使用外排缺陷细菌菌株和单拷贝基因表达系统表征 鲍曼不动杆 菌的多药外排系统

Summary

我们描述了一种简单的程序，使用基于 mini-Tn7 的表达系统将外排泵基因进行单拷贝染色体互补，并将其转化为鲍 曼不动杆菌的工程外排缺陷菌株。这种精确的遗传工具允许受控的基因表达，这是表征多重耐药病原体中外排泵的关键。

Abstract

鲍曼不动杆 菌因其对抗生素的广泛耐药性而被公认为一种具有挑战性的革兰氏阴性病原体。了解这种耐药性背后的机制对于设计新的有效治疗方案至关重要。不幸的是，由于缺乏合适的基因操作工具，我们在 鲍曼不动 杆菌中研究这些机制的能力受到阻碍。在这里，我们描述了利用基于染色体 mini-Tn7 的系统在缺乏功能性 RND 型外排机制的 鲍曼不动杆 菌菌株中实现单拷贝基因表达的方法。单拷贝插入和诱导型外排泵表达非常有利，因为细菌细胞通常对高拷贝数质粒上存在 RND 外排操纵子的耐受性较差。此外，将重组 mini-Tn7 表达载体掺入替代鲍 曼不动 杆菌宿主的染色体中，具有更高的外排灵敏度，有助于规避来自其他外排泵的干扰。该系统不仅对于研究未表征的细菌外排泵很有价值，而且对于评估靶向这些泵的潜在抑制剂的有效性也很有价值。

Introduction

鲍曼不动杆 菌是世界卫生组织的头等大事原体，因为它对所有类别的抗生素都具有耐药性¹。它是一种机会性病原体，主要影响住院、受伤或免疫功能低下的人。 鲍曼不动杆 菌主要 通过 外排泵逃避抗生素，最相关的是抗结瘤分裂 （RND） 出口商^{家族 2}。了解这些外排泵的机械工作原理将使人们能够开发有针对性的治疗方案。

可以特异性区分细胞过程的一种常见方法是通过基因操作。然而，可用于鲍曼不动杆菌遗传研究的工具有限，并且进一步混淆了实验设计，临床分离株通常对遗传操作中常规用于选择的抗生素具有耐药性³。在专门研究外排泵时遇到的第二个障碍是，它们受到严格监管（通常受到未知因素的影响），因此很难准确地将功能隔离并归因于单个泵⁴。鉴于需要扩展研究工具箱，我们开发了一种基于 Mini-Tn7 的单拷贝插入诱导型表达系统，该系统包含 Flp 重组酶靶标 （FRT） 盒，允许去除选择标记 ^5,6,7（图 1）。这种优雅的克隆和表达系统最初是为假单胞菌 ^8,9,10 创建的，用于将单拷贝外排泵补体生成到我们生成的鲍曼不动杆菌 （ATCC 17978::ΔadeIJK，Δ adeFGH，Δ adeAB:以下简称鲍曼不动杆菌 AB258） 的 RND 外排泵缺陷菌株中¹¹.能够一次研究一个外排泵，并且不会以高拷贝表达淹没细菌细胞（如通常在基于质粒的表达系统中看到的那样），人们可以更好地了解每个外排泵的关键生理方面，同时将干扰降至最低，并减少并发症。

本文介绍了如何使用 mini-Tn7 系统通过在 9 天内执行的一系列简单步骤，将缺失的目的基因 RND 外排泵 adeIJK 补合成鲍曼不动杆菌 AB258 的染色体⁷。第一组步骤在保守的 glmS 基因下游的单个 attTn7 插入位点（图 3A）重新引入克隆到基于 mini-Tn7 的插入质粒（图 2A）中的缺失的外排泵基因。该过程由编码 Tn7 驱动插入所需的转座酶基因的非复制辅助质粒 （图 2B） 促进。第二组步骤使用切除质粒（图2C）进行Flp重组酶介导的庆大霉素基因的去除，两侧是FRT位点（图3B），以产生未标记的菌株。虽然该系统用于阐明RND外排泵在抗生素耐药性方面的基本作用和可能的抑制剂，但它可用于研究任何感兴趣的基因。

