我们描述了一种利用基于mini-Tn7的表达系统，在已构建的外排泵缺陷型鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）菌株中实现外排泵基因单拷贝染色体互补的简便方法。该精确的遗传工具可实现基因表达的可控性，这对于表征多重耐药病原体中外排泵的功能至关重要。
本文内容
摘要
摘要
Acinetobacter baumannii 因其对多种抗生素具有广泛耐药性，被认为是难以应对的革兰氏阴性病原体。深入了解其耐药机制对于设计新的有效治疗方案至关重要。然而，目前可用于研究 A. baumannii 的遗传操作工具十分有限，制约了相关机制的探索。本文介绍了一种基于染色体 mini-Tn7 系统的方法，用于在缺乏功能性 RND 型外排机制的 A. baumannii 菌株中实现单拷贝基因表达。单拷贝插入和可诱导的外排泵表达具有显著优势，因为将 RND 外排操纵子构建在高拷贝质粒上通常会对细菌细胞造成不良影响。此外，将重组 mini-Tn7 表达载体整合至外排敏感性增强的 A. baumannii 替代宿主染色体中，有助于避免其他外排泵的干扰。该系统不仅适用于研究尚未明确功能的细菌外排泵，还可用于评估靶向外排泵的潜在抑制剂的有效性。
引言
鲍曼不动杆菌 是一种世界卫生组织列为最高优先级的病原体，因其对所有类别的抗生素均具有耐药性1它是一种机会性病原体，主要影响住院患者、创伤患者或免疫功能低下者。 A. baumannii 在很大程度上逃避抗生素作用 通过 外排泵，其中最重要的是耐药-结节-分裂（RND）家族外排蛋白2了解这些外排泵的作用机制将有助于开发针对性的治疗方案。
一种特异性区分细胞过程的常用方法是通过基因操作。然而，可用于A. baumannii遗传学研究的工具十分有限，而且临床分离株通常对基因操作中常规用于筛选的抗生素具有抗性，这进一步增加了实验设计的复杂性3。在研究外排泵时遇到的第二个难题是，这些泵的表达受到严格调控——通常受未知因素调控，使得准确分离并归因特定功能于单一外排泵变得困难4。鉴于扩展研究工具的迫切需求，我们开发了一种基于mini-Tn7的单拷贝插入型诱导表达系统，该系统包含一个Flp重组酶靶点（FRT）盒，可用于移除筛选标记5,6,7（图1）。该系统最初为Pseudomonas构建8,9,10，我们将其用于在RND外排泵缺陷型A. baumannii菌株（ATCC 17978::ΔadeIJK,ΔadeFGH,ΔadeAB，以下简称A. baumannii AB258）中构建单拷贝外排泵互补株11。该方法能够一次仅研究一个外排泵，避免了质粒表达系统中常见的高拷贝表达对细菌细胞造成的过载，从而可在干扰最小、复杂性降低的情况下，更深入地了解每个外排泵的关键生理特性。
本文介绍如何利用mini-Tn7系统，通过为期9天的一系列简单步骤，将缺失的目的基因——RND外排泵adeIJK——回补至A. baumannii AB258的染色体中7。第一步是将克隆至基于mini-Tn7的插入质粒中的缺失外排泵基因，重新导入位于高度保守的glmS基因下游的单一attTn7插入位点（图2A和图3A）。该过程由一种非复制型辅助质粒（图2B）介导，该质粒编码Tn7转座插入所需的转座酶基因。第二步则使用一种切除质粒（图2C），通过Flp重组酶介导，移除两侧由FRT位点包围的庆大霉素抗性基因（图3B），从而构建无标记菌株。尽管该系统主要用于阐明RND外排泵在抗生素耐药性中的关键作用及其潜在抑制剂，但它同样适用于研究任何目的基因。
方案
1. 实验准备
- 纯化质粒 pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm9 插入质粒， 图2A) 与目的基因。
注意：此处的目的基因为 adeIJK最终质粒浓度应不低于100 ng/µL。 - 纯化辅助质粒（pTNS2）9 以及切除质粒（pFLP2ab)6 (图 2B，C分别为），理想情况下质粒DNA终浓度应≥100 ng/µL。
- 准备50 mL无菌超纯水和25 mL无菌LB（Lennox）培养基（见 材料表).
