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穿刺伤止血及用于拼接大范围电子显微镜分析的样品制备

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DOI：

10.3791/66479

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2024年5月24日

 ,  , 
1Department of Physiology and Cell Biology, University of Arkansas for Medical Sciences

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于止血性血栓形成的穿刺损伤实验方法。所形成的血栓体积较大，直径可达数百微米，因此适用于三维成像技术。我们建议采用拼接的大范围透射电子显微镜成像作为一种分辨率较高且易于广泛获取的技术，并详细描述了相应的样品制备方案。

摘要

止血是机体对血管损伤进行正常生理调控的过程，对人类生命至关重要。我们时常会遭受轻微的切割伤或穿刺伤。在止血过程中，血小板发生自限性聚集，形成结构化的血栓，通过从外部封堵破损处来实现止血。对该结构的深入表征有助于区分止血与血栓形成——后者是血小板过度聚集导致阻塞性凝血的病理状态。本文介绍一种基于成像技术的穿刺伤口血栓结构研究方法，该方法利用薄层电子显微镜观察止血性血栓内部结构的能力。任何基于成像的实验方案中最基本的步骤均为良好的样品制备。本方案详细描述了在小鼠中制备穿刺伤口及富含血小板血栓以进行后续电子显微镜分析的具体操作流程。文中提供了详细的步骤说明，包括 原位 形成穿刺伤口血栓的固定，以及后续用于染色和电镜观察的包埋处理。选择电子显微镜作为最终成像技术，是因为其结合连续切片技术后，能够以高分辨率可视化血栓内部的精细结构。作为一种成像方法，电子显微镜可实现无偏倚取样，实验结果可在二维或三维空间中覆盖从纳米到毫米尺度的范围。文中引用了合适的免费电子显微镜软件，支持大范围电子显微成像，可将数百幅图像融合，从而实现对整个穿刺伤口血栓横截面的纳米级成像。因此，图像文件中的任何子区域均可轻松置于完整横截面的上下文中进行分析。

引言

穿刺伤口处血栓的形成以实现止血，是生命过程中最关键的事件之一1。然而，尽管这一过程至关重要，人们对血栓形成过程中发生的结构变化——无论是在静脉、动脉、动脉粥样硬化事件中，还是在闭塞性血栓中——的认识，一直受到成像分辨率和成像深度的限制。传统的光学显微镜在成像深度上无法满足完整穿刺伤口血栓（在Z轴方向可达200至300 µm1 ）的需求，其分辨率也无法匹配血小板细胞器及其间距的尺寸（通常小于30 nm）2。双光子光学显微镜虽可提供所需的成像深度，但分辨率提升有限。近年来光学显微技术的最新进展，例如超分辨率成像技术，实际上仍受限于分辨率（XY方向约20 nm，Z方向为其两倍）和成像深度（不高于传统光学显微镜）。此外，超分辨率光学显微镜与大多数研究用光学显微技术一样，依赖于荧光显微技术，而该技术本质上仅适用于少数已有优质抗体或良好标记构建体的目标蛋白3。综上所述，传统的扫描电子显微镜最多只能观察到富含血小板的血栓形成过程中的表面结构。

为了克服这些在表征血栓结构方面的技术局限，我们设定了三个目标。首先，可重复地在小鼠的静脉或动脉中制造出明确的穿刺伤口，并能够通过化学固定在原位（in situ）进行有效稳定。其次，采用一种以膜结构保存为重点的制备方法，以实现精确定位正在形成的血栓中单个血小板位置的目标。第三，使用一种无偏倚的可视化技术，能够在单幅图像中实现从纳米级到接近毫米级的尺度跨越。