Protocol

1.实验准备

1. 用目的基因纯化质粒pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm⁹ （插入质粒， 图2A）。
   注意:在这里，感兴趣的基因是 adeIJK。最终质粒浓度应为 ≥100 ng/μL。
2. 纯化辅助质粒（pTNS2）⁹和切除质粒（pFLP2^ab）⁶（分别为图2B，C），理想情况下最终质粒DNA浓度为≥100ng/μL。
3. 准备 50 mL 无菌超纯水和 25 mL 无菌 LB （Lennox） 肉汤（参见 材料表）。
4. 制备至少 10 LB 琼脂平板，每个平板含有以下添加剂:普通（无添加剂）、50 μg/mL 的庆大霉素 （Gm）、200 μg/mL 的羧苄青霉素 （Cb）（ 通过 氨苄青霉素耐药基因进行选择）和 5% 蔗糖（参见 材料表）。
5. 划出用于插入LB琼脂的菌株，并在37°C下孵育16-18小时。
   注意:该协议必须尽可能在无菌环境中通过使用工作台上的本生燃烧器或生物安全柜进行。所有耗材（移液器吸头、接种环、微量离心管等）都必须是无菌的。

2. 培养准备

1. 使用无菌接种环或无菌木制接种棒，将 鲍曼不动 杆菌 AB258 的单个菌落接种到无菌 13 mL 培养管中的 4 mL LB 肉汤中。
   注意:单个 4 mL 培养物用于一个样品和一个对照。根据所需的样品数量增加培养物的数量。
2. 在37°C振荡（250rpm）下孵育过夜。
3. 将一瓶无菌蒸馏水（25-50mL）置于4°C过夜，用于步骤3。

3. 电感受态电池的制备

1. 将所有无菌 1.5 mL 微量离心管（每次培养两个）和无菌电穿孔比色皿（每个培养物两个）放在冰上（参见 材料表）。在整个过程中，尽可能多地将样品放在冰上。
2. 将储存在4°C的无菌水瓶放在冰上。
3. 将 1.5 mL 过夜细菌培养物转移到其中一个 1.5 mL 微量离心管中。
4. 以13,000× g 离心2分钟以沉淀细胞。
   注意:理想情况下，离心应在4°C下进行，但环境温度离心是可以接受的，并且不会有害。
5. 使用 1 mL 移液管，在不干扰细胞沉淀的情况下除去所有上清液。
6. 将另外 1.5 mL 细菌培养物加入同一微量离心管中。以13,000× g 离心2分钟，然后除去所有上清液。
7. 用剩余的 1 mL 培养物最后一次重复步骤 3.6。
8. 向细胞沉淀中加入 1 mL 冰冷无菌水，并用轻柔的移液液管重悬，直到沉淀不再位于微量离心管的底部。
9. 将重悬细胞以13,000× g 离心2分钟。
10. 使用 1 mL 移液管小心地除去上清液。不要倒掉上清液，特别是在随后的洗涤步骤中，当细胞倾向于形成不太紧凑的沉淀时。
11. 用冰冷的无菌水重复此洗涤步骤，步骤3.8至步骤3.10，再重复两次。
12. 将最终细胞沉淀轻轻重悬于200μL冰冷无菌水中。
13. 将 100 μL 最终细胞悬液转移到第二个冰冷的 1.5 mL 微量离心管中。第二个等分试样将成为电穿孔的阴性对照。将细胞样品放在冰上。