- 准备至少10个LB琼脂平板，每种均含有以下添加剂：普通型（无添加剂）、含50 µg/mL庆大霉素（Gm）、含200 µg/mL羧苄青霉素（Cb）（用于筛选） 通过 氨苄青霉素抗性基因）和 5% 蔗糖（参见 材料表).
- 将待用于插入的菌株划线接种于LB琼脂平板上，37 °C培养16–18小时。此处， A. baumannii 使用 AB258。
注意：本实验步骤应尽可能在无菌环境中进行，可使用本生灯或生物安全柜。所有耗材（移液器吸头、接种环、微量离心管等）均须无菌。
2. 培养物制备
- 使用无菌接种环或无菌木制接种棒，将一株 A. baumannii AB258 单菌落接种于无菌13 mL培养管中的4 mL LB肉汤培养基中。
注意：每份样品及其对照需使用一份4 mL培养物。根据所需样品数量相应增加培养物份数。 - 在37 °C条件下振荡培养过夜（250 rpm）。
- 将一瓶无菌蒸馏水（25–50 mL）置于4 °C环境中过夜，以备第3步使用。
3. 电转感受态细胞的制备
- 将所有无菌的1.5 mL微量离心管（每种培养物各两支）和无菌电穿孔比色皿（每种培养物各两个）置于冰上（参见材料表）。在整个操作过程中应尽可能将样品保持在冰上。
- 将储存在4 °C的无菌水瓶置于冰上。
- 用移液器将1.5 mL过夜培养的细菌培养物转移至一支1.5 mL微量离心管中。
- 在13,000 x g 条件下离心2分钟以沉淀细胞。
注意：理想情况下离心应在4 °C进行，但在室温下离心也可接受，且不会产生不利影响。 - 使用1 mL移液器小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。
- 向同一支微量离心管中再加入1.5 mL细菌培养物。在13,000 x g 条件下离心2分钟，然后完全去除上清液。
- 用剩余的1 mL培养物重复步骤3.6一次。
- 向细胞沉淀中加入1 mL预冷的无菌水，轻轻吹打重悬细胞，直至沉淀不再附着于微量离心管底部。
- 将重悬的细胞在13,000 x g 条件下离心2分钟。
- 使用1 mL移液器小心吸除上清液。切勿倾倒上清液，尤其是在后续洗涤步骤中，此时细胞往往形成较松散的沉淀。
- 用预冷的无菌水重复步骤3.8至步骤3.10的洗涤步骤，共再进行两次。
- 将最终的细胞沉淀轻轻重悬于200 µL预冷的无菌水中。
- 将100 µL最终细胞悬液转移至第二个预冷的1.5 mL微量离心管中。此第二份样品将作为电穿孔的阴性对照。保持细胞样品处于冰上。
4. 电穿孔
- 为每个样品和对照组在37 °C的静止培养箱中预热1 mL LB肉汤和一块LB + Gm50琼脂平板（按步骤1.4制备）。
- 在总体积不超过5 µL的条件下，向一份电转感受态细胞中加入100–200 ng的pTNS2辅助质粒和100–200 ng的pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK插入质粒。
- 用指尖轻轻弹击以充分混匀质粒与电转感受态细胞，避免产生气泡。
- 向阴性对照细胞样品中加入等体积的无菌蒸馏水，并如上轻轻混匀。
- 将样品置于冰上孵育20分钟。
- 将全部细胞样品转移至预冷的电穿孔比色皿中，然后将比色皿放回冰上。对阴性对照细胞样品重复此操作。
- 对细胞样品进行电穿孔。
- 打开电穿孔仪，并将其设置为2.0 kV（25 µF，200 Ω）（参见材料表）。
- 用软纸巾擦拭比色皿表面，去除附着的冰晶或水分。
- 将比色皿插入电穿孔仪中并施加电击。
- 立即向比色皿中的细胞加入0.9 mL预热的LB肉汤，轻轻吹打混匀细胞与培养基。
- 将全部细胞悬液转移至新的1.5 mL离心管（室温）中。
- 检查电穿孔仪上的时间常数数值；为获得最佳结果，该数值应在4至6之间。
- 对阴性对照细胞样品重复电穿孔步骤（步骤4.7.1至步骤4.7.6）。
- 将电穿孔后的样品在37 °C、250 rpm条件下孵育1小时，以使细胞恢复。
- 使用接种涂布器将每份电穿孔后的细胞样品100 µL涂布于预热的LB + Gm50琼脂平板上。
- 将剩余样品在13,000 x g条件下离心2分钟，使细胞沉淀。