选择拼接的大视野电子显微镜作为主要的最终可视化技术，其关键原因在于：在电子显微镜成像中，可以观察到细胞内大量清晰的结构特征，这些特征勾勒出细胞器及其内部的精细构造。诸如核糖体等微小结构亦可被识别。之所以能够呈现如此丰富的结构信息，是因为电子显微镜所使用的高电子密度重金属染色剂——铀酰、铅和锇——可与多种分子结合，从而产生对比度。在电子显微镜图像中，几乎可以观察到样本中存在的大部分结构；而免疫荧光和蛋白标记技术则仅能显示被标记的特定成分，例如某种特定蛋白质上的抗原位点。对于被标记的分子（通常为蛋白质），仅能显示该蛋白质所在的位置，其余所有未标记的分子均呈暗态，无法被观察到。然而，这种选择电子显微镜的方法是否具有可行性？一个穿刺损伤血栓的尺寸约为300 × 500 µm，在像素大小为3 nm的条件下，其图像尺寸将达到100,000 × 167,000像素。而一台高质量的电子显微镜相机的成像能力通常为4000 × 4000像素。这意味着需要将约1000个图像帧进行拼接或融合，才能获得一幅完整的图像。这一技术能力在过去15年生产的大多数电子显微镜中均已具备：显微镜载物台由计算机控制，图像可通过计算机软件进行自动拼接。这正是本实验方案设计背后的核心依据。

综上所述，我们在此展示一系列操作步骤，可在小鼠的静脉或动脉中制造出可重复的损伤，继而 原位 固定步骤和后续包埋步骤，可通过拼接的大范围透射电子显微镜在纳米尺度上进行观察，而在拼接图像中可于近毫米尺度上可视化，该尺度与实际样本尺寸相当 原位 固定血栓。此类可扩展性对于理解血栓形成至关重要，无论将其视为血液学/健康领域的问题，还是以血小板为主要细胞类型的发育生物学系统。这些进展实现了电子显微镜的一大优势，即能够观察到样本中实际存在的结构，而不仅仅是那些能够被标记或发光的成分。关于连续块面扫描电镜（SBF-SEM）样品制备的详细实验方案，读者可参考Joshi等人的近期文章。4.

方案

实验经阿肯色大学医学科学分校的机构动物护理与使用委员会（IACUC）审查并批准。本研究使用8至12周龄的野生型雄性和雌性C57BL/6小鼠。这些小鼠为年轻成年个体，脂肪积累较少。相同的操作流程也适用于与止血相关的重要蛋白（如血管性血友病因子或血小板糖蛋白VI（GPVI））基因突变的小鼠5,6。所有使用的设备、手术器械、试剂及其他材料均在图1中展示，并列于材料表中。

