高速原子力显微镜成像技术用于DNA三点星形结构自组装的光热非共振轻敲模式研究

摘要

本文展示了利用光热非共振轻敲（PORT）技术观察生物分子相互作用的成像方案，其中我们优化了成像参数，确定了系统局限性，并探究了在三叉星DNA结构组装成像中的潜在改进方法。

摘要

高速原子力显微镜（HS-AFM）是一种广泛使用的分子成像技术，因其能够在液体环境中的生理条件下实时观察单分子生物过程而备受关注。光热非共振敲击（PORT）模式利用驱动激光以受控方式使悬臂振荡。这种直接的悬臂激励在兆赫（MHz）范围内具有高效性。结合在时域力曲线而非共振振幅上运行反馈回路，PORT 实现了每秒高达十帧的高速成像，并可直接控制针尖与样品之间的作用力。研究表明，PORT 能够对精细的组装动态以及生物分子形成的结构模式进行精确监测。迄今为止，该技术已被应用于多种动态体外（in vitro）研究，包括本研究中展示的 DNA 三节点星形结构的组装模式。通过一系列实验，本方案系统地确定了 HS-PORT AFM 成像系统的最佳成像参数设置及其最终极限，并阐明了这些参数如何影响生物分子组装过程。此外，还探讨了驱动激光可能在样品及周围液体中引发的非预期热效应，尤其是在扫描局限于小区域时的情况。这些发现提供了宝贵的见解，将推动 PORT 模式在研究复杂生物系统中的进一步应用。

引言

高速原子力显微镜（HS-AFM）是一种快速发展的成像技术^1,2,3,4。该技术的成像速度足以使研究人员能够实时观察生物分子间的相互作用^5,6,7,8,9。光热非共振敲击（PORT）是一种类似于峰值力敲击^10,11、脉冲力模式^12,13或跳跃模式¹⁴的非共振成像模式。然而，与垂直振荡扫描器不同，PORT 仅通过聚焦在悬臂上的激发激光（通常靠近夹持点）使悬臂本身产生垂直振荡。悬臂因双金属效应而发生形变：经过功率调制的激发激光周期性地加热带有涂层的悬臂，由于悬臂材料与涂层材料的热膨胀系数不同，导致悬臂发生弯曲¹⁵。通过在每个振荡周期内周期性地开关驱动激光，而非使用完整的正弦波驱动，可以最大限度地减少悬臂和样品的加热⁵。

多年来，DNA 已被用于构建具有生物学相关性、结构趣味性和生物化学实用性的结构基序^{16,17,18,19,20}。此外，DNA 结构已被证明非常适合用于表征原子力显微镜（AFM）的成像质量²¹，并可用于评估高速 AFM 中的针尖效应²²。钝端 DNA 三点星形结构（3PS）已成为一种可编程的模型体系，用于研究在其他复杂生物系统中具有相似结构的分子的超分子组织方式¹⁹。此前，已通过高速原子力显微镜（HS-AFM）追踪了由钝端三聚体 DNA 单体自组装形成的晶格结构²³，最终这些结构会组织成具有六方有序的大规模网络。本研究中，采用 PORT 技术对 DNA 三点星形结构¹⁹的自组装过程进行成像，扫描速度足够快，可实时追踪自组装过程及其校正机制²⁴，同时确保对过程或样品的干扰最小。与所有高速 AFM 模式一样，成像质量、成像速度与对样品的非预期扰动之间存在权衡。通过选择适当的折中参数，可以更深入地理解超分子组装体的自组织模式。因此，本实验方案将采用类似的设置，以 DNA 3PS 作为模型体系，优化 PORT 技术特有的参数，从而实现在足够大的扫描尺寸下进行快速成像，同时将样品损伤降至最低。

方案

1. 样品和缓冲液

注意：本研究中使用的DNA瓦片是普渡大学Mao实验室开发的三点星形结构^19,25。本研究使用的所有寡核苷酸均购自Integrated DNA Technologies, Inc.。收集所需的材料和试剂。

