腰椎穿刺，在新生期和成年啮齿类动物以及大型动物模型中已得到广泛应用。尽管该技术在不同物种和发育阶段之间具有相似性，但围绕鞘内腔的组织在大小、结构和弹性方面的细微差异，要求在操作方法上做出相应调整。本文介绍了一种在幼年大鼠中进行腰椎穿刺以递送腺相关病毒血清型9载体的方法。在此过程中，将25–35 µL的载体注入腰池，并使用绿色荧光蛋白（GFP）报告基因评估每次注射所产生的转导分布情况。文中还讨论了该方法的优势与挑战。

引言

近年来，随着美国食品药品监督管理局（FDA）批准了针对脊髓性肌萎缩症、视网膜营养不良、凝血因子IX缺乏性血友病、癌症等多种疾病的病毒介导基因疗法，基因治疗的前景终于得以实现^1,2,3,4。目前还有 countless 其他疗法正处于研发阶段。基因治疗旨在将治疗性基因递送至患者的细胞中，该新基因的表达产物可弥补内源性缺陷基因所缺失的功能、抑制有毒基因的表达、杀死癌细胞，或提供其他有益的生物学功能。

对于影响中枢神经系统（CNS）的疾病，通常希望将基因治疗载体直接递送至靶组织。非全身性给药方法具有两个优势：一是可最大限度减少因外周转导引起的脱靶副作用，二是可显著减少在靶组织中实现足够转导水平所需的载体用量⁵。

向中枢神经系统（CNS）递送基因治疗载体有多种方法。实质内注射是指将载体直接注射到脊髓或脑组织中，可用于向特定区域递送。然而，对于许多疾病而言，需要实现中枢神经系统的广泛转导。这可以通过将载体递送至脑脊液（CSF）⁵来实现，脑脊液是流经并环绕脑和脊髓的液体。将载体递送至脑....

方案

本研究经埃默里大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。本研究采用斯普拉格-道利大鼠（年龄28-30天，体重约90-135 g，雄性和雌性）。

1. 载体的制备

1. 在实验开始时，将AAV9载体（参见材料表）置于冰上解冻。
2. 将含有载体的微量离心管在台式离心机中短暂离心，以确保所有液体均位于管底。
3. 轻轻弹击微量离心管，确保溶液充分混匀。

2. 恢复笼的制备

1. 将一个干净的笼子放在电热毯上（参见材料表），使笼子仅有一半与电热毯接触。
2. 将电热毯的温度设置为约37 °C。

3. 手术平台的准备

1. 将等温垫（见材料表）在微波炉或水浴中加热至 39 °C，使其内容物变为液态。
2. 将等温垫放置在手术平台上，并用干净的吸水实验台垫覆盖。

4. 动物准备

1. 使用异氟烷在透明箱中对大鼠进行....

结果

为了评估注射技术的准确性，使用染料台盼蓝作为治疗药物的替代物。该染料可快速与蛋白质结合，因此通常保留在其被注射入的结构内。这意味着染料可能无法准确预测治疗药物在注射后的实际分布情况；它仅用于显示注射是否准确。当成功注入腰池时，台盼蓝会结合硬脊膜，使脊髓周围区域呈现蓝色。然而，若穿刺针未能穿透硬脊膜，染料则会停留在硬膜外腔。此时，硬脊膜以及周围组织（骨表面、连接椎板的韧带和肌肉）均会被染成蓝色。这些染色模式肉眼即可清晰辨别。

如果仅对脊髓和脊柱进行横向切割，很难评估注射操作是否正确。相反，建议使用咬骨钳从L5椎板开始，向头侧方向进行椎板切除术。在此过程中必须注意不要损伤硬脑膜。使用解剖显微镜可使该过程更为简便。图1提供了成功注射与部分成功注射的对比示例。成功注射时，在拔出针头后，针道内几乎没有或完全没有染料回流现象。成功注射后，去除椎板以暴露脊髓，可见脊髓内部含有台盼蓝，但骨表面无染料分布（图1A）。此外，在成功注射后，脑干和小脑上也可观察到染料（

讨论

中枢神经系统（CNS）会受到多种疾病的影响。对于那些具有隐性单基因性质的疾病，例如脊髓性肌萎缩症，通过病毒载体递送功能正常的基因拷贝是一种具有吸引力的治疗策略。然而，血脑屏障（BBB）会阻止大多数经静脉给予的基因治疗载体进入脑组织¹¹。即使某些载体能够穿越血脑屏障，例如AAV9，也必须使用高剂量给药，以弥补因外周组织转导造成的载体损失¹²。年龄也是一个限制因素。随着年龄增长，人体对各种AAV血清型的环境暴露增加¹³，常常导致产生可中和治疗性载体的抗体¹⁴。因此，针对中枢神经系统疾病的基因治疗载体经静脉递送通常仅限于婴儿，而不用于成年后确诊的患者。

对于老年患者，将载体直接注射到脑脊液中可实现中枢神经系统的广泛转导，从而避开血脑屏障和已存在的抗AAV抗体¹⁵由于该方法具有靶向性，因此也可使用较低的载体剂量。在临床应用中主要有两种途径：（1）腰椎穿刺.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
200 µL 过滤吸头	MidSci	PR-200RK-FL	病毒移液
AAV9-GFP	Vector Builder	P200624-1005ynr	表达 GFP 的 AAV9 载体
带针可吸收缝线，涂覆 Vicryl 聚乳酸-羟基乙酸共聚物 910，FS-2，3/8 圆弧反向切割针，4-0 编织线	McKesson	J422H	缝合线
实验台垫	VWR	56616-031	手术
Braintree Scientific 恒温垫，8'' x 8''	Fisher Scientific	50-195-4664	维持体温
布托啡诺	McKesson	1013922	镇痛剂
缓释布托啡诺（1 mg/mL）	Zoopharma		长效镇痛剂
棉签	Fisher Scientific	19-365-409	清除血液
手术洞巾，小鼠用，透明塑料，12" x 12"，带粘性开窗	Steris	1212CPSTF	手术洞巾
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	11251-20	镊子
电热毯	CVS Health		CVS Health 系列 500 加长型加热垫
Eppendorf Research plus 单通道可调移液器，20–200 µL	Eppendorf	3123000055	病毒移液
精细剪刀	Fine Science Tools	14059-11	弯头手术剪
Friedman-Pearson 咬骨钳	Fine Science Tools	16121-14	椎板切除术
Halsey 持针器	Fine Science Tools	12001-13	持针钳
胰岛素注射器，超细针头，12.7 mm x 30 G，3/10 mL/cc	BD	328431	注射器
异氟烷	McKesson	803250	麻醉剂
异丙醇擦拭巾	Fisher Scientific	22-031-350	皮肤消毒
利多卡因，1%	McKesson	239935	局部麻醉
微量离心管：1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-137	注射器装液
聚维酮碘	Fisher Scientific	50-118-0481	皮肤消毒
手术刀柄 - #4	Fine Science Tools	10004-13	手术刀片夹持器
Sure-Seal 吸入麻醉诱导室	Braintree Scientific	EZ-17	麻醉箱
手术刀片 Miltex 碳钢，No. 11，无菌一次性独立包装	McKesson	4-111	#11 手术刀片
SYSTANE NIGHTTIME 眼膏	Alcon		眼膏
台盼蓝	VWR	97063-702	注射