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方法文章

穿刺伤止血及用于拼接大范围电子显微镜分析的样品制备

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DOI：

10.3791/66479

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2024年5月24日

 ,  , 
1Department of Physiology and Cell Biology, University of Arkansas for Medical Sciences

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于止血性血栓形成的穿刺损伤实验方法。所形成的血栓体积较大，直径可达数百微米，因此适用于三维成像技术。我们建议采用拼接的大范围透射电子显微镜成像作为一种分辨率较高且易于广泛获取的技术，并详细描述了相应的样品制备方案。

摘要

止血是机体对血管损伤进行正常生理调控的过程，对人类生命至关重要。我们时常会遭受轻微的切割伤或穿刺伤。在止血过程中，血小板发生自限性聚集，形成结构化的血栓，通过从外部封堵破损处来实现止血。对该结构的深入表征有助于区分止血与血栓形成——后者是血小板过度聚集导致阻塞性凝血的病理状态。本文介绍一种基于成像技术的穿刺伤口血栓结构研究方法，该方法利用薄层电子显微镜观察止血性血栓内部结构的能力。任何基于成像的实验方案中最基本的步骤均为良好的样品制备。本方案详细描述了在小鼠中制备穿刺伤口及富含血小板血栓以进行后续电子显微镜分析的具体操作流程。文中提供了详细的步骤说明，包括 原位 形成穿刺伤口血栓的固定，以及后续用于染色和电镜观察的包埋处理。选择电子显微镜作为最终成像技术，是因为其结合连续切片技术后，能够以高分辨率可视化血栓内部的精细结构。作为一种成像方法，电子显微镜可实现无偏倚取样，实验结果可在二维或三维空间中覆盖从纳米到毫米尺度的范围。文中引用了合适的免费电子显微镜软件，支持大范围电子显微成像，可将数百幅图像融合，从而实现对整个穿刺伤口血栓横截面的纳米级成像。因此，图像文件中的任何子区域均可轻松置于完整横截面的上下文中进行分析。

引言

穿刺伤口处血栓的形成以实现止血，是生命过程中最关键的事件之一1。然而，尽管这一过程至关重要，人们对血栓形成过程中发生的结构变化——无论是在静脉、动脉、动脉粥样硬化事件中，还是在闭塞性血栓中——的认识，一直受到成像分辨率和成像深度的限制。传统的光学显微镜在成像深度上无法满足完整穿刺伤口血栓（在Z轴方向可达200至300 µm1 ）的需求，其分辨率也无法匹配血小板细胞器及其间距的尺寸（通常小于30 nm）2。双光子光学显微镜虽可提供所需的成像深度，但分辨率提升有限。近年来光学显微技术的最新进展，例如超分辨率成像技术，实际上仍受限于分辨率（XY方向约20 nm，Z方向为其两倍）和成像深度（不高于传统光学显微镜）。此外，超分辨率光学显微镜与大多数研究用光学显微技术一样，依赖于荧光显微技术，而该技术本质上仅适用于少数已有优质抗体或良好标记构建体的目标蛋白3。综上所述，传统的扫描电子显微镜最多只能观察到富含血小板的血栓形成过程中的表面结构。

为了克服这些在表征血栓结构方面的技术局限，我们设定了三个目标。首先，可重复地在小鼠的静脉或动脉中制造出明确的穿刺伤口，并能够通过化学固定在原位（in situ）进行有效稳定。其次，采用一种以膜结构保存为重点的制备方法，以实现精确定位正....