1. 在退火缓冲液（5 mM TRIS、1 mM EDTA 和 10 mM MgAc₂）中，按 1:3:3 的摩尔比混合单链 DNA（ssDNA）（S1 为 0.6 µM，S2 为 1.8 µM，S3 为 1.8 µM）。DNA 结构单元的终浓度必须为 0.6 µM（以 3PS 的分子量 82020.3 g/mol 计，相当于 49 ng/µL）。
2. 将 DNA 溶液置于耐热容器中，加热至 80 °C，随后在 4 小时内从 80 °C 缓慢冷却至 20 °C。此退火过程有助于单链 DNA 寡核苷酸形成所需的双链 DNA 结构单元。
3. 为进行纯化，将退火后的 DNA 溶液上样至 3% 琼脂糖凝胶，以去除多余的单链 DNA 及任何非目标副产物。在含有 0.5× Tris-硼酸-EDTA（TBE）和 10 mM Mg(CH₃COO)₂ 的电泳缓冲液中，以 60 V 电压电泳约 2.5 小时。
4. 在凝胶上识别并定位含有 DNA 结构单元的条带。确保该条带已根据其大小迁移至特定位置。
5. 小心地从凝胶中切下含有 DNA 结构单元的条带。将凝胶片段放入凝胶回收离心柱中，于 3,000 × g 和 4 °C 离心 10 分钟，以提取 DNA 结构单元。
6. 使用离心浓缩装置，用退火缓冲液置换提取出的 DNA 结构单元中的缓冲液。在室温（或更低温度）下以 3000 × g 离心，直至浓缩液体积小于 100 µL。然后加入 300 µL 退火缓冲液，重复此步骤两次，以确保缓冲液完全置换。
7. 将 DNA 结构单元稀释至 6 nM，用于成像。使用分光光度计或其他适当方法准确测定并调整浓度。DNA 结构单元现已可用于成像。
   注意：本实验方案中所有缓冲液的 pH 值均为 8.0。三条序列的序列信息如下：
   S1: AGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGT
   AGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCC
   S2: ACTATGCAACCTGCCTGGCAAGCCTACGATGGACA
   CGGTAACG
   S3: CGTTACCGTGTGGTTGCATAGT

2. 悬臂梁尖端生长

1. SEM悬臂梁支架上的悬臂梁安装：确保悬臂梁清洁且无任何污染物。将悬臂梁安装到与SEM系统兼容的合适支架上。定制的悬臂梁支架设计可根据要求提供。
2. 气体注入：加热将用于气体注入系统的前驱气体（例如，用于非晶碳针尖生长的菲（C₁₄H₁₀）前驱体）。当真空度低于10^-5 mbar时，用前驱气体对注入管路进行10次、每次2秒的吹扫，以确保喷嘴管路中无残留空气（此操作需在通往电子枪腔室的阀门关闭的情况下进行）。
3. 针尖位置调整：使用扫描电子显微镜（SEM）定位悬臂梁末端。将悬臂梁支架倾斜至某一角度（例如本例中为11°），该角度应等同于悬臂梁安装至AFM悬臂梁支架后相对于样品表面所呈现的角度，以确保生长出的针尖在成像时垂直于样品表面。调节SEM的成像位置与聚焦，以清晰观察悬臂梁针尖区域，以便在其上生长尖锐的碳纳米针尖。
4. 聚焦电子束诱导沉积（FEBID）：
   1. 在选定软件（本例中为SmartFIB）中设置沉积参数，包括束流（I）、加速电压（V）、工作距离（WD）、放大倍数、曝光图形、剂量/沉积时间及驻留时间。以下参数用于生长具有优良机械性能的非晶碳针尖，可获得约130 nm的长度和2–4 nm范围内的针尖半径：
      选择点/圆点作为曝光图形
      WD = 5 mm
      I = 78 pA，V = 5 kV
      驻留时间 = 1 µs
      剂量 = 0.05 nC，沉积时间 = 0.64 s
      放大倍数 = 20000x
   2. 开始沉积过程：在向悬臂梁针尖区域注入前驱气体的同时，用电子束以点状辐照方式进行针尖生长，沉积完成后关闭气体。在本例中，SmartFIB软件在设定上述工艺参数后可自动完成该过程。
5. 生长后分析：进行沉积后的SEM成像，以检查新生成针尖的质量与特性（针尖半径与长度）。针尖生长完成后等待1–2分钟，确保所有前驱气体被充分抽除，避免在SEM成像过程中发生再沉积。随后将样品支架从SEM腔室中取出。
6. 悬臂梁再利用：若SEM系统同时配备聚焦离子束（FIB）功能，可使用低FIB束流（例如1 pA，以避免损伤悬臂梁）通过FIB刻蚀方式去除已损坏或污染的原有针尖。采用横截面形式从针尖顶端向基部进行刻蚀，以防止针尖坍塌，从而为重新生长新针尖创造条件。

