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方法文章

表征多重耐药外排系统 鲍曼不动杆菌 利用外排系统-缺陷型细菌菌株与单拷贝-单拷贝基因表达系统

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DOI：

10.3791/66471

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2024年1月5日

 , 
1Department of Microbiology, University of Manitoba

本文内容

摘要

我们描述了一种利用基于mini-Tn7的表达系统，在已构建的外排泵缺陷型鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）菌株中实现外排泵基因单拷贝染色体互补的简便方法。该精确的遗传工具可实现基因表达的可控性，这对于表征多重耐药病原体中外排泵的功能至关重要。

摘要

Acinetobacter baumannii 因其对多种抗生素具有广泛耐药性，被认为是难以应对的革兰氏阴性病原体。深入了解其耐药机制对于设计新的有效治疗方案至关重要。然而，目前可用于研究 A. baumannii 的遗传操作工具十分有限，制约了相关机制的探索。本文介绍了一种基于染色体 mini-Tn7 系统的方法，用于在缺乏功能性 RND 型外排机制的 A. baumannii 菌株中实现单拷贝基因表达。单拷贝插入和可诱导的外排泵表达具有显著优势，因为将 RND 外排操纵子构建在高拷贝质粒上通常会对细菌细胞造成不良影响。此外，将重组 mini-Tn7 表达载体整合至外排敏感性增强的 A. baumannii 替代宿主染色体中，有助于避免其他外排泵的干扰。该系统不仅适用于研究尚未明确功能的细菌外排泵，还可用于评估靶向外排泵的潜在抑制剂的有效性。

引言

鲍曼不动杆菌 是一种世界卫生组织列为最高优先级的病原体，因其对所有类别的抗生素均具有耐药性1它是一种机会性病原体，主要影响住院患者、创伤患者或免疫功能低下者。 A. baumannii 在很大程度上逃避抗生素作用 通过 外排泵，其中最重要的是耐药-结节-分裂（RND）家族外排蛋白2了解这些外排泵的作用机制将有助于开发针对性的治疗方案。

一种特异性区分细胞过程的常用方法是通过基因操作。然而，可用于A. baumannii遗传学研究的工具十分有限，而且临床分离株通常对基因操作中常规用于筛选的抗生素具有抗性，这进一步增加了实验设计的复杂性3。在研究外排泵时遇到的第二个难题是，这些泵的表达受到严格调控——通常受未知因素调控，使得准确分离并归因特定功能于单一外排泵变得困难4。鉴于扩展研究工具的迫切需求，我们开发了一种基于mini-Tn7的单拷贝插入型诱导表达系统，该系统包含一个Flp重组酶靶点（FRT）盒，可用于移除筛选标记5,6,7（图1）。该系统最初为Pseudomonas构建8,9,10，我们将其用于在RND外排泵缺陷型A. baumannii菌株（ATCC 17978::ΔadeIJK,ΔadeFGH,ΔadeAB，以下简称A. baumannii AB258）中构建单拷贝外排泵互补株11。该方法能够一次仅研究一个外排泵，避免了质粒表达系统中常见的高拷贝表达对细菌细胞造成的过载，从而可在干扰最小、复杂性降低的情况下，更深入地了解每个外排泵的关键生理特性。

本文介绍如何利用mini-Tn7系统，通过为期9天的一系列简单步骤，将缺失的目的基因——RND外排泵adeIJK——回补至A. baumannii AB258的染色体中7。第一步是将克隆至基于mini-Tn7的插入质粒中的缺失外排泵基因，重新导入位于高度保守的glmS基因下游的单一attTn7插入位点（图2A和图3A）。该过程由一种非复制型辅助质粒（图2B）介导，该质粒编码Tn7转座插入所需的转座酶基因。第二步则使用一种切除质粒（图2C），通过Flp重组酶介导，移除两侧由FRT位点包围的庆大霉素抗性基因（图3B），从而构建无标记菌株。尽管该系统主要用于阐明RND外排泵在抗生素耐药性中的关键作用及其潜在抑制剂，但它同样适用于研究任何目的基因。