4. 电穿孔

1. 预热每个样品的1mLLB肉汤和一个LB + Gm⁵⁰ 琼脂平板（在步骤1.4中制备），并在设置为37°C的静态培养箱中对照。
2. 在 5 μL 或更小的总体积中，将 100-200 ng pTNS2 辅助质粒和 pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK 插入质粒加入等分试样的电感受态细胞中。
3. 用指尖轻敲击混合，以确保质粒与电感受态细胞完全混合，而不会引入气泡。
4. 将等量的无菌蒸馏水加入阴性对照细胞等分试样中，并如上所述轻轻混合。
5. 将样品在冰上孵育20分钟。
6. 将整个细胞样品转移到冰冷的电穿孔比色皿中，然后将比色皿放回冰上。对阴性对照细胞样品重复上述步骤。
7. 电穿孔细胞样品。
   1. 打开电穿孔仪并将其设置为 2.0 kV （25 μF， 200 Ω）（参见 材料表）。
   2. 用软纸擦拭比色皿表面，以去除任何粘附的冰或水分。
   3. 将比色皿插入电穿孔器并进行电击。
   4. 立即将 0.9 mL 预热的 LB 肉汤加入比色皿中的细胞中，并轻轻上下移液以将细胞与培养基混合。
   5. 将整个细胞悬液转移到新的 1.5 mL 微量离心管（室温）中。
   6. 检查电穿孔仪上的时间常数值;为获得最佳结果，此值应介于 4 和 6 之间。
8. 对阴性对照细胞样品重复电穿孔程序（步骤4.7.1至步骤4.7.6）。
9. 将电穿孔样品在37°C下以250rpm孵育1小时，以允许细胞回收。
10. 使用接种撒布器，将每个电穿孔细胞样品的100μL铺在预热的LB + Gm⁵⁰ 琼脂平板上。
    1. 将剩余样品以13,000× g 离心2分钟以沉淀细胞。
    2. 使用移液管除去所有上清液后，将细胞重悬于100μLLB肉汤中。
    3. 将每个样品铺在单个预热的LB + Gm⁵⁰ 琼脂平板上。
       注意:电穿孔效率可能取决于应变。首次对菌株进行电穿孔时，可以板出不同体积的电穿孔样品，甚至稀释度，以确保所得板具有分离的菌落。
11. 将板在37°C孵育16-18小时。

5. 选择转化菌落进行基于PCR的筛选

1. 检查电穿孔板。阴性对照不应有菌落;样品应具有不同的菌落。
   注意:在这一步以及产生带有菌落或贴片的琼脂平板的所有后续步骤中，具有菌落的平板可以在4°C下储存长达3天，然后再继续。
2. 使用无菌牙签，从LB + Gm⁵⁰ 琼脂平板中取出多达10个单菌落，并将它们贴在新鲜的LB + Gm⁵⁰ 琼脂平板上。
3. 将板在37°C孵育16-18小时。

6. 通过菌落PCR验证染色体插入

1. 从培养箱中取出含有贴片菌落的LB + Gm⁵⁰ 琼脂平板。
2. 使用无菌牙签或无菌移液管吸头，将贴片中的一小部分（约一个大菌落大小）从贴片中取出到0.2 mL PCR管中的20 μL无菌蒸馏水中;搅拌均匀。当细胞从牙签中释放出来时，水样应该变得明显浑浊。准备任意数量的需要筛选的样品，但 6 个就足够了。
3. 将含有细菌悬浮液的PCR管在100°C下孵育5-10分钟。
4. 使用微型离心机（参见 材料表），以固定的最大速度旋转样品2分钟以沉淀细胞碎片。
5. 将上清液转移到新的 0.2 mL PCR 管中，并将其置于冰上。该样品包含用于PCR反应的模板DNA。
   注意:在进行PCR之前，该模板DNA可以储存在-20°C。
6. 制备含有 1x 聚合酶缓冲液、200 μM dNTP、0.18 μM ABglmS2_F_New正向引物、0.18 μM Tn7R 反向引物（表 1）、1 U Taq DNA 聚合酶和 1 μL 制备的模板 DNA 的 PCR 反应混合物，总体积为 25 μL。 制备无模板对照（NTC），包括除模板DNA以外的所有DNA（参见 材料表）。
7. 将反应条件输入热循环仪:95°C2分钟;95°C30秒，49°C30秒，72°C30秒，共35个循环;72°C10分钟;12°C保持。运行示例。
8. 将DNA上样染料加入至终浓度为1x后，将10μL每个PCR反应上样于2%琼脂糖凝胶上，并在80V下运行40分钟。该引物对的预期扩增子大小为 382 bp。NTC 不应有条带。
9. 确定产生预期PCR产物的样品。从任何PCR阳性贴片在LB + Gm⁵⁰ 琼脂平板上制备条纹板;在37°C孵育16-18小时。目标是生成具有单个菌落的板，用于制备甘油储备液以保存该标记菌株，并作为创建未标记菌株的起点（如下所述）。