3. HS-AFM 硬件

1. 成像装置由自行搭建的 PORT 探头^{5, 26}（图 1A）、高速扫描器²⁶（其样品盘顶部带有云母片）、兼容的控制器²⁷、具备高速成像所需高带宽的高压放大器、原子力显微镜（AFM）基座，以及配备控制上述设备所需软件的计算机²⁷组成。
   注意：本例中所使用的为开源组件，相关设计图纸可从洛桑联邦理工学院（EPFL）的生物与纳米仪器实验室获取^{27, 28}。也可参加关于构建 PORT 探头和控制器的工作坊²⁹，并下载使用基于 LabView 的软件。
2. 使用镊子小心地将超短悬臂梁（例如 AC10DS 或同等型号）放置在悬臂梁支架的弹簧夹下方。确保悬臂芯片固定牢固且稳定。
3. 通过左侧液体接入孔，使用注射器加入 50 µL 液体，如 图 1B 所示。在激发激光仍关闭的情况下，使用 AFM 探头上的三个专用旋钮（见 图 1A）将读出激光对准悬臂梁。可通过观察悬臂梁在白纸上的投影阴影，并使其总和最大化（即“阴影法”）来完成对准。随后，使用两个专用旋钮将激光光斑居中对准光电二极管。
4. 在“激发 VI”界面中勾选激发启用复选框，开启并调整驱动激光，使其激励悬臂梁产生振荡。将悬臂梁激发信号和悬臂梁偏转信号显示在连接的示波器上。若偏转振荡幅度过低（或不存在），可能是驱动激光远离悬臂梁所致。此时可采用阴影法，并关闭偏转激光以方便对准。使用 图 1A 所示的驱动激光调节旋钮，最大化振荡幅度。
5. 为调节 PORT 中的悬臂梁振荡幅度，需在软件相应控制项中输入发送至激光二极管控制电路的峰峰值电压（以下简称峰峰值交流输入），该操作在“激发 VI”中完成。为使激光二极管保持在导通状态并实现激光发射，还需向激光二极管控制电路施加直流电压（以下简称直流偏置输入），该操作同样通过“激发 VI”中的配置框完成。上述两项参数均会影响激光功率，可通过激光功率计测量，并用于调节悬臂梁的振荡幅度。
6. 确定可施加于悬臂梁的最大光热激发频率，该频率必须低于悬臂梁的共振频率。可通过热调谐或频率扫描确定共振频率。本研究所用悬臂梁（AC10DS）在液体中的共振频率约为 400 kHz（空气中为 1 MHz）³⁰，其准静态弯曲区域位于 300 kHz 以下⁵。因此，必须使用低于该限值的 PORT 频率（约 100–200 kHz）。
7. 在“激发 VI”和“扫描 VI”中分别将 PORT 速率和扫描速率等成像参数和设置调整至所需数值（本文所用参数详见图注）。在完成装置配置和成像参数设定后，进行所需的成像实验以观察和追踪分子相互作用。
   注意：由于 AC10DS 悬臂梁已不再销售，可能需要使用 Fastscan D 或 BioLever³¹ 等替代型号，直至出现等效产品。

