高速原子力显微镜成像技术用于DNA三点星形结构自组装的光热非共振轻敲模式研究

摘要

本文展示了利用光热非共振轻敲（PORT）技术观察生物分子相互作用的成像方案，其中我们优化了成像参数，确定了系统局限性，并探究了在三叉星DNA结构组装成像中的潜在改进方法。

摘要

高速原子力显微镜（HS-AFM）是一种广泛使用的分子成像技术，因其能够在液体环境中的生理条件下实时观察单分子生物过程而备受关注。光热非共振敲击（PORT）模式利用驱动激光以受控方式使悬臂振荡。这种直接的悬臂激励在兆赫（MHz）范围内具有高效性。结合在时域力曲线而非共振振幅上运行反馈回路，PORT 实现了每秒高达十帧的高速成像，并可直接控制针尖与样品之间的作用力。研究表明，PORT 能够对精细的组装动态以及生物分子形成的结构模式进行精确监测。迄今为止，该技术已被应用于多种动态体外（in vitro）研究，包括本研究中展示的 DNA 三节点星形结构的组装模式。通过一系列实验，本方案系统地确定了 HS-PORT AFM 成像系统的最佳成像参数设置及其最终极限，并阐明了这些参数如何影响生物分子组装过程。此外，还探讨了驱动激光可能在样品及周围液体中引发的非预期热效应，尤其是在扫描局限于小区域时的情况。这些发现提供了宝贵的见解，将推动 PORT 模式在研究复杂生物系统中的进一步应用。

引言

高速原子力显微镜（HS-AFM）是一种快速发展的成像技术^1,2,3,4。该技术的成像速度足以使研究人员能够实时观察生物分子间的相互作用^5,6,7,8,9。光热非共振敲击（PORT）是一种类似于峰值力敲击^10,11、脉冲力模式^12,13或跳跃模式¹⁴的非共振成像模式。然而，与垂直振荡扫描器不同，PORT 仅通过聚焦在悬臂上的激发激光（通常靠近夹持点）使悬臂本身产生垂直振荡。悬臂因双金属效应而发生形变：经过功率调制的激发激光周期性地加热带有涂层的悬臂，由于悬臂材料与涂层材料的热膨胀....

方案

1. 样品和缓冲液

注意：本研究中使用的DNA瓦片是普渡大学Mao实验室开发的三点星形结构^19,25。本研究使用的所有寡核苷酸均购自Integrated DNA Technologies, Inc.。收集所需的材料和试剂。

1. 在退火缓冲液（5 mM TRIS、1 mM EDTA 和 10 mM MgAc₂）中，按 1:3:3 的摩尔比混合单链 DNA（ssDNA）（S1 为 0.6 µM，S2 为 1.8 µM，S3 为 1.8 µM）。DNA 结构单元的终浓度必须为 0.6 µM（以 3PS 的分子量 82020.3 g/mol 计，相当于 49 ng/µL）。
2. 将 DNA 溶液置于耐热容器中，加热至 80 °C，随后在 4 小时内从 80 °C 缓慢冷却至 20 °C。此退火过程有助于单链 DNA 寡核苷酸形成所需的双链 DNA 结构单元。
3. 为进行纯化，将退火后的 DNA 溶液上样至 3% 琼脂糖凝胶，以去除多余的单链 DNA 及任何非目标副产物。在含有 0.5× Tris-硼酸-EDTA（TBE）和 10 mM Mg(CH₃COO)₂ 的电泳缓冲液中，以 60 V 电压电泳约 2.5 小时。

结果

本研究利用高速点扫描原子力显微镜（HS-PORT AFM）成功观测了DNA三向星形结构动态组装形成稳定岛状结构的过程。该技术使我们能够实时捕捉这些结构的组装过程。在图2A、B中，分别以100 Hz和200 Hz的扫描行速率（PORT速率为100 kHz，扫描范围为800 nm × 800 nm）获得了清晰的图像扫描结果，对应每个像素点分别包含3.9个和1.95个振荡周期。然而，若在不相应提高PORT速率以保证每个像素点至少包含一个完整振荡周期的情况下进一步提高成像速度，图像质量将显著下降，如图2C所示（每个像素点仅0.78个振荡周期）。成像速度受限于悬臂对样品表面探测的速率以及针尖-样品间作用力的精确控制能力，因为当表面形貌变化速率过快时，已超出表面采样速率的跟踪能力。

除了设定足够高的 PORT 速率外，PORT 曲线还必须包含控制力所必需的信息。特别是流体动力学阻力和较低的检测带宽可能会掩盖施加的力。

讨论

在对精细的生物样品进行成像时，原子力显微镜中的离共振轻敲成像模式尤为有用，因为其能够直接控制针尖与样品之间的相互作用力¹⁰。其中，PORT模式因其可实现更高的振荡速率，从而支持更快的扫描速度而尤为突出。由于PORT模式仅通过激光直接激励悬臂，因此相较于传统的离共振轻敲模式，可在更高频率下实现激励，特别是在使用具有高共振频率的超短悬臂时优势更为明显⁵。然而，在将PORT模式用于高速原子力显微镜（HS-AFM）时，必须谨慎选择成像参数，以获得良好的成像质量。

如图2所示，若在提高扫描速率的同时未相应提高PORT速率，则会导致成像质量下降。首先，当PORT速率导致每个像素的振荡周期少于一个时，图像质量将显著降低。成像速度本质上受限于悬臂以适当的针尖-样品力控制探测表面的速率。在PORT中，反馈控制在每个振荡周期结束时离散地作用³⁴。这种有限的采样速率在反馈回路中引入纯延迟，从而限制了可实.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AC10DS	Olympus	BL-AC10FS-A2	已停止
Biometra Compact XS/S	Biometra GmbH	846-025-199	电泳  单位
Biometra TRIO	Biometra GmbH	207072X	用于退火的热循环仪
定制原子力显微镜系统	生物-纳米仪器实验室，跨学部生物工程研究所，工程学院，巴黎综合理工学院édé洛桑		可通过生物纳米仪器实验室获取
EDTA	ITW 试剂	A5097	在退火缓冲液中
激光功率计	Thorlabs	PM100D	手持式数字光学设备 功率与能量计控制台
Lively 3AP 电源，MP-310	主要科学领域	MP-310	电泳电源
MgAc2	ABCR GmbH	AB544692	在退火缓冲液中
TBE	赛默飞世尔科技	327330010	电泳运行缓冲液
TRIS	伯乐（Bio-Rad）	1610719	在退火缓冲液中