7. 使用 pFLP2^ab 去除 Gm R 标记物

1. 按照步骤 2:培养物制备中提到的步骤进行操作。用于制备过夜培养物的样品是来自LB + Gm⁵⁰ 琼脂平板的单个菌落，在步骤6.9中制备以产生离散菌落。
2. 按照步骤3中提到的步骤:电感受态电池的制备。从过夜培养物中制备细胞进行电穿孔。
3. 按照步骤4:电穿孔中提到的步骤进行操作。在这里，引入细胞的质粒是pFLP2^ab （100-200ng），它将去除庆大霉素抗性基因，位于染色体插入的感兴趣基因的侧翼。
4. 细胞恢复1小时（步骤4.9）后，将100μL电穿孔细胞样品铺在预热的LB + Cb²⁰⁰ 琼脂平板上（在步骤1.4中制备）。这种选择性压力确保只有携带 pFLP2^ab 切除质粒的细胞才能生长。
5. 将板在37°C孵育16-18小时。
6. 检查平板是否有菌落。阴性对照板不应有菌落;LB + Cb²⁰⁰ 琼脂样品板应具有不同的菌落。
7. 使用无菌牙签，将多达 20 个分离的菌落交叉贴在 LB + Cb²⁰⁰ 琼脂平板和 LB + Gm⁵⁰ 琼脂平板上。
8. 将板在37°C下孵育16-18小时。
9. 检查板是否有补丁。在 LB + Cb²⁰⁰ 琼脂平板上生长但不在 LB + Gm⁵⁰ 琼脂平板上生长的克隆已从原始插入片段中去除庆大霉素抗性基因。
10. 选择对羧苄苄青霉素耐药且庆大霉素易在补充有 5% （w/v） 蔗糖的单个 LB 琼脂平板上划线的贴片，这迫使 pFLP2^ab 质粒从细菌中排出。最多选择 10 个菌落。
11. 将板在37°C下孵育16-18小时。
12. 检查平板是否有菌落。
13. 作为pFLP2^ab 质粒丢失的最终确认，将5%蔗糖平板中的4-6个分离菌落交叉贴片到LB + Cb²⁰⁰ 琼脂平板和LB琼脂平板上。
14. 将板在37°C下孵育16-18小时。
15. 选择在LB琼脂平板上生长的克隆，该克隆对制备甘油原液对羧苄青霉素敏感，以保存这种未标记的菌株。
    1. 使用靶向庆大霉素抗性基因的引物，可以通过集落PCR（步骤6:通过集落PCR验证染色体插入）对未标记菌株进行基因验证。
    2. 制备含有 1x 聚合酶缓冲液、200 μM dNTP、0.18 μM Gm_F正向引物、0.18 μM Gm_R反向引物（表 1）、1 U Taq DNA 聚合酶和 1 μL 制备的模板 DNA 的 PCR 反应混合物，总体积为 25 μL。 制备一个无模板对照（NTC），包括除模板DNA以外的所有模板， 以及使用来自标记菌株的 DNA 的阳性对照。
    3. 将反应条件输入热循环仪:95°C2分钟;95°C30秒，50°C30秒，72°C40秒，共35次循环;72°C10分钟;12°C保持。运行示例。
    4. 在加入DNA上样染料至终浓度为1x后，将10μL每个PCR反应上样于1%琼脂糖凝胶上，并在80V下运行40分钟。该引物对的预期扩增子大小为 525 bp。阳性对照应具有单个条带;样品和NTC不应有条带。

Results

染色体插入过程在3天内总共只需要2小时，即可看到在选择性琼脂平板上生长的结果菌落（图1A-C）。转化板上的预期菌落数量取决于菌株:人们可能会看到 20-30 甚至数百个菌落，因为在 attTn7 位点插入 Tn7 是特异性和有效的⁹。将转化板菌落贴到选择性培养基上（图4A）可保留转化的菌株，并为菌落PCR筛选提供起始材料（图1E和图4B）。通过PCR筛选菌落可以保持在最低限度 - 需要处理的菌落不超过10个，并且大多数菌落应产生阳性结果进行插入。用于筛选引物ABglmS2_F_New和Tn7R的PCR产物（表1）为382 bp（图4B泳道4）;反应的阴性对照包括野生型鲍曼不动杆菌ATCC 17978（图4B泳道2），AB258（图4B泳道3）和无模板（图4B泳道5）。PCR阳性的菌落代表互补的标记菌株。