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方案

1. 实验准备

  1. 纯化质粒 pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm9 插入质粒， 图2A) 与目的基因。
    注意：此处的目的基因为 adeIJK最终质粒浓度应不低于100 ng/µL。
  2. 纯化辅助质粒（pTNS2）9 以及切除质粒（pFLP2ab)6 (图 2B，C分别为），理想情况下质粒DNA终浓度应≥100 ng/µL。
  3. 准备50 mL无菌超纯水和25 mL无菌LB（Lennox）培养基（见 材料表).
  4. 准备至少10个LB琼脂平板，每种均含有以下添加剂：普通型（无添加剂）、含50 µg/mL庆大霉素（Gm）、含200 µg/mL羧苄青霉素（Cb）（用于筛选） 通过 氨苄青霉素抗性基因）和 5% 蔗糖（参见 材料表).
  5. 将待用于插入的菌株划线接种于LB琼脂平板上，37 °C培养16–18小时。此处， A. baumannii 使用 AB258。
    注意：本实验步骤应尽可能在无菌环境中进行，可使用本生灯或生物安全柜。所有耗材（移液器吸头、接种环、微量离心管等）均须无菌。

2. 培养物制备

  1. 使用无菌接种环或无菌木制接种棒，将一株 A. baumannii AB258 单菌落接种于无菌13 mL培养管中的4 mL LB肉汤培养基中。
    注意：每份样品及其对照需使用一份4 mL培养物。根据所需样品数量相应增加培养物份数。
  2. 在37 °C条件下振荡培养过夜（250 rpm）。
  3. 将一瓶无菌蒸馏水（25–50 mL）置于4 °C环境中过夜，以备第3步使用。

3. 电转感受态细胞的制备

  1. 将所有无菌的1.5 mL微量离心管（每种培养物各两支）和无菌电穿孔比色皿（每种培养物各两个）置于冰上（参见材料表）。在整个操作过程中应尽可能将样品保持在冰上。
  2. 将储存在4 °C的无菌水瓶置于冰上。
  3. 用移液器将1.5 mL过夜培养的细菌培养物转移至一支1.5 mL微量离心管中。
  4. 在13,000 x g 条件下离心2分钟以沉淀细胞。
    注意：理想情况下离心应在4 °C进行，但在室温下离心也可接受，且不会产生不利影响。
  5. 使用1 mL移液器小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。
  6. 向同一支微量离心管中再加入1.5 mL细菌培养物。在13,000 x g 条件下离心2分钟，然后完全去除上清液。
  7. 用剩余的1 mL培养物重复步骤3.6一次。
  8. 向细胞沉淀中加入1 mL预冷的无菌水，轻轻吹打重悬细胞，直至沉淀不再附着于微量离心管底部。
  9. 将重悬的细胞在13,000 x g 条件下离心2分钟。
  10. 使用1 mL移液器小心吸除上清液。切勿倾倒上清液，尤其是在后续洗涤步骤中，此时细胞往往形成较松散的沉淀。
  11. 用预冷的无菌水重复步骤3.8至步骤3.10的洗涤步骤，共再进行两次。
  12. 将最终的细胞沉淀轻轻重悬于200 µL预冷的无菌水中。
  13. 将100 µL最终细胞悬液转移至第二个预冷的1.5 mL微量离心管中。此第二份样品将作为电穿孔的阴性对照。保持细胞样品处于冰上。

4. 电穿孔

  1. 为每个样品和对照组在37 °C的静止培养箱中预热1 mL LB肉汤和一块LB + Gm50琼脂平板（按步骤1.4制备）。
  2. 在总体积不超过5 µL的条件下，向一份电转感受态细胞中加入100–200 ng的pTNS2辅助质粒和100–200 ng的pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK插入质粒。
  3. 用指尖轻轻弹击以充分混匀质粒与电转感受态细胞，避免产生气泡。
  4. 向阴性对照细胞样品中加入等体积的无菌蒸馏水，并如上轻轻混匀。
  5. 将样品置于冰上孵育20分钟。
  6. 将全部细胞样品转移至预冷的电穿孔比色皿中，然后将比色皿放回冰上。对阴性对照细胞样品重复此操作。
  7. 对细胞样品进行电穿孔。
    1. 打开电穿孔仪，并将其设置为2.0 kV（25 µF，200 Ω）（参见材料表）。
    2. 用软纸巾擦拭比色皿表面，去除附着的冰晶或水分。
    3. 将比色皿插入电穿孔仪中并施加电击。
    4. 立即向比色皿中的细胞加入0.9 mL预热的LB肉汤，轻轻吹打混匀细胞与培养基。
    5. 将全部细胞悬液转移至新的1.5 mL离心管（室温）中。
    6. 检查电穿孔仪上的时间常数数值；为获得最佳结果，该数值应在4至6之间。
  8. 对阴性对照细胞样品重复电穿孔步骤（步骤4.7.1至步骤4.7.6）。
  9. 将电穿孔后的样品在37 °C、250 rpm条件下孵育1小时，以使细胞恢复。
  10. 使用接种涂布器将每份电穿孔后的细胞样品100 µL涂布于预热的LB + Gm50琼脂平板上。
    1. 将剩余样品在13,000 x g条件下离心2分钟，使细胞沉淀。
    2. 用移液器完全移除上清液后，将细胞重悬于100 µL LB肉汤中。
    3. 将每份样品全部涂布于单独的预热LB + Gm50琼脂平板上。
      注：电穿孔效率可能依赖于菌株。首次对某菌株进行电穿孔时，建议涂布不同体积甚至不同稀释度的电穿孔样品，以确保平板上形成可分离的单菌落。
  11. 将平板在37 °C孵育16–18小时。