- 用移液器完全移除上清液后，将细胞重悬于100 µL LB肉汤中。
- 将每份样品全部涂布于单独的预热LB + Gm50琼脂平板上。
注：电穿孔效率可能依赖于菌株。首次对某菌株进行电穿孔时，建议涂布不同体积甚至不同稀释度的电穿孔样品，以确保平板上形成可分离的单菌落。
- 将平板在37 °C孵育16–18小时。
5. 选择转化菌落进行基于 PCR 的筛选
- 检查电穿孔平板。阴性对照应无菌落生长；样品应有明显菌落。
注意：在此步骤及后续所有产生带菌落或菌斑的琼脂平板的步骤中，含有菌落的平板可在4 °C下保存最多3天后再继续操作。 - 使用无菌牙签，从LB + Gm50琼脂平板上挑取最多10个单菌落，并将其点种到新的LB + Gm50琼脂平板上。
- 将平板在37 °C下培养16–18小时。
6. 通过菌落PCR验证染色体插入
- 从培养箱中取出含有划线菌落的 LB + Gm50 琼脂平板。
- 使用无菌牙签或无菌移液器吸头，从划线区域取少量菌体（约一个大菌落大小），转移至含有 20 µL 无菌去离子水的 0.2 mL PCR 管中，充分混匀。随着细胞从牙签上释放，水样应明显变浑浊。可根据需要制备任意数量的样品，但通常 6 个已足够。
- 将含有细菌悬液的 PCR 管在 100 °C 下孵育 5–10 分钟。
- 使用小型离心机（见材料表），以固定的最大转速离心 2 分钟，使细胞碎片沉淀。
- 将上清液转移至新的 0.2 mL PCR 管中，并置于冰上。此上清液即为 PCR 反应的模板 DNA。
注意：此模板 DNA 可在进行 PCR 前保存于 -20 °C。 - 配制 PCR 反应体系，总体积为 25 µL，包含 1× 聚合酶缓冲液、200 µM dNTPs、0.18 µM ABglmS2_F_New 正向引物、0.18 µM Tn7R 反向引物（表 1）、1 U Taq DNA 聚合酶以及 1 µL 已制备的模板 DNA。同时设置无模板对照（NTC），即除模板 DNA 外其余组分均相同（见材料表）。
- 将反应程序输入 PCR 仪：95 °C 预变性 2 分钟；95 °C 变性 30 秒，49 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 30 秒，共 35 个循环；72 °C 终延伸 10 分钟；最后 12 °C 保存。运行样品。
- 向各 PCR 产物中加入 DNA 上样染料至终浓度为 1×，取 10 µL 加样于 2% 琼脂糖凝胶，在 80 V 条件下电泳 40 分钟。该引物对的预期扩增片段大小为 382 bp。无模板对照（NTC）应无条带出现。
- 确定产生预期 PCR 产物的样品，从任一 PCR 阳性划线菌落制备划线分离平板（LB + Gm50 琼脂平板），于 37 °C 培养 16–18 小时。目的是获得单菌落平板，用于制备甘油保存菌种以长期保存该标记菌株，并作为后续构建无标记菌株的起始材料（见下文描述）。
7. 使用 pFLP2ab去除 GmR 标记
- 按照步骤2中所述的程序进行：培养物制备。用于制备过夜培养物的样品来自LB + Gm50 琼脂平板上的单个菌落，该平板是在步骤6.9中制备以获得分离菌落的。
- 按照步骤3中所述的程序进行： 电转感受态细胞的制备。从过夜培养物中制备用于电穿孔的细胞。
- 按照步骤4中所述的程序进行：电穿孔。此处引入细胞的质粒为pFLP2ab（100–200 ng），该质粒将移除位于染色体插入的目的基因两侧的庆大霉素抗性基因。
- 细胞复苏1小时后（步骤4.9），取100 µL电穿孔后的细胞样品涂布于预热的LB + Cb200 琼脂平板上（该平板在步骤1.4中制备）。这种选择压力可确保仅有携带pFLP2ab切除质粒的细胞能够生长。
- 将平板在37 °C下培养16–18小时。
- 观察平板上的菌落生长情况。阴性对照平板应无菌落生长；LB + Cb200 琼脂样品平板应出现明显分离的菌落。
- 使用无菌牙签，将最多20个分离的菌落交叉划线接种至一块LB + Cb200 琼脂平板和一块LB + Gm50 琼脂平板上。
- 将平板在37 °C下培养16–18小时。