4. 获得适当的相互作用曲线

1. 首先，在Z控制器VI中设置为接触模式，然后点击开始，以接触模式接近样品表面。
   1. 在此模式下，AFM针尖与样品直接接触。一旦到达表面，通过Ramp VI执行力-距离曲线，以获得悬臂偏转灵敏度校准。
   2. 同时，估算悬臂弹簧常数，可通过悬臂供应商提供的参数（精度较低）、使用干涉仪测量，或在偏转灵敏度校准后通过基于热调谐的校准获得。精确的悬臂校准对于实现准确的针尖-样品力控制至关重要。
2. 在Z控制器VI中点击上移，将Z压电完全从表面回缩，直至针尖无法接触表面后，将Z控制器VI切换至PORT模式，并在激励VI的复选框中打开激励激光。首先，在激励VI中将PORT模式设置为所需频率运行，在本实验中为100 kHz，使用AC10DS悬臂。
3. 记录悬臂在靠近但未接触表面时的自由振荡。然后，在针尖与表面接触的情况下，将Z控制器中的反馈设为开启并点击校正，以记录悬臂在间歇接触表面时的振荡，两者均以纳米为单位。将间歇接触状态下的振荡曲线减去自由振荡曲线，得到真实的相互作用曲线，并利用悬臂弹簧常数（本例中为0.1 N/m）将其转换为皮牛顿（pN）。

5. 高速原子力显微成像

1. 配制浓度为 10 mM 的 Mg(CH₃COO)₂ 溶液。使用 Hamilton 注射器将 50 µL 上述制备的 10 mM Mg(CH₃COO)₂ 溶液注入悬臂梁支架的流体通道中，形成一滴液体包裹住悬臂梁。
2. 通过点击 Z 控制器 VI 中的 开始 逐步接近表面。一旦检测到表面，将反馈设为 开启，并在 ORT 力曲线 VI 中找到相互作用曲线的峰值。找到能够实现良好追踪的最低力设定值（低于 300 pN，以避免损伤脆弱的生物样品）。
3. 在扫描 VI 中将 扫描尺寸 设置为 800 nm × 800 nm，扫描速率 设置为 100 Hz。通过点击扫描 VI 中的 帧（向下）箭头开始扫描，以检查表面质量。若发现任何污染，请在继续操作前清洁表面、悬臂梁和/或悬臂梁支架。
4. 扫描完成后，通过点击 Z 控制器 VI 中的 收回 将悬臂梁从表面撤回。使用 Hamilton 注射器从悬臂梁支架的孔中移除缓冲液，以防止死体积问题。
5. 根据本方案第 1 部分制备稀释的 DNA 3PS 溶液。将 50 µL 稀释后的 DNA 3PS 溶液注入悬臂梁支架的专用通道中。
6. 通过重复步骤 5.2–5.3 开始成像过程，在默认扫描速率为 100 Hz（256 行 × 256 像素）的条件下扫描 800 nm × 800 nm 的区域。初始扫描完成后，在扫描 VI 中根据指定参数调整成像尺寸和速度，以进行后续数据采集。
7. 在整个成像过程中，保持 Z 控制器 VI 的 设定值 框中针尖-样品相互作用的输入力设定值为实现良好追踪所需的最低水平（低于 300 pN），除非另有说明，以尽量减少对样品的损伤或扰动。对所有需要的样品区域重复此过程。