5. 选择转化菌落进行基于 PCR 的筛选

  1. 检查电穿孔平板。阴性对照应无菌落生长；样品应有明显菌落。
    注意：在此步骤及后续所有产生带菌落或菌斑的琼脂平板的步骤中，含有菌落的平板可在4 °C下保存最多3天后再继续操作。
  2. 使用无菌牙签，从LB + Gm50琼脂平板上挑取最多10个单菌落，并将其点种到新的LB + Gm50琼脂平板上。
  3. 将平板在37 °C下培养16–18小时。

6. 通过菌落PCR验证染色体插入

  1. 从培养箱中取出含有划线菌落的 LB + Gm50 琼脂平板。
  2. 使用无菌牙签或无菌移液器吸头，从划线区域取少量菌体（约一个大菌落大小），转移至含有 20 µL 无菌去离子水的 0.2 mL PCR 管中，充分混匀。随着细胞从牙签上释放，水样应明显变浑浊。可根据需要制备任意数量的样品，但通常 6 个已足够。
  3. 将含有细菌悬液的 PCR 管在 100 °C 下孵育 5–10 分钟。
  4. 使用小型离心机（见材料表），以固定的最大转速离心 2 分钟，使细胞碎片沉淀。
  5. 将上清液转移至新的 0.2 mL PCR 管中，并置于冰上。此上清液即为 PCR 反应的模板 DNA。
    注意：此模板 DNA 可在进行 PCR 前保存于 -20 °C。
  6. 配制 PCR 反应体系，总体积为 25 µL，包含 1× 聚合酶缓冲液、200 µM dNTPs、0.18 µM ABglmS2_F_New 正向引物、0.18 µM Tn7R 反向引物（表 1）、1 U Taq DNA 聚合酶以及 1 µL 已制备的模板 DNA。同时设置无模板对照（NTC），即除模板 DNA 外其余组分均相同（见材料表）。
  7. 将反应程序输入 PCR 仪：95 °C 预变性 2 分钟；95 °C 变性 30 秒，49 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 30 秒，共 35 个循环；72 °C 终延伸 10 分钟；最后 12 °C 保存。运行样品。
  8. 向各 PCR 产物中加入 DNA 上样染料至终浓度为 1×，取 10 µL 加样于 2% 琼脂糖凝胶，在 80 V 条件下电泳 40 分钟。该引物对的预期扩增片段大小为 382 bp。无模板对照（NTC）应无条带出现。
  9. 确定产生预期 PCR 产物的样品，从任一 PCR 阳性划线菌落制备划线分离平板（LB + Gm50 琼脂平板），于 37 °C 培养 16–18 小时。目的是获得单菌落平板，用于制备甘油保存菌种以长期保存该标记菌株，并作为后续构建无标记菌株的起始材料（见下文描述）。