去除庆大霉素抗性基因（无标记）需要不到 3 小时，跨越 6 天，因为需要通过选择性接种选择用切除质粒转化的细胞，然后需要从细菌中固化切除质粒（图 1F）。基于 Flp-FRT 重组的切除术精确有效，应在转化板上产生 ≥20 个菌落。交叉贴片到羧苄西林（选择切除质粒赋予的β-内酰胺类耐药性）和庆大霉素（寻找庆大霉素耐药性的丧失）上的集落都应分别对羧苄西林耐药和庆大霉素敏感。通过在5%蔗糖琼脂平板上生长，将切除质粒从细菌中挤出。蔗糖上的生长迫使细胞消除 pFLP2^抗体，因为质粒上的 sacB 基因促进蔗糖转化为 levans，一种对细菌有毒的多糖^12,13。所有在5%蔗糖培养基上生长的菌落应仅在普通LB琼脂平板上生长;羧苄青霉素琼脂平板上不应有生长。在普通LB琼脂平板上生长的菌落代表未标记的菌株。确认庆大霉素标志物的丢失可以通过使用Gm_F和Gm_R引物的菌落PCR来实现（表1和图5）。该引物对仅在阳性对照中产生 525 bp 的扩增子（最初创建的标记菌株，图 5 泳道 4）;野生型ATCC 17978（图5泳道2）、AB258（图5泳道3）、任何测试菌落（图5泳道5）和无模板对照（图5泳道6）不应显示扩增。

一旦确认了未标记的菌株，就可以开始进行表型测定功能测试。在这里，显而易见的首选是确定一系列抗生素的最低抑制浓度 （MIC）:环丙沙星是 AdeIJK 的已知底物，四环素可以被 AdeIJK 去除（主要的外排泵是 AdeAB），卡那霉素对鲍曼不动杆菌 ATCC 17978 ^2,14 的影响相对较小。根据CLSI指南¹⁵使用肉汤微稀释方法，在不存在和存在50μM IPTG的情况下，用每种抗生素攻击补充的未标记菌株AB258::adeIJK;野生型菌株ATCC 17978和RND外排缺陷菌株AB258作为对照（表2）。总体而言，在 MIC 值中看到的趋势表明 AB258::adeIJK 对环丙沙星和四环素的敏感性降低，并诱导外排泵表达，验证了 adeIJK 的插入是成功的。

图 1:程序概述。 （A） 制备要补充的鲍曼不动杆菌菌株的过夜培养物。（B）通过离心将过夜培养物的细胞用水洗涤3次并保持在冰上。（C）将递送质粒和辅助质粒加入细胞中，并在冰上孵育20分钟。电穿孔样品，加入LB培养基，并让细胞在37°C下恢复1小时。 将100μL等分的细胞铺在LB + Gm⁵⁰琼脂平板上，并在37°C下孵育过夜。（D）将来自转化板的菌落贴贴在LB + Gm⁵⁰琼脂平板上，并在37°C下生长过夜。 （E）制备用于PCR的修补菌落，以筛选是否存在跨越染色体插入位点的扩增产物。通过琼脂糖凝胶电泳可视化PCR扩增。PCR阳性样本代表目标基因成功插入染色体并产生标记菌株。（F）如步骤（A-C）制备庆大霉素阳性的菌落，对pLFP2^ab质粒进行电穿孔，以从染色体插入中去除庆大霉素盒。LB + Cb²⁰⁰琼脂上的选择性接种证实了质粒的摄取。LB + Cb²⁰⁰ 和 LB + Gm⁵⁰ 琼脂平板上的重复修补显示 Cb^R 和 Gm^S 的菌落，证实庆大霉素盒因插入而丢失。在 5% 蔗糖上生长选定的 Cb^R 菌落可治愈细胞中的 pLFP2^ab 质粒。将来自5%蔗糖平板的菌落贴贴在LB + Cb²⁰⁰琼脂和LB琼脂上，以显示所需的Cb^S和Gm^S菌落并确认未标记菌株的产生。Gm⁵⁰，庆大霉素 50 μg/mL;Cb²⁰⁰，羧苄青霉素，200 μg/mL;^R， 耐性;^S，敏感。请点击这里查看此图的较大版本.