- 观察平板上的菌斑生长情况。在LB + Cb200 琼脂平板上生长但在LB + Gm50 琼脂平板上不生长的克隆，表明其原始插入片段中的庆大霉素抗性基因已被成功移除。
- 挑选对羧苄青霉素耐药而对庆大霉素敏感的菌斑，分别划线接种至添加5%（w/v）蔗糖的LB琼脂平板上，以促使细菌排出pFLP2ab质粒。最多选择10个菌落。
- 将平板在37 °C下培养16–18小时。
- 观察平板上的菌落生长情况。
- 为最终确认pFLP2ab质粒的丢失，从5%蔗糖平板上挑取4–6个分离的菌落，交叉划线接种至一块LB + Cb200 琼脂平板和一块LB琼脂平板上。
- 将平板在37 °C下培养16–18小时。
- 选择在LB琼脂平板上生长且对羧苄青霉素敏感的克隆，制备甘油菌种以保存该无标记菌株。
- 可通过菌落PCR（步骤6：通过菌落PCR验证染色体插入）使用靶向庆大霉素抗性基因的引物，对无标记菌株进行遗传学验证。
- 配制PCR反应体系：总体积25 µL，包含1×聚合酶缓冲液、200 µM dNTPs、0.18 µM Gm_F正向引物、0.18 µM Gm_R反向引物（表1）、1 U Taq DNA聚合酶和1 µL模板DNA。同时设置不含模板DNA的空白对照（NTC），以及使用标记菌株DNA的阳性对照。
- 将反应程序输入PCR仪：95 °C预变性2分钟；95 °C变性30秒，50 °C退火30秒，72 °C延伸40秒，共35个循环；72 °C终延伸10分钟；12 °C保存。运行样品。
- 加入DNA上样染料至终浓度1×，取各PCR反应产物10 µL上样至1%琼脂糖凝胶，在80 V下电泳40分钟。该引物对的预期扩增片段大小为525 bp。阳性对照应出现单一条带；样品和空白对照应无条带。
结果
染色体插入操作总共只需2小时，历时3天即可观察到结果——在选择性琼脂平板上生长的菌落图1A-C）。转化平板上预期的菌落数量因菌株而异：由于Tn7插入到 attTn7位点具有特异性和高效性9将转化平板上的菌落划线接种至选择性培养基图 4A) 可保存转化后的菌株，并为菌落PCR筛选提供起始材料（图1E 和 图4B）。通过PCR筛选菌落时可将数量控制在最低水平——通常无需处理超过10个菌落，且大多数菌落应能获得插入成功的阳性结果。用于筛选的引物ABglmS2_F_New和Tn7R扩增所得的PCR产物（表1），为382 bp（图4B 第4泳道）；该反应的阴性对照包括野生型 A. baumannii ATCC 17978 (图4B 2号泳道），AB258（图4B 第3泳道）以及无模板（图4B 5 泳道）。PCR 阳性的菌落代表已成功互补的标记菌株。
去除庆大霉素抗性基因（去标记）所需时间少于3小时，但整个过程耗时约6天，因为需要通过选择性平板筛选转化了切除质粒的细胞，随后还需将切除质粒从细菌中清除（图1F）。基于Flp-FRT重组的切除方法精确且高效，转化平板上应获得≥20个菌落。将菌落转接至含羧苄西林（筛选由切除质粒赋予的β-内酰胺抗性）和庆大霉素（检测庆大霉素抗性是否丢失）的平板时，所有菌落应表现为对羧苄西林耐药、对庆大霉素敏感。通过在含5%蔗糖的琼脂平板上培养，可迫使细菌排出切除质粒。由于质粒上的sacB基因可促进蔗糖转化为对细菌有毒性的多糖——果聚糖，因此在蔗糖培养基上的生长压力会促使细胞丢失pFLP2ab质粒12,13。所有能在5%蔗糖培养基上生长的菌落，应仅能在普通LB琼脂平板上生长，而在含羧苄西林的琼脂平板上不应有生长。能在普通LB琼脂平板上生长的菌落即为去标记菌株。可通过使用Gm_F和Gm_R引物进行菌落PCR来确认庆大霉素抗性标记的丢失（表1和图5）。该引物对仅在阳性对照（最初构建的标记菌株，图5泳道4）中扩增出525 bp的产物；野生型ATCC 17978（图5泳道2）、AB258（图5泳道3）、任意测试菌落（图5泳道5）以及无模板对照（图5泳道6）均不应出现扩增条带。