7. 使用 pFLP2ab去除 GmR 标记

  1. 按照步骤2中所述的程序进行：培养物制备。用于制备过夜培养物的样品来自LB + Gm50 琼脂平板上的单个菌落，该平板是在步骤6.9中制备以获得分离菌落的。
  2. 按照步骤3中所述的程序进行： 电转感受态细胞的制备。从过夜培养物中制备用于电穿孔的细胞。
  3. 按照步骤4中所述的程序进行：电穿孔。此处引入细胞的质粒为pFLP2ab（100–200 ng），该质粒将移除位于染色体插入的目的基因两侧的庆大霉素抗性基因。
  4. 细胞复苏1小时后（步骤4.9），取100 µL电穿孔后的细胞样品涂布于预热的LB + Cb200 琼脂平板上（该平板在步骤1.4中制备）。这种选择压力可确保仅有携带pFLP2ab切除质粒的细胞能够生长。
  5. 将平板在37 °C下培养16–18小时。
  6. 观察平板上的菌落生长情况。阴性对照平板应无菌落生长；LB + Cb200 琼脂样品平板应出现明显分离的菌落。
  7. 使用无菌牙签，将最多20个分离的菌落交叉划线接种至一块LB + Cb200 琼脂平板和一块LB + Gm50 琼脂平板上。
  8. 将平板在37 °C下培养16–18小时。
  9. 观察平板上的菌斑生长情况。在LB + Cb200 琼脂平板上生长但在LB + Gm50 琼脂平板上不生长的克隆，表明其原始插入片段中的庆大霉素抗性基因已被成功移除。
  10. 挑选对羧苄青霉素耐药而对庆大霉素敏感的菌斑，分别划线接种至添加5%（w/v）蔗糖的LB琼脂平板上，以促使细菌排出pFLP2ab质粒。最多选择10个菌落。
  11. 将平板在37 °C下培养16–18小时。
  12. 观察平板上的菌落生长情况。
  13. 为最终确认pFLP2ab质粒的丢失，从5%蔗糖平板上挑取4–6个分离的菌落，交叉划线接种至一块LB + Cb200 琼脂平板和一块LB琼脂平板上。
  14. 将平板在37 °C下培养16–18小时。
  15. 选择在LB琼脂平板上生长且对羧苄青霉素敏感的克隆，制备甘油菌种以保存该无标记菌株。
    1. 可通过菌落PCR（步骤6：通过菌落PCR验证染色体插入）使用靶向庆大霉素抗性基因的引物，对无标记菌株进行遗传学验证。
    2. 配制PCR反应体系：总体积25 µL，包含1×聚合酶缓冲液、200 µM dNTPs、0.18 µM Gm_F正向引物、0.18 µM Gm_R反向引物（表1）、1 U Taq DNA聚合酶和1 µL模板DNA。同时设置不含模板DNA的空白对照（NTC），以及使用标记菌株DNA的阳性对照。
    3. 将反应程序输入PCR仪：95 °C预变性2分钟；95 °C变性30秒，50 °C退火30秒，72 °C延伸40秒，共35个循环；72 °C终延伸10分钟；12 °C保存。运行样品。
    4. 加入DNA上样染料至终浓度1×，取各PCR反应产物10 µL上样至1%琼脂糖凝胶，在80 V下电泳40分钟。该引物对的预期扩增片段大小为525 bp。阳性对照应出现单一条带；样品和空白对照应无条带。

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结果

染色体插入操作总共只需2小时，历时3天即可观察到结果——在选择性琼脂平板上生长的菌落图1A-C）。转化平板上预期的菌落数量因菌株而异：由于Tn7插入到 attTn7位点具有特异性和高效性9将转化平板上的菌落划线接种至选择性培养基图 4A) 可保存转化后的菌株，并为菌落PCR筛选提供起始材料（图1E 和 图4B）。通过PCR筛选菌落时可将数量控制在最低水平——通常无需处理超过10个菌落，且大多数菌落应能获得插入成功的阳性结果。用于筛选的引物ABglmS2_F_New和Tn7R扩增所得的PCR产物（表1），为382 bp（图4B 第4泳道）；该反应的阴性对照包括野生型 A....

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讨论

尽管在 A. baumannii 中进行可诱导单拷贝基因表达系统染色体插入的操作在技术上较为简单且不费力，但仍有一些关键步骤需要特别注意。首先，制备感受态细胞时应尽可能在冰上操作，因为在用冰水替换培养基的过程中细胞会变得脆弱。理想情况下，离心步骤应在 4 °C 下进行，但在室温下离心也可接受。由于细胞在多次水洗过程中会逐渐变得更加脆弱，因此轻柔移液至关重要。其次，电穿孔对离子的存在非常敏感。通过多次离心和重悬于水中的洗涤步骤可确保完全去除培养基。此外，质粒应为新鲜纯化，可洗脱于标准试剂盒洗脱缓冲液（通常为 TE 缓冲液）中，只要质粒 DNA 浓度足够高即可。我们力求将 <5 µL 的质粒加入 100 µL 细胞悬液中，以保持样品的离子强度极低，尽管最多加入 10 µL 也可耐受。第三，应根据需要制备选择性琼脂平板，以确保所添加抗生素的有效性。请注意，在转化切除质粒 pFLP2ab 时，选用羧苄西林（carbenicillin）而非常规的氨苄西林（ampicillin）进行筛选。A. baumannii 对氨基青霉素类（如氨苄西林）具有固有耐药性