图2:该协议中使用的质粒。 （A） pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gam（插入质粒）、（B） pTNS2（辅助质粒）和 （C） pFLP2^ab （切除质粒）的一般质粒图。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 3:插入和取消标记的原理图。 （a） 插入。鲍曼不动杆菌染色体中的单个 Tn7 插入位点位于距 glmS2 基因末端 24 bp 处。插入质粒和辅助质粒的共电穿孔允许目的基因（插入基因，紫色）与插入盒的其余部分（用于标记切除的 FRT 位点，黄色;庆大霉素耐药的accC1基因，绿色;lacIq基因用于诱导表达，蓝色）进入染色体。（b） 不标记。用 pFLP2^ab 切除质粒对互补的标记插入菌株进行电穿孔有助于通过 Flp-FRT 重组（FRT 位点，黄色）去除庆大霉素抗性基因（accC1，绿色），从而产生未标记的菌株。请点击这里查看此图的较大版本.

图 4:通过菌落 PCR 进行转化、修补和插入确认。 （A）修补后转化菌落的生长，以及（B）用ABglmS_F_New（灰色）和Tn7R（橙色）引物进行菌落PCR扩增以确认染色体插入的代表性结果。泳道 1:低分子量 DNA 分子量标准;车道 2:ATCC 179798;3号车道:AB258;泳道 4:AB258::adeIJK-LAC-Gm;泳道 5:无模板控制。标记了 382 bp 的预期波段。请注意，庆大霉素特异性引物（Gm_F和Gm_R，绿色）也可用于确认染色体插入。 请点击这里查看此图的较大版本.

图5:通过菌落PCR确认标记物丢失。 使用庆大霉素特异性引物（Gm_F 和 Gm_R）进行菌落 PCR 扩增的代表性结果， 以确认通过 基于 pFLP^抗体的切除确认抗生素标志物的丢失。泳道 1:低分子量 DNA 分子量标准;车道 2:ATCC 179798;3号车道:AB258;泳道 4:AB258::adeIJK-LAC-Gm;泳道 5:AB258::adeIJK;泳道 6:无模板控制。标记了 525 bp 的预期波段。 请点击这里查看此图的较大版本.

菌株、质粒和引物	相关特性	参考
染色
鲍曼不动杆菌 ATCC编号:17978	类型应变	ATCC公司
鲍曼不动杆菌 ATCC 17978 AB258型	ΔadeAB，Δ adeFGH，Δ adeIJK	11
质 粒
pUC18T-miniTn7T-GM-LAC	GmR，放大器R	9
pUC18T-miniTn7T-GM-LAC-adeIJK	GmR、AmpR、 adeIJK	本研究
pTNS2型	放大器R	9
pFLP2抗体	pWH1266 起源或复制，sacB，AmpR	7
引	序列 （5′–3′）
ABglmS_F_New	CACAGCATAACTGGACTGATTTC	7
TN7R型	TATGGAAGAAGTTCAGGCTC	7
Gm_F	TGGAGCAGCAACGATGTTAC	本研究
Gm_R	TGTTAGGTGGCGGTACTTGG	本研究

表1:本方案中使用的细菌菌株，质粒和引物。 GM，庆大霉素;Amp，氨苄西林; ^R， 耐药。

	环丙沙星		四环素		卡那霉素
IPTG公司	−	+	−	+	−	+
ATCC编号:17978	0.250	钕	0.500	钕	1.5	钕
AB258型	0.031	钕	0.063	钕	4	钕
AB258::adeIJK	0.016	0.063	0.031	0.125	8	2
折叠变化		4.01		4.03		0.25

表2:通过抗生素敏感性测试插入基因的功能。鲍曼不动杆菌 ATCC 17978、AB258、未诱导的 AB258::adeIJK 和 IPTG 诱导的 AB258::adeIJK 与环丙沙星、四环素和卡那霉素的最低抑制浓度 （MIC） 值比较。倍数变化 = 诱导 （+ IPTG）/非诱导 （− IPTG）;nd = 未确定。