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方案

实验经阿肯色大学医学科学分校的机构动物护理与使用委员会（IACUC）审查并批准。本研究使用8至12周龄的野生型雄性和雌性C57BL/6小鼠。这些小鼠为年轻成年个体，脂肪积累较少。相同的操作流程也适用于与止血相关的重要蛋白（如血管性血友病因子或血小板糖蛋白VI（GPVI））基因突变的小鼠5,6。所有使用的设备、手术器械、试剂及其他材料均在图1中展示，并列于材料表中。

1. 颈静脉/股动脉穿刺伤口1,7

  1. 小鼠麻醉
    1. 将小鼠放入诱导室，并将异氟烷蒸发器调至高流量设置（500 mL/min，3% 异氟烷）。选择异氟烷是因为其对血管直径影响较小。
      注意：长期暴露于异氟烷可能导致不良健康效应。使用低流量蒸发器、麻醉气体吸附罐以及良好的房间通风可显著减少暴露风险。
    2. 当小鼠呈现睡眠状态时，轻捏其一只脚趾以观察是否有反应。若有反应，则将小鼠放回诱导室数分钟，再重复进行捏趾测试。若无反应，则将其仰卧置于加热板上（预先覆盖铝....

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结果

药物对穿刺伤口出血时间影响的定量分析
穿刺伤口出血时间提供了一种可在小鼠中便捷实施的药物风险生理模型。穿刺伤口实验所得结果具有预测性。本文展示了达比加群剂量-反应出血曲线。达比加群是一种凝血酶抑制剂，作为口服直接作用抗凝药（即所谓的DOAC12）使用。通过颈静脉穿刺伤口模型，评估不同剂量达比加群因延迟血栓形成而导致潜在出血时间延长的固有风险。在颈静脉穿刺前20分钟，经静脉（i.v.）给予15、50或150 μg/kg不同剂量的达比加群。我们展示了在不同浓度达比加群下的平均出血时间（图4）。在该剂量水平下，观察到出血时间显著延长，p <0.051。这表明该药物在人类使用中存在显著风险因素。实验表明，这些剂量的药物对正在形成的血栓超微结构具有显著影响。

评估穿刺伤口血栓形成过程中血小板的活化状态
WA-TEM 方法在低倍镜下可.......

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讨论

我们介绍一种详细的穿刺损伤方法，用于在颈静脉和股动脉中形成止血性血栓，及其 原位 灌注固定及用于拼接宽视野透射电子显微镜的样品处理。整体操作流程适用于生成用于超微结构分析的止血性血栓，并可用于比较实验小鼠的出血时间，例如接受不同类型和剂量药物处理的小鼠。该方法也适用于比较对照野生型小鼠与基因敲除小鼠（如血小板中与黏附配体相互作用的各种糖蛋白的基因敲除小鼠）的出血时间，并进一步进行高分辨率电子显微镜分析。该方案可轻松调整为以免疫荧光分析作为主要检测手段，但会失去电子显微镜在结构细节上的优势。另一方面，免疫荧光是定位结构内蛋白质分布的重要工具。与任何技术方案相同，本流程中某些步骤尤为关键，同时存在若干可作为选择节点的关键步骤，这些节点对后续分析具有重要意义。

关键步骤、后续分析的选择要点以及局限性描述如下。实际穿刺步骤：使用注射器针头以25°角对静脉或动脉进行穿刺。这种方法可最大程度降低同时刺穿静脉或动脉两侧壁的风险。而90°角穿刺则可最大程度避免刮伤血管内皮层或损伤血管外侧的血管外胶原基质，但同时会增加刺穿血管两侧壁的风险。具体角度选择取决于操作者的经验、手法和信心.......