一旦确认无标记菌株，即可开始进行表型分析等功能测试。首先应进行的明显选择是测定一系列抗生素的最低抑菌浓度（MIC）：环丙沙星是AdeIJK已知的底物，四环素可被AdeIJK排出（主要外排泵为AdeAB），而卡那霉素对A. baumannii ATCC 17978的影响相对较小2,14。根据CLSI指南采用肉汤微量稀释法15，分别在有无50 µM IPTG的条件下对互补的无标记菌株AB258::adeIJK进行各抗生素挑战实验；同时将野生型菌株ATCC 17978和RND外排泵缺陷型菌株AB258作为对照（表2）。总体而言，MIC值的变化趋势符合预期：在诱导表达外排泵后，AB258::adeIJK对环丙沙星和四环素的敏感性降低，证实adeIJK的插入已成功实现。
图1：实验流程概述。 (A) 过夜培养的 A. baumannii 待互补的菌株已制备。B将过夜培养的细胞用水洗涤3次 通过 离心并置于冰上。C将递送质粒和辅助质粒加入细胞中，冰上孵育20分钟。样品进行电穿孔处理，加入LB培养基，细胞于37°C恢复培养1小时 37 °C. A 100 µL 将细胞等份样品涂布于LB + Gm培养基上50 琼脂平板并在 37 °C 过夜。D转化平板上的菌落接种至LB + Gm培养基中50 琼脂平板，37°C过夜培养 37 °C. (E将经修补的菌落用于PCR，以扩增跨越染色体插入位点的产物，从而进行筛选。通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。PCR阳性样本表明目的基因已成功插入染色体，并获得了标记菌株。F) 用庆大霉素筛选的阳性菌落按步骤(A-C），通过电穿孔将pLFP2ab 质粒以移除染色体插入片段中的庆大霉素抗性盒。在LB + Cb培养基上进行选择性平板培养200 琼脂证实质粒已被吸收。在LB + Cb培养基上进行重复划线200 和 LB + Gm50 琼脂平板上显示出的菌落为CbR 和 GmS 确认插入片段中庆大霉素抗性盒的丢失。所选Cb的生长R 5% 蔗糖平板上的菌落可消除 pLFP2 质粒ab 从细胞中提取质粒。将5%蔗糖平板上的菌落转接到LB + Cb培养基上200 琼脂和LB琼脂以显示所需的CbS 和 GmS 菌落并确认无标记菌株的构建。Gm50，庆大霉素在 50 µg/mL；Cb200，羧苄青霉素在 200 µg/mL; R，耐药性； S，敏感。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 2：本实验方案中使用的质粒。 各质粒的通用图谱，分别为（A）pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm（插入质粒）、（B）pTNS2（辅助质粒）和（C）pFLP2ab（切除质粒）。请点击此处查看该图的放大版本。
图3插入与去标记的示意图。 (A插入。Tn7 在基因组中的单一位点插入 A. baumannii 染色体位于末端上游24 bp处 glmS2 基因。共电穿孔插入质粒和辅助质粒可实现目的基因（插入基因，紫色）以及插入盒其余部分（用于标记物切除的FRT位点，黄色）的共整合。 accC1 庆大霉素抗性基因，绿色； lacIq 用于诱导表达的基因（蓝色）插入染色体中。B) 去标记。将补全的带标记插入菌株与pFLP2质粒进行电转化ab 切除质粒有助于去除庆大霉素抗性基因（accC1，绿色） 通过 Flp-FRT 重组（FRT 位点，黄色），产生无标记菌株。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图4：通过菌落PCR验证转化、划线培养及插入结果。 （A）划线后转化菌落生长的代表性结果；（B）使用ABglmS_F_New（灰色）和Tn7R（橙色）引物进行菌落PCR扩增，以确认染色体插入。第1道：低分子量DNA marker；第2道：ATCC 179798；第3道：AB258；第4道：AB258::adeIJK-LAC-Gm；第5道：无模板对照。预期条带大小为382 bp，已标注。请注意，也可使用针对庆大霉素的特异性引物（Gm_F和Gm_R，绿色）来确认染色体插入。请点击此处查看该图的放大版本。
图5通过菌落PCR验证标记基因的缺失。 使用庆大霉素特异性引物（Gm_F 和 Gm_R）进行菌落 PCR 扩增的代表性结果，以确认抗生素标记基因的丢失 通过 pFLPab基于切除。泳道1：低分子量DNA标记；泳道2：ATCC 179798；泳道3：AB258；泳道4：AB258::adeIJK-LAC-Gm；泳道5：AB258::adeIJK；第6泳道：无模板对照。标注了预期的525 bp条带。 请点击此处以查看此图的放大版本。