6. 图像处理

1. 设置运行定制的 Pygwy （Gwyddion 的 Python 工具）批处理代码的环境，确保系统中已正确安装 Python 及所有必要的库。更多信息可参考 Gwyddion 官方网站³²。这一步可确保代码顺利运行，并能访问所需的功能。
2. 打开定制的 Pygwy 批处理代码（可应要求提供）。这将启用图像处理与分析所需的工具和功能。
3. 开始图像处理，首先对图像执行水平中值线校正。此步骤旨在消除扫描线中存在的不规则性或伪影，确保后续处理基于准确的数据。在完成平面背景去除后，再进行线校正。使用划痕去除功能进一步优化图像，消除由外部因素引起的不需要的标记或缺陷，从而提升图像的整体视觉效果。
4. 通过调整颜色高度图来增强图像的可见性和对比度，确保感兴趣特征在图像中清晰可辨并突出显示。
5. 选择需要合成为视频的已处理图像，并确定所需的视频帧率。本例中设为每秒 7 帧（fps）。
6. 计算每帧的持续时间，并使用 Fiji（ImageJ）将处理后的图像合成为视频。确保帧率和帧持续时间设置正确。

结果

在本研究中，利用高速-探针振荡响应技术原子力显微镜（HS-PORT AFM）成功观测了DNA三向星形结构动态组装形成稳定岛状结构的过程。该技术使我们能够实时捕捉这些结构的组装过程。图2A、B分别展示了在100 kHz PORT频率（扫描范围为800 nm × 800 nm）下，以100 Hz和200 Hz行扫描速率获得的清晰图像。这分别对应每个像素包含3.9个和1.95个振荡周期。然而，若在不相应提高PORT频率以保证每个像素至少包含一个振荡周期的情况下进一步提高成像速度，图像质量将显著下降，如图2C所示（每个像素仅含0.78个振荡周期）。成像速度受限于悬臂探测表面时对针尖-样品作用力的精确控制能力，因为当表面形貌变化速率过快时，现有的采样速率已无法准确追踪表面动态。

除了设置足够高的 PORT 速率外，PORT 曲线还必须包含控制力所必需的信息。特别是流体动力学拖曳力和低检测带宽可能会掩盖施加的力。 图3 使用4096条曲线的平均值以减少噪声，显示悬臂在距样品表面不同距离及不同激发频率下的偏转情况。图中蓝色曲线表示 图3A （适用于 100 kHz PORT 速率）以及 图3D （针对500 Hz PORT速率）表示悬臂远离表面并在一个振荡周期内自由振荡（不与表面接触）时的悬臂运动情况。红色曲线显示悬臂在靠近表面振荡并间歇性接触表面以探测样品时的悬臂偏转情况。为了获得真实的相互作用曲线，从而得到针尖-样品相互作用，我们从红色曲线中减去蓝色曲线，得到 图3B，E分别为。用于非破坏性生物样本成像的清晰相互作用曲线示例如下所示： 图3B。这种构型实现了如图所示的良好成像质量 图3C，其中PORT速率为100 kHz。当我们逐渐增加激励频率接近悬臂梁共振频率时，在某些情况下，即使通过提高激励激光功率使悬臂梁产生足够大的振幅振荡以脱离表面，反馈控制性能仍会下降图3E）。如果 PORT 频率过于接近悬臂梁的共振频率，悬臂梁共振将限制悬臂梁动力学的时间响应。此时，悬臂梁的弯曲不再准确反映针尖-样品相互作用，所获得的相互作用曲线也会变得模糊不清。这会导致图像质量下降，如图所示 图3F.