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究工作获得了加拿大自然科学与工程研究理事会向 AK 提供的发现基金资助。图中所用示意图由 BioRender.com 制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 mL PCR管VWR20170-012用于菌落煮沸制备和PCR反应
1.5 mL 微量离心管Sarstedt72-690-301通用用途
13 mL 培养管，PyrexFisher14-957K液体培养容器
6x DNA上样缓冲液FroggabioLD010琼脂糖凝胶电泳样品上样染料
冰醋酸Fisher351271-212琼脂糖凝胶电泳运行缓冲液组分
琼脂BioshopAGR003固体培养基
琼脂糖BioBasicD0012PCR反应产物的电泳分离；使用浓度为0.8–2%
琼脂糖凝胶电泳装置Fisher29-237-54琼脂糖凝胶电泳；PCR反应产物的分离
羧苄青霉素Fisher50841231选择性培养基
培养管盖Fisher13-684-13813 mL培养管用不锈钢盖
脱氧核苷三磷酸（dNTP）混合液BiobasicDD0058PCR反应组分；提供形式为每种dATP、dCTP、dGTP、dTTP各100 mM；混合并稀释至每种dNTP各10 mM
干浴/金属浴加热器Fisher88860023Isotemp数字干浴仪，用于煮沸制备
电穿孔比色皿VWR89047-2082 mm带圆盖电穿孔比色皿
电穿孔仪Cole Parmer940000009110 VAC，60 Hz电穿孔仪
溴化乙锭FisherBP102-1在琼脂糖凝胶中可视化PCR反应产物和DNA标记物
乙二胺四乙酸（EDTA）VWRCA-EM4050琼脂糖凝胶电泳运行缓冲液组分
庆大霉素BiobasicGB0217用于选择性培养基的制备
甘油FisherG33制备用于超低温冰箱长期保存的细菌保存液
摇床培养箱New Brunswick ScientificM1352-0000Excella E24摇床培养箱，用于液体培养物的生长
静止培养箱Fisher11-690-550DIsotemp 550D型培养箱烘箱，用于固体（LB琼脂）培养物的生长
接种环Sarstedt86.1562.050将菌落划线接种至琼脂平板
涂布棒Sarstedt86.1569.005将培养物均匀涂布于琼脂平板
LB液体培养基（Lennox配方）FisherBP1427液体培养基（20 g/L：5 g/L氯化钠，10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物）
微量离心机Fisher75002431Sorvall Legend Micro 17，用于样品离心
小型离心机FisherS67601B用于0.2 mL PCR管的离心
培养皿SPL Life Sciences10090用于固体培养基（琼脂平板）：90 × 15 mm
移液器 Mandel各种Gilson单通道移液器（P10、P20、P200、P1000）
电源Biorad1645050PowerPac Basic电泳电源
引物IDTNAPCR反应组分；针对目标基因设计；根据产品说明书配制为100 μM
蔗糖BioBasicSB0498用于制备反向选择培养基，以从转化后的鲍曼不动杆菌中去除pFLP2ab质粒
Taq DNA聚合酶FroggaBioT-500PCR反应组分；聚合酶随附10x缓冲液
PCR仪Biorad1861096T100型号，用于PCR
牙签FisherS24559用于将菌落点种至琼脂平板
Trizma碱SigmaT1503琼脂糖凝胶电泳运行缓冲液组分
超纯水Millipore SigmaZLXLSD51040MilliQ水纯化系统：用于培养基和溶液配制以及细胞洗涤的超纯水
宽范围DNA标记物BiobasicM103R-2在琼脂糖凝胶上测定PCR产物的大小
木质接种棒Fisher29-801-02从琼脂平板上挑取菌落接种培养物