| 菌株、质粒和引物 | 相关特征 | 参考文献 |
| 菌株 | ||
| A. baumannii ATCC 17978 | 模式菌株 | ATCC |
| A. baumannii ATCC 17978 AB258 | ΔadeAB,ΔadeFGH,ΔadeIJK | 11 |
| 质粒 | ||
| pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC | GmR, AmpR | 9 |
| pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC-adeIJK | GmR, AmpR, adeIJK | 本研究 |
| pTNS2 | AmpR | 9 |
| pFLP2ab | pWH1266 复制起点, sacB, AmpR | 7 |
| 引物 | 序列 (5′–3′) | |
| ABglmS_F_New | CACAGCATAACTGGACTGATTTC | 7 |
| Tn7R | TATGGAAGAAGTTCAGGCTC | 7 |
| Gm_F | TGGAGCAGCAACGATGTTAC | 本研究 |
| Gm_R | TGTTAGGTGGCGGTACTTGG | 本研究 |
表1：本实验方案中使用的小鼠菌株、质粒和引物。 Gm，庆大霉素；Amp，氨苄青霉素；R，耐药。
| 环丙沙星 | 四环素 | 卡那霉素 | ||||
| IPTG | − | + | − | + | − | + |
| ATCC 17978 | 0.250 | nd | 0.500 | nd | 1.5 | nd |
| AB258 | 0.031 | nd | 0.063 | nd | 4 | nd |
| AB258::adeIJK | 0.016 | 0.063 | 0.031 | 0.125 | 8 | 2 |
| 倍数变化 | 4.01 | 4.03 | 0.25 | |||
表2：检测插入基因的功能性 通过 抗生素敏感性 最低抑菌浓度（MIC）值的比较 A. baumannii ATCC 17978，AB258，未诱导的AB258::adeIJK，以及IPTG诱导的AB258::adeIJK 对环丙沙星、四环素和卡那霉素的抗性。倍数变化 = 诱导（+ IPTG）/未诱导（− IPTG）；nd = 未测定。
讨论
尽管在 A. baumannii 中进行可诱导单拷贝基因表达系统染色体插入的操作在技术上较为简单且不费力，但仍有一些关键步骤需要特别注意。首先，制备感受态细胞时应尽可能在冰上操作，因为在用冰水替换培养基的过程中细胞会变得脆弱。理想情况下，离心步骤应在 4 °C 下进行，但在室温下离心也可接受。由于细胞在多次水洗过程中会逐渐变得更加脆弱，因此轻柔移液至关重要。其次，电穿孔对离子的存在非常敏感。通过多次离心和重悬于水中的洗涤步骤可确保完全去除培养基。此外，质粒应为新鲜纯化，可洗脱于标准试剂盒洗脱缓冲液（通常为 TE 缓冲液）中，只要质粒 DNA 浓度足够高即可。我们力求将 <5 µL 的质粒加入 100 µL 细胞悬液中，以保持样品的离子强度极低，尽管最多加入 10 µL 也可耐受。第三，应根据需要制备选择性琼脂平板，以确保所添加抗生素的有效性。请注意，在转化切除质粒 pFLP2ab 时，选用羧苄西林（carbenicillin）而非常规的氨苄西林（ampicillin）进行筛选。A. baumannii 对氨基青霉素类（如氨苄西林）具有固有耐药性16；使用羧基青霉素（如羧苄西林）可使质粒编码的 β-内酰胺酶持续发挥选择作用。
实验方案的优化较为复杂，可能因不同种类的不动杆菌（Acinetobacter）（甚至同一种内经基因改造的菌株）以及实验室所用特定试剂的不同而有所差异。例如，电穿孔所用的电压可在1.8至2.5 kV之间变化，而PCR中使用的DNA聚合酶不同，可能需要对热循环条件进行轻微调整。若电穿孔后细胞生长状况不佳，可考虑以下建议：将琼脂平板中庆大霉素的浓度从50 µg/mL降低至30 µg/mL，和/或延长琼脂平板的培养时间至≥24小时。关于去除庆大霉素盒的步骤，若羧苄青霉素抗性持续存在，使用含10%蔗糖的LB琼脂平板和/或在30 °C下培养≥24小时可能会获得更好的结果。