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披露

作者与本研究无利益冲突。

致谢

作者感谢阿肯色大学医学科学学院（Jerry Ware 和 Sung W. Rhee）、宾夕法尼亚大学（Tim Stalker 和 Lawrence Brass）、肯塔基大学（Sidney W. Whiteheart 和 Smita Joshi）以及美国国立卫生研究院生物成像与生物工程研究所（Richard D. Leapman 和 Maria A. Aronova）的同事们，从他们那里我们学到了许多知识。作者对美国心脏协会以及美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所提供的经费支持表示感谢（项目编号：R01 HL119393、R56 HL119393、R01 155519 至 BS，以及 NIH 资助项目 R01 HL146373 和 R35 HL150818 的子课题资助）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9% 生理盐水溶液MedlineBHL2F7123HH
27G × 3/4 EXELint 头皮静脉套管MedlineNDA26709
30G × 1/2 EXELint 皮下注射针头MedlineNDA264372
33G × 1/2 EXELint 专用皮下注射针头MedlineNDA26393
50 mL 圆底离心管Fisher Scientific06-443-20
酒精消毒片（70% 异丙醇）MedlineMDS090670Z
铝箔Fisher Scientific01-213-100
动物加热板Physitemp InstrumentsHP-1M
Araldite GY 502Electron Microscopy Sciences10900
Axiocam 305 Color R2 显微镜相机Carl Zeiss Microscopy426560-9031-000
BD Luer-Lok 注射器，20 mLMedlineB-D303310Z
氯化钙Fisher ScientificC79-500
细胞培养皿 35 mm × 10 mmCorning Inc.430165
棉签MedlineMDS202055H
DMP-30 活化剂Electron Microscopy Sciences13600
十二烯基琥珀酸酐 / DDSAElectron Microscopy Sciences13700
敷料镊，5"，弯曲，带齿，尖端窄Integra Miltex6-100
敷料镊，5"，标准型，带齿Integra Miltex6-6
EMBED 812 树脂Electron Microscopy Sciences14900
无水乙醇，200 proofElectron Microscopy Sciences15055
Fisherbrand 四格试管架Fisher Scientific03-448-17
Fisherbrand 数字计时器Fisher Scientific14-649-17
Fisherbrand 单通道注射泵Fisher Scientific7801001
纱布海绵 2" × 2"，4 层MedlineNON26224H
戊二醛（10% 溶液）Electron Microscopy Sciences16120
异氟烷液体吸入麻醉剂，100 mLMedline66794-017-10
珠宝匠式精细镊子，5F 型Integra Miltex17-305需要 2 对。
L/S 泵用硅胶管，L/S 15，25 英尺VWRMFLX96410-15
L-天冬氨酸Fisher ScientificBP374-100
硝酸铅Fisher ScientificL-62
孔雀绿 4Electron Microscopy Sciences18100
Masterflex L/S Easy-Load II 泵头VWRMFLX77200-62
Masterflex L/S 可调速数字驱动器VWRMFLX07528-10
MSC Xcelite 5" 剪线钳Fisher Scientific50-191-9855
四氧化锇 4% 水溶液Electron Microscopy Sciences19150
多聚甲醛（16% 溶液）Electron Microscopy Sciences15710
Physitemp 温度控制器Physitemp InstrumentsTCAT-2LV
亚铁氰化钾Sigma-AldrichP-8131
环氧丙烷，ACS 级试剂Electron Microscopy Sciences20401
Pyrex 玻璃烧杯Fisher Scientific02-555-25B
小鼠直肠温度探头Physitemp InstrumentsRET-3
Scotch Magic 透明胶带，3/4" × 1000"3M Company305289
0.2 M 二甲胂酸钠缓冲液，pH 7.4Electron Microscopy Sciences11623
SomnoFlo 低流量电子蒸发器Kent ScientificSF-01
SomnoFlo 小鼠起始套装Kent ScientificSF-MSEKIT
不锈钢显微钉Fine Science Tools26002-10
体视显微镜 steREO Discovery.V12Carl Zeiss Microscopy495015-9880-010
Sylgard 184 硅橡胶World Precision InstrumentsSYLG184硅胶垫
单宁酸Electron Microscopy Sciences21700
硫代碳酰肼（TCH）Sigma-Aldrich88535
醋酸铀酰Electron Microscopy Sciences22400
Vannas 弹簧显微剪Fine Science Tools15000-08
Von Graefe 眼科敷料镊，2.75"，弯曲，带齿Integra Miltex18-818需要 2 对。
Wagner 剪刀Fine Science Tools14068-12
Wahl MiniFigura 动物修剪器Braintree ScientificCLP-9868
Zen Lite 软件Carl Zeiss Microscopy410135-1001-000

参考文献

  1. Rhee, S. W., et al. Venous puncture and wound hemostasis results in a vaulted thrombus structured by locally nucleated platelet aggregates. Comm Biol. 4 (1), 1090(2021).
  2. Pokrovskaya, I. D., et al.

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血小板聚集血栓结构样本制备小鼠模型灌注固定大范围成像连续切片血管损伤
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