在较高 PORT 频率下，由于高频时驱动效率降低³³，可能导致相互作用曲线性能下降，这目前是商用高速原子力显微镜（AFM）悬臂梁的主要限制因素之一。这种降低最终会在滚降区达到一个阈值，在该阈值下无法实现正常成像：振荡振幅可能不足以使探针脱离样品表面，导致针尖始终与样品接触，从而损坏样品结构。为了抵消因较高 PORT 速率引起的振幅下降，我们探索了增加激光功率的方法。我们使用了一个可达到更高激光功率的 PORT 探头，以便更清楚地观察这一效应。我们通过功率计测量了激发激光的激光功率，并将其分为直流（DC）和交流（AC）两个组分。总功率通过软件调节发送至激光二极管控制电路的峰峰值电压（峰峰值 AC 输入）和直流电压（DC 偏置输入）进行控制。图 4A 显示了随着峰峰值 AC 输入增加所导致的悬臂梁振荡峰峰值振幅的变化。正如预期，振荡振幅与 AC 输入值具有良好的相关性。需要注意的是，这些峰峰值振幅高于 PORT 成像中通常使用的水平。在对脆弱样品进行成像时，AC 振幅通常在 10–30 nm 量级。图 4B 显示了随着 DC 偏置输入增加所对应的悬臂梁振荡峰峰值振幅的变化。在整个 DC 偏置电压范围内，峰峰值振荡振幅基本保持恒定。我们将微小波动归因于检测过程中的非线性效应。图 4C 描述了随着峰峰值 AC 输入增加，激光功率中 AC 和 DC 组分的相应增加。图 4D 描述了随着 DC 输入偏置增加，激光功率中 AC 和 DC 组分的相应增加。

分别测试了增大峰峰值交流输入和直流偏置输入的影响，以确定它们对总激光功率和振荡幅度的各自影响。激光功率的增加会导致样品受损，可能是由于温度升高所致；而振荡幅度的增加则会增大对样品的冲击力⁵。仅增加峰峰值交流输入对总激光功率的提升影响较小，如图4C所示，但主要会增大悬臂梁的振荡幅度（从而增加冲击力），如图4A所示。增加直流偏置输入则对激光输出功率的提升作用更显著，如图4D所示，这会加热样品，但对偏转幅度的影响可忽略不计，如图4B所示。成像结果如图4E、F所示。图4E展示了峰峰值交流输入最低（左图，蓝色圆圈标注）和最高（右图，红色圆圈标注）时的DNA 3PS图像，后者因更高的作用力导致样品损伤。图4F展示了直流偏置输入最低（左图，蓝色圆圈标注）和最高（右图，红色圆圈标注）时的DNA 3PS图像，其中结构受到破坏。

图1：HS-AFM 装置示意图。（A）AFM 扫描器与基座上的 PORT 探头，图中显示了用于调节读出激光在悬臂上的（i）聚焦位置旋钮、（ii）位置旋钮、（iii）激光在光电二极管上水平位置的调节旋钮、（iv）激光在光电二极管上垂直位置的调节旋钮，以及（v）用于调节光热驱动激光在悬臂上位置的旋钮。（B）探头横截面视图中悬臂的特写，包含样品台，其中（vi）为固定悬臂的弹簧夹。液体注入通道以红色标示。请点击此处查看此图的放大版本。

图 2：在 100 kHz PORT 速率下使用 AC10 以不同扫描速率成像的 DNA 3PS 样品。 （A）100 Hz（每个像素 3.9 个振荡周期），（B）200 Hz（每个像素 1.95 个振荡周期），以及（C）500 Hz（每个像素 0.78 个振荡周期）。图像采集时的设定力不超过 350 pN。比例尺：200 nm。成像后采集了一条力-曲线以获得悬臂偏转灵敏度。 请点击此处查看此图的放大版本。