众多 A. baumannii 用于电穿孔的细胞制备方法在文献中已有报道，但通常包括在初次过夜培养后进行传代培养，再经过较长的生长期达到指定的光密度。我们发现，仅使用简单的过夜培养同样可达到有效效果。电穿孔 A. baumannii 已有详细描述，读者可在此深入了解本方案的这一特定方面17,18与基于质粒的互补系统相比，该微型Tn7染色体基因互补系统的关键优势在于能够通过IPTG可调控的启动子调节互补基因的表达水平 lacIq 阻遏系统及选择性移除庆大霉素标记（aacC1 基因 通过 侧翼的FRT位点。观察发现，细胞对不同外排泵表达的耐受性存在差异，具体取决于所插入的泵类型。例如，与AdeABC或AdeFGH相比，细胞对AdeIJK的表达更为敏感；这一问题可通过调整培养条件中IPTG的浓度来解决。去除抗生素抗性标记可降低因持续选择压力导致的菌株突变风险，同时也可进行不受限制的抗生素敏感性研究。3.
该微型Tn7系统已成功应用于Pseudomonas9,10、Yersinia9、Burkholderia19、Xanthomonas20以及Acinetobacter5,6,21,22等物种，但仍存在一些局限性。例如，在A. baumannii中，基因组内仅有一个功能性的attTn7插入位点5，因此虽然可以构建具有多个基因缺失的菌株，但每次只能互补一个基因。此外，该系统尚未被证实对革兰氏阳性菌有效10。
RND 外排泵在 A. baumannii 的抗生素耐药性中起着重要的促进作用。其强大功能源于跨越内膜和外膜的三组分结构，能够将抗生素从周质空间直接排出到细胞外。目前研究最深入且广泛存在的 RND 外排泵包括 AdeABC、AdeFGH 和 AdeIJK，已被证实可排出涵盖所有类别的抗生素。深入阐明外排泵的功能机制，将为设计针对多重耐药菌株的新型治疗策略提供良好的起点。利用 AB258 三重 RND 外排泵缺失菌株，并逐一回补单个外排泵，可实现对每个泵功能的独立研究，从而明确各泵独特的底物谱及其最有效的抑制剂。当然，外排泵在细菌的日常生理功能中也具有重要作用。理解这些生理功能可能为间接抑制外排泵活性提供途径，从而阻断抗生素外排，使多重耐药菌重新对常用抗生素产生敏感性。通常，mini-Tn7 系统可用于引入任何目标基因以进行深入研究，或引入有益的标记物，例如用于显微成像的荧光蛋白6。
多重耐药细菌的日益流行令我们所有人担忧。了解像鲍曼不动杆菌（A. baumannii）等病原体中由外排泵提供的保护机制，对于应对严重感染至关重要。这种染色体单拷贝基因表达系统是一种强大的工具，既可用于机制研究，也可用于鉴定抑制外排泵功能的抑制剂。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作获得了加拿大自然科学与工程研究理事会向 AK 提供的发现基金资助。图中所用示意图由 BioRender.com 制作。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2 mL PCR管 | VWR | 20170-012 | 用于菌落煮沸制备和PCR反应 |
| 1.5 mL 微量离心管 | Sarstedt | 72-690-301 | 通用用途 |
| 13 mL 培养管，Pyrex | Fisher | 14-957K | 液体培养容器 |
| 6x DNA上样缓冲液 | Froggabio | LD010 | 琼脂糖凝胶电泳样品上样染料 |
| 冰醋酸 | Fisher | 351271-212 | 琼脂糖凝胶电泳运行缓冲液组分 |
| 琼脂 | Bioshop | AGR003 | 固体培养基 |
| 琼脂糖 | BioBasic | D0012 | PCR反应产物的电泳分离；使用浓度为0.8–2% |
| 琼脂糖凝胶电泳装置 | Fisher | 29-237-54 | 琼脂糖凝胶电泳；PCR反应产物的分离 |