参考文献

  1. Prioritization of pathogens to guide research, discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. World Health Organization. , Geneva, Switzerland . Available from: https://www.who.int/publications/i/item/WHO-EMP-IAU-2017.12 (2017).
  2. Kornelsen, V., Kumar, A. Update on multidrug resistance efflux pumps in Acinetobacter spp. Antimicrob Agents Chemother. 65 (7), e00514-00521 (2021).
  3. Sykes, E. M., Deo, S., Kumar, A. Recent advances in genetic tools for Acinetobacter baumannii. Front Genet. 11, 601380(2020).
  4. Kumar, A., Chua, K. L., Schweizer, H. P. Method for regulated expression of single-copy efflux pump genes in a surrogate Pseudomonas aeruginosa strain: identification of the BpeEF-OprC chloramphenicol and trimethoprim efflux pump of Burkholderia pseudomallei 1026b. Antimicrob Agents Chemother. 50 (10), 3460-3463 (2006).
  5. Kumar, A., Dalton, C., Cortez-Cordova, J., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for single copy gene cloning in Acinetobacter baumannii. J Microbiol Methods. 82 (3), 296-300 (2010).
  6. Ducas-Mowchun, K., et al. Next generation of Tn7-based single-copy insertion elements for use in multi- and pan-drug resistant strains of Acinetobacter baumannii. Appl Environ Microbiol. 85 (11), e00066-00119 (2019).
  7. Ducas-Mowchun, K., De Silva, P. M., Patidar, R., Schweizer, H. P., Kumar, A. Tn7-based single-copy insertion vectors for Acinetobacter baumannii. Methods Mol Biol. 1946, 135-150 (2019).
  8. Schweizer, H. P. Applications of the Saccharomyces cerevisiae Flp-FRT system in bacterial genetics. J Mol Microbiol Biotechnol. 5 (2), 67-77 (2003).
  9. Choi, K. H., et al. A Tn7-based broad-range bacterial cloning and expression system. Nat Methods. 2 (6), 443-448 (2005).
  10. Choi, K. H., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat Protoc. 1 (1), 153-161 (2006).
  11. Kornelsen, V., Unger, M., Kumar, A. Atorvastatin does not display an antimicrobial activity on its own nor potentiates the activity of other antibiotics against Acinetobacter baumannii ATCC 17978 or A. baumannii AB030. Access Microbiol. 3, 000288(2021).
  12. Reyrat, J. M., et al. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infect Immun. 66 (9), 4011-4017 (1998).
  13. Gay, P., et al. Positive selection procedure for entrapment of insertion sequence elements in gram-negative bacteria. J Bacteriol. 164, 918-921 (1985).
  14. Kyriakidis, I., Vasileiou, E., Pana, Z. D. Tragiannidis, Acinetobacter baumannii antibiotic resistance mechanisms. Pathogens. 10 (3), 373(2021).
  15. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. CLSI Supplement M100., 31st edn. , Clinical and Laboratory Standards Institute. (2021).
  16. Dijkshoorn, L., Nemec, A., Seifert, H. An increasing threat in hospitals: multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Nature Reviews Microbiology. 5, 939-951 (2007).
  17. Yildirim, S., Thompson, M. G., Jacobs, A. C., Zurawski, D. V., Kirkup, B. C. Evaluation of parameters for high efficiency transformation of Acinetobacter baumannii. Sci Rep. 25 (6), 22110(2016).
  18. Thompson, M. G., Yildirim, S. Transformation of Acinetobacter baumannii: electroporation. Methods Mol Biol. 1946, 69-74 (2019).
  19. Choi, K. H., DeShazer, D., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with multiple glmS-linked attTn7 sites: example Burkolderia mallei ATCC 2334. Nat Protoc. 1 (1), 162-169 (2006).
  20. Jittawuttipoka, T., et al. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for gene cloning at a single copy number in an industrially important and phytopathogenic bacteria, Xanthomonas spp. FEMS Microbiol Lett. 298 (1), 111-117 (2009).
  21. Pérez-Varela, M., Tierney, A. R. P., Kim, J. S., Vázquez-Torres, A., Rather, P. Characterization of RelA in Acinetobacter baumannii. J Bacteriol. 202 (12), e00045(2020).
  22. Williams, C. L., et al. Characterization of Acinetobacter baumannii copper resistance reveals a role in virulence. Front Microbiol. 11, 16(2020).

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