图3：在100 kHz和500 kHz PORT速率下的悬臂梁偏转、相互作用曲线及图像质量。（A）悬臂梁偏转（蓝色表示悬臂梁在接近但未接触表面时的自由振荡，红色表示悬臂梁间歇性接触表面时的振荡），（B）相互作用曲线，以及（C）100 kHz PORT速率下的相应图像质量。（D）悬臂梁偏转（蓝色表示悬臂梁在接近但未接触表面时的自由振荡，红色表示悬臂梁间歇性接触表面时的振荡），（E）相互作用曲线，以及（F）500 kHz PORT速率下的相应图像质量。图像采集线速为100 Hz。标尺：200 nm。成像后采集了一条力曲线以确定偏转灵敏度。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：交流输入电压峰峰值与直流偏置输入电压的影响。 增加（A）交流输入电压峰峰值和（B）直流偏置输入电压对悬臂梁峰峰值振荡的影响。增加（C）交流输入电压峰峰值和（D）直流偏置输入电压对交流与直流激光功率的影响。在最小（蓝色圆圈标出）和最大（红色圆圈标出）（E）交流输入电压峰峰值和（F）直流偏置输入电压下的成像质量。在增加交流输入电压峰峰值时，直流偏置输入电压保持在600 mV；在增加直流偏置输入电压时，交流输入电压峰峰值保持在200 mV。高功率配置下样品完整性受损。PORT速率为100 kHz，扫描线速率为100 Hz。比例尺：200 nm。成像后采集了一条力曲线以获得偏转灵敏度。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

在对精细的生物样品进行成像时，原子力显微镜中的离共振轻敲成像模式尤为有用，因为其能够直接控制针尖与样品之间的相互作用力¹⁰。其中，PORT模式因其可实现更高的振荡速率，从而支持更快的扫描速度而尤为突出。由于PORT模式仅通过激光直接激励悬臂，因此相较于传统的离共振轻敲模式，可在更高频率下实现激励，特别是在使用具有高共振频率的超短悬臂时优势更为明显⁵。然而，在将PORT模式用于高速原子力显微镜（HS-AFM）时，必须谨慎选择成像参数，以获得良好的成像质量。

如图2所示，若在提高扫描速率的同时未相应提高PORT速率，则会导致成像质量下降。首先，当PORT速率导致每个像素的振荡周期少于一个时，图像质量将显著降低。成像速度本质上受限于悬臂以适当的针尖-样品力控制探测表面的速率。在PORT中，反馈控制在每个振荡周期结束时离散地作用³⁴。这种有限的采样速率在反馈回路中引入纯延迟，从而限制了可实现的反馈带宽。如果形貌变化速率过快，超出PORT采样速率的跟踪能力，则反馈回路将无法准确检测或跟踪形貌。因此，为了在更高的表面速度下忠实地解析样品，必须提高PORT速率。然而，悬臂的共振频率本质上限制了我们可使用的最高PORT速率。当PORT速率接近悬臂的共振频率时，通过光学杠杆法测量的偏转信号将不再忠实地反映针尖-样品作用力。为了获得准确的针尖-样品相互作用曲线，悬臂的机械带宽和原子力显微镜（AFM）系统的电带宽都必须足够大，以检测偏转曲线中频率为PORT频率数倍的傅里叶分量。如果其中任一带宽过低，相互作用曲线将不再呈现单侧截止特征（图3A），而是呈现正弦行为（图3D），从而掩盖真实的针尖-样品相互作用（图3E）。这将导致成像过程中力控制性能变差（图3F）。因此，需要使用共振频率高、同时弹簧常数低的小型悬臂，以进一步提高PORT速率。此类高PORT速率和高扫描速度对AFM电子系统提出了挑战，要求精心设计的软件与电子系统，具备所需的高带宽和优化的数字信号处理策略。

与轻敲模式高速原子力显微镜相比，PORT 的一个优势在于其表面采样速度可以调节。在轻敲模式原子力显微镜中，表面采样速率由悬臂的共振频率决定。当 PORT 在远低于悬臂共振频率的条件下运行时，我们认为每次表面采样均能提供有效的数据点。因此，PORT 的检测带宽由 PORT 速率一半处的奈奎斯特频率决定。而在轻敲模式下，检测带宽为 f₀/2Q³⁵。随着 PORT 技术的最新进展，我们可以逐步将 PORT 速率提高至接近共振频率。在这种情况下，PORT 与轻敲模式几乎变得相同，因为在这些频率下，PORT 无法准确检测悬臂与样品尖端之间的相互作用，如图 3E所示。当在共振频率下运行时，PORT 相比轻敲模式更大的振幅反而成为一种劣势。因此，提高 PORT 成像速率的目标仍然是提高悬臂的共振频率，以确保 PORT 速率在远低于共振频率的范围内运行。