| 羧苄青霉素 | Fisher | 50841231 | 选择性培养基 |
| 培养管盖 | Fisher | 13-684-138 | 13 mL培养管用不锈钢盖 |
| 脱氧核苷三磷酸（dNTP）混合液 | Biobasic | DD0058 | PCR反应组分；提供形式为每种dATP、dCTP、dGTP、dTTP各100 mM；混合并稀释至每种dNTP各10 mM |
| 干浴/金属浴加热器 | Fisher | 88860023 | Isotemp数字干浴仪，用于煮沸制备 |
| 电穿孔比色皿 | VWR | 89047-208 | 2 mm带圆盖电穿孔比色皿 |
| 电穿孔仪 | Cole Parmer | 940000009 | 110 VAC，60 Hz电穿孔仪 |
| 溴化乙锭 | Fisher | BP102-1 | 在琼脂糖凝胶中可视化PCR反应产物和DNA标记物 |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | VWR | CA-EM4050 | 琼脂糖凝胶电泳运行缓冲液组分 |
| 庆大霉素 | Biobasic | GB0217 | 用于选择性培养基的制备 |
| 甘油 | Fisher | G33 | 制备用于超低温冰箱长期保存的细菌保存液 |
| 摇床培养箱 | New Brunswick Scientific | M1352-0000 | Excella E24摇床培养箱，用于液体培养物的生长 |
| 静止培养箱 | Fisher | 11-690-550D | Isotemp 550D型培养箱烘箱，用于固体（LB琼脂）培养物的生长 |
| 接种环 | Sarstedt | 86.1562.050 | 将菌落划线接种至琼脂平板 |
| 涂布棒 | Sarstedt | 86.1569.005 | 将培养物均匀涂布于琼脂平板 |
| LB液体培养基（Lennox配方） | Fisher | BP1427 | 液体培养基（20 g/L：5 g/L氯化钠，10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物） |
| 微量离心机 | Fisher | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17，用于样品离心 |
| 小型离心机 | Fisher | S67601B | 用于0.2 mL PCR管的离心 |
| 培养皿 | SPL Life Sciences | 10090 | 用于固体培养基（琼脂平板）：90 × 15 mm |
| 移液器 | Mandel | 各种 | Gilson单通道移液器（P10、P20、P200、P1000） |
| 电源 | Biorad | 1645050 | PowerPac Basic电泳电源 |
| 引物 | IDT | NA | PCR反应组分；针对目标基因设计；根据产品说明书配制为100 μM |
| 蔗糖 | BioBasic | SB0498 | 用于制备反向选择培养基，以从转化后的鲍曼不动杆菌中去除pFLP2ab质粒 |
| Taq DNA聚合酶 | FroggaBio | T-500 | PCR反应组分；聚合酶随附10x缓冲液 |
| PCR仪 | Biorad | 1861096 | T100型号，用于PCR |
| 牙签 | Fisher | S24559 | 用于将菌落点种至琼脂平板 |
| Trizma碱 | Sigma | T1503 | 琼脂糖凝胶电泳运行缓冲液组分 |
| 超纯水 | Millipore Sigma | ZLXLSD51040 | MilliQ水纯化系统：用于培养基和溶液配制以及细胞洗涤的超纯水 |
| 宽范围DNA标记物 | Biobasic | M103R-2 | 在琼脂糖凝胶上测定PCR产物的大小 |
| 木质接种棒 | Fisher | 29-801-02 | 从琼脂平板上挑取菌落接种培养物 |
参考文献
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