Discussion

尽管在 鲍曼不动杆 菌中插入可诱导的单拷贝基因表达系统的染色体插入过程在技术上很简单且不费力，但有几个重要步骤需要强调。首先，感受态细胞的制备需要尽可能在冰上进行，因为在用冰冷水替换培养基的过程中细胞会变得脆弱。理想情况下，离心步骤在4°C下进行，但在室温下离心是可以接受的。鉴于水洗过程中细胞的脆弱性越来越强，轻柔的移液也很重要。其次，电穿孔对离子的存在很敏感。用多轮沉淀洗涤细胞并重悬于水中，确保培养基被完全去除。此外，质粒应新鲜纯化，只要质粒DNA浓度足够高，就可以在标准试剂盒洗脱缓冲液（通常为TE缓冲液）中洗脱。我们的目标是在 100 μL 细胞悬液中加入 <5 μL 质粒，以保持样品的离子强度非常低，但最多可耐受 10 μL。第三，应根据需要制备选择性琼脂平板，以确保添加抗生素的疗效。请注意，在切除质粒pFLP2^ab的转化过程中，使用羧苄青霉素代替通常的氨苄青霉素进行选择。 鲍曼不动杆 菌对氨基青霉素（氨苄青霉素）具有内在耐药性¹⁶;替换羧基青霉素（羧苄西林）允许用质粒编码的β-内酰胺酶继续选择。

实验方案的优化更加细致入微，并且在不同种类的 不动杆菌 （甚至是同一物种中的基因操作菌株）以及实验室中使用的特定试剂之间会有所不同。例如，用于电穿孔的电压可以在 1.8 到 2.5 kV 之间变化，并且根据用于 PCR 的 DNA 聚合酶，可能需要稍微改变热循环条件。电穿孔后细胞生长不良的有用提示包括将琼脂平板中庆大霉素的浓度从50μg/mL降低到30μg/mL和/或将琼脂平板的孵育时间延长至≥24小时。关于去除庆大霉素盒的步骤，如果羧苄青霉素耐药性持续存在，则使用含有10%蔗糖的LB琼脂平板和/或在30°C下孵育≥24小时可能会获得更好的成功。

在文献中可以找到许多用于电穿孔的鲍曼不动杆菌细胞制备方法，但它们通常包括初始过夜培养后的传代培养步骤，然后是长生长期至规定的光密度。我们发现，简单的隔夜培养也可以同样有效地使用。鲍曼不动杆菌的电穿孔已经得到了很好的描述，读者可以在这里进一步了解协议的这一特定方面^17,18。与基于质粒的互补系统相比，这种 mini-Tn7 染色体基因互补系统的主要优点是通过 IPTG 可控的 lacI^q 阻遏蛋白系统调节互补基因的表达水平，并选择通过以下方式去除庆大霉素标记物（aacC1 基因）侧翼的 FRT 站点。据观察，细胞对外排泵表达的耐受性可能因插入的泵而异。例如，与AdeABC或AdeFGH相比，细胞对AdeIJK的表达更敏感;这可以通过改变培养条件下IPTG的浓度来解决。由于持续的选择压力，去除抗生素标记物可降低菌株的突变风险，并且还可以进行不受限制的抗生素敏感性研究³。

这种 mini-Tn7 系统已成功用于假单胞菌^9、10、耶尔森菌 ⁹、伯克霍尔德菌¹⁹、黄单胞菌²⁰ 和不动杆菌^{5、6、21、22} 种，但存在一些局限性。例如，在鲍曼不动杆菌中，基因组⁵ 中只有一个功能性 attTn7 插入位点，因此可以创建具有多个缺失的菌株，但一次只能互补一个基因。此外，该系统尚未被证明对革兰氏阳性菌^{有效 10}.

RND 外排泵是 鲍曼不动杆菌抗生素耐药性的重要促进剂。它们之所以如此强大，是因为它们的三部分结构横跨内膜和外膜，允许将抗生素从周质去除到细胞外。研究最多和无处不在的 RND 泵 - 命名为 AdeABC、AdeFGH 和 AdeIJK——已被证明可以消除涵盖所有类别的抗生素。详细阐明外排泵的功能将为设计针对多重耐药菌株的新治疗方案提供良好的起点。使用 AB258 三重 RND 泵缺失菌株并一次补充一个泵，可以独立于其他泵对每个泵进行研究，辨别每个泵独特的底物特征和最有效的抑制剂。当然，外排泵在细菌的正常功能中也具有"日常"作用。了解这些作用可能导致泵的间接瘫痪，这反过来又会中断抗生素的外排，可能使多重耐药细菌再次对常用抗生素敏感。 通常，mini-Tn7 系统可用于引入任何感兴趣的基因进行详细研究或有用的标记物，例如用于显微成像的荧光蛋白⁶。