当我们提高 PORT 速率以实现更快的扫描速度时，将面临光热悬臂梁激发本身存在的另一个问题：在较高频率下，由于光热激发效率降低，振荡幅度会减小，最终可能需要增加激光功率，从而导致样品温度上升。提高 PORT 速率会使激光功率与振荡幅度之间的平衡更加困难，因为需要更高的激发功率来补偿降低的驱动效率，而这可能导致样品损伤。在较高的激光功率水平下，即使使用尽可能低的作用力设定值，我们也无法再清晰观察样品（见图 4E、F 的右侧面板）。因此，我们必须谨慎考虑如何增加悬臂梁的振荡幅度以及如何提高激光功率。我们可以通过调节两个参数来提高激光功率。第一个是峰峰值交流输入（peak-to-peak AC input），它控制发送给激光二极管的正弦信号，从而周期性地改变输出激光功率的强度；第二个是直流偏置输入电压（DC offset input voltage），它使激光二极管保持在导通状态，从而维持激光发射。增加第一个参数时必须同时增加第二个参数，因为发送给激光器的交流信号幅度增大时，必须提高直流电压，以避免跨越激光发射阈值。然而，只有峰峰值交流输入会影响悬臂梁的振荡幅度，如图 4A 所示；而直流电压不会引起振荡幅度的变化（见图 4B）。因此，如果我们希望实现正弦驱动，应将直流电压设置为刚好能使激光二极管处于激光发射状态的最小电压。另一种方法是，在每个振荡周期中周期性地关闭并重新开启激光二极管，而不是采用完整的正弦驱动方式⁵，以此来最小化样品加热。在光热激发中，通过在部分周期内关闭激光，可以更高效地实现驱动悬臂梁所需的温度振荡：关闭激光会使悬臂梁温度下降，从而引起其弯曲。这种方法将最小化传递给悬臂梁和样品的能量，从而降低周围环境的总体温度，减轻样品的热损伤。

本研究展示了HS-PORT中成像参数的限制，这些限制可防止样品受热损伤并实现适当的反馈控制。理解这些限制有助于充分发挥当前PORT原子力显微镜（AFM）方法的性能，从而更好地控制针尖与样品之间的相互作用，并有助于在这些测量中保持DNA结构元件的天然状态。得益于实现的高扫描速率和良好的反馈控制，PORT使我们能够获得DNA三向连接结构（3PS）及其相互作用的清晰且详细的图像^7,8,36。结合进一步提高成像速度和直接控制针尖-样品作用力的可能性²³，我们能够更精确地追踪生物分子组装体的生长与重组过程，并观察其详细的动态行为。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AC10DS	Olympus	BL-AC10FS-A2	已停止
Biometra Compact XS/S	Biometra GmbH	846-025-199	电泳  单位
Biometra TRIO	Biometra GmbH	207072X	用于退火的热循环仪
定制原子力显微镜系统	生物-纳米仪器实验室，跨学部生物工程研究所，工程学院，巴黎综合理工学院édé洛桑		可通过生物纳米仪器实验室获取
EDTA	ITW 试剂	A5097	在退火缓冲液中
激光功率计	Thorlabs	PM100D	手持式数字光学设备 功率与能量计控制台
Lively 3AP 电源，MP-310	主要科学领域	MP-310	电泳电源
MgAc2	ABCR GmbH	AB544692	在退火缓冲液中
TBE	赛默飞世尔科技	327330010	电泳运行缓冲液
TRIS	伯乐（Bio-Rad）	1610719	在退火缓冲液中