多重耐药细菌的日益流行是我们所有人都关心的问题。了解外排泵在 鲍曼不动杆 菌等病原体中提供的保护机制对于对抗严重感染至关重要。这种染色体单拷贝基因表达系统是机制研究以及鉴定抑制外排泵功能抑制剂的有力工具。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR 管	VWR	20170-012	用于菌落煮沸制备和 PCR 反应
1.5 mL 微量离心管	Sarstedt	72-690-301	通用型
13 mL 培养管，Pyrex	Fisher	14-957K	液体培养容器
6x DNA 上样缓冲液	Froggabio	LD010	琼脂糖凝胶电泳样品上样染料
酸酸，冰川	Fisher	351271-212	琼脂糖凝胶电泳缓冲液组分
琼脂	Bioshop	AGR003	固体生长培养基
琼脂糖	BioBasic	D0012	PCR 反应产物的电泳分离;在浓度为 0.8&ndash 下使用;2%
琼脂糖凝胶电泳装置	Fisher	29-237-54	琼脂糖凝胶电泳;PCR 反应产物的分离
羧苄青霉素	Fisher	50841231	选择性培养基
培养管盖	Fisher	13-684-138	用于 13 mL 培养管的不锈钢盖
三磷酸脱氧核苷酸 （dNTP） 套件	Biobasic	DD0058	PCR 反应组分;以 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 100 mM 的形式提供;混合并稀释每个 dNTP 10 mM
干浴/模块加热器	Fisher	88860023	用于煮沸制备的 Isotemp 数字干浴
电穿孔比色皿	VWR	89047-208	带圆盖的 2 mm 电穿孔比色皿
	Cole Parmer	940000009	110 VAC，60 Hz 电穿孔仪
溴化乙锭	Fisher	BP102-1	琼脂糖凝胶中 PCR 反应产物和 DNA 标记
乙二胺四乙酸 （EDTA）	VWR	CA-EM4050	琼脂糖凝胶电泳缓冲液组分
庆大霉素	生物基	GB0217	用于制备选择性培养基
甘油	Fisher	G33	制备用于在超低温冰箱中长期储存的细菌原液
培养箱（振荡）	New Brunswick Scientific	M1352-0000	Excella E24 培养箱摇床，用于液体培养物生长
培养箱（静态）	Fisher	11-690-550D	等高温培养箱 烘箱型号 550D，用于固体（LB 琼脂）培养物生长
接种环	Sarstedt	86.1562.050	琼脂平板上划线菌
接种撒布器	Sarstedt	86.1569.005	撒布在琼脂平板上培养
溶原肉汤 （LB） 肉汤，Lennox	Fisher	BP1427	液体生长培养基（20 g/L：5 g/L 氯化钠、10 g/L 胰蛋白胨、5 g/L 酵母提取物）
微量离心机	Fisher	75002431	Sorvall Legend Micro 17 用于样品离心
微型离心	Fisher	S67601B	0.2 mL PCR 管
培养皿	SPL Life Sciences	10090	对于固体生长培养基（琼脂板）：90 x 15 mm
移液器	Mandel	各种	Gilson 单通道移液器（P10、P20、P200、P1000）
电源	Biorad	1645050	PowerPac 电泳基本电源
引物	IDT	NA	PCR 反应组分;对目标基因具有特异性;在 100 μ 制备;M 按照产品规格表上的指示
蔗糖	BioBasic	SB0498	中去除 pFLP2ab 质粒
			;聚合酶与 10x 缓冲液一起提供
热循环仪	Biorad	1861096	Model T100，用于 PCR
牙签	Fisher	S24559	用于将菌落修补到琼脂平板上
Trizma base	Sigma	T1503	琼脂糖凝胶电泳缓冲液组分
超纯水	Millipore Sigma	ZLXLSD51040	MilliQ 水净化系统：用于培养基和溶液制备以及细胞洗涤的超纯水
宽范围 DNA 标记	Biobasic	M103R-2	琼脂糖凝胶上 PCR 产物的大小测定
木制接种棒	Fisher	29-801-02	用琼脂平板上的菌落接种培养物