1. 颈静脉/股动脉穿刺伤口1,7

  1. 小鼠麻醉
    1. 将小鼠放入诱导室，并将异氟烷蒸发器调至高流量设置（500 mL/min，3% 异氟烷）。选择异氟烷是因为其对血管直径影响较小。
      注意：长期暴露于异氟烷可能导致不良健康效应。使用低流量蒸发器、麻醉气体吸附罐以及良好的房间通风可显著减少暴露风险。
    2. 当小鼠呈现睡眠状态时，轻捏其一只脚趾以观察是否有反应。若有反应，则将小鼠放回诱导室数分钟，再重复进行捏趾测试。若无反应，则将其仰卧置于加热板上（预先覆盖铝箔）。
    3. 将蒸发器调至低流量（100 mL/min，1.75% 异氟烷）。将小鼠鼻部置于鼻罩中。伸展四肢，并用小块胶带固定。
    4. 插入直肠温度探针，并在温度控制器上设定为 37 °C。用胶带固定探针导线，防止探针意外脱出。
  2. 小鼠切口
    1. 使用电动剪毛器剃除小鼠颈部和胸部（用于颈静脉）或右后腿内侧（用于股动脉）的毛发。用酒精棉片擦去剪下的毛发。如有需要，可再次使用剪毛器清理残留毛发。
    2. 用新的酒精棉片再次擦拭该区域，彻底清除所有毛发碎屑。确保手术区域尽可能清洁至关重要。通过脚趾捏压测试确认麻醉深度。
    3. 使用剪刀和钝头镊子提起并剪开覆盖右侧颈静脉的皮肤。在皮肤上剪出一个足够大的圆形窗口，以暴露颈静脉及其周围部分组织。
  3. 颈静脉清洁（相同原则适用于股动脉）
    1. 采用钝性分离技术，轻柔地推开脂肪组织、淋巴结及结缔组织。
      注意：此步骤中已对血管周围进行初步清洁；然而，彻底细致的清洁将在颈静脉经 4% 多聚甲醛固定 24 小时后在显微镜下进行。
    2. 用 37 °C 预热的生理盐水填充一支 20 mL 注射器。将注射器装入注射泵，并将 27G 蝶形针及其连接管路连接至注射器。
    3. 将注射泵设置为 0.5 mL/min 的流速。生理盐水的轻柔液流将冲走穿刺静脉/动脉中的血液。将液流对准穿刺点侧方数毫米处，避免直接对准穿刺点。
  4. 穿刺颈静脉/股动脉
    1. 启动计时器。准备用于颈静脉的 30G 皮下注射针（标称直径 300 µm）和用于股动脉的 33G 皮下注射针（直径 200 µm）。在高压的动脉情况下，使用更细的针仅会使出血时间略微延长。
    2. 使针尖斜面朝上，以 25° 角度置于颈静脉/股动脉上方。记录时间。
    3. 迅速穿刺血管，确保仅穿透血管顶部。注意避免同时穿透血管底部。记录出血完全停止的时间。
    4. 在开始灌注固定前，等待适当时间以获得血栓形成的不同阶段（图 2A）（例如，1、5、10 或 20 分钟，以获取血栓发育的不同阶段）。通过放血法处死动物，或遵循所在机构的安乐死指南进行操作。
  5. 实施心脏灌注固定
    1. 在手术开始前设置好蠕动泵。将两个 50 mL 离心管置于试管架中。其中一个管加入 4% 多聚甲醛固定液（溶于二甲胂酸钠缓冲液中，含 0.2 M 二甲胂酸钠、0.15 M 氯化钠，pH 7.4），用于颈静脉穿刺研究；另一管加入二甲胂酸钠缓冲液。
      注意：此处详述的条件适用于低压的颈静脉情况，而对于高压的动脉情况（如股动脉研究），需进行调整。在动脉的高压系统研究中，多聚甲醛固定液需添加 0.1% 戊二醛，并结合外部滴注固定与灌注固定。
    2. 将泵管的进液端插入含缓冲液的离心管中。将 27G 蝶形针及其连接管路连接至泵管出液端，并将针头置于洁净烧杯中。
    3. 将蠕动泵设置为 10 mL/min 的流速，启动灌注泵。
    4. 当缓冲液开始从针头流入烧杯时，关闭泵。此时管路和针头已完成预充，可用于心脏灌注。
    5. 使用解剖剪和钝头镊子，沿胸骨上缘至其下缘以下数毫米处做正中切口，暴露胸腔。沿肋弓基底部做横向切口，从正中线开始，向两侧由内向外剪开。
    6. 在开始心脏灌注前，迅速剪开肋骨并将其向两侧翻开，暴露心脏。
    7. 启动蠕动泵，将 27G 蝶形针尖插入左心室基部。
    8. 在固定针头于左心室的同时，使用锋利的解剖剪在右心耳处剪一小口，以允许血液和灌注液流出。记录计时器上的时间。
    9. 以缓冲液灌注 3 分钟，以冲洗循环系统中的血液。在保持针头固定于左心室的同时，关闭蠕动泵，并将泵管进液端移至含有固定液的 50 mL 离心管中。
    10. 记录计时器上的时间。重新启动蠕动泵，以固定液灌注 7 分钟，随后关闭蠕动泵。
    11. 将针头从左心室拔出，放入废液烧杯中。将泵管进液端插入盛有蒸馏水的烧杯中。
    12. 启动蠕动泵，使约 20 mL 水流经管路，从 27G 针头流入废液烧杯，以清洗管路。确保所有水完全排出管路和针头后，再关闭泵。

2. 用于电子显微镜的样品采集

  1. 对于股动脉穿刺伤口，在灌注固定后辅以初始2分钟的外部固定剂处理，仔细分离包含穿刺部位和血栓的颈静脉/股动脉节段（图2A）。使用锋利的剪刀，在血管节段远端做斜切，在近端做直切。
    注意：以这种方式切割有助于后续确定血管方向，并识别血管内血流方向。
  2. 将血管节段浸入新鲜的、室温下的4%多聚甲醛（溶于二甲胂酸钠缓冲液中，0.2 M 二甲胂酸钠，0.15 M 氯化钠，pH 7.4），于室温下放置1小时。
  3. 将固定后的组织转移至4 °C环境中保存24小时。次日，取一个35 mm的培养皿，内含一块约5 mm厚的硅胶垫（按制造商说明预先制备），倒入足量的二甲胂酸钠缓冲液，使固定后的静脉节段完全浸没。
  4. 在体视显微镜下（约15倍放大），小心将组织转移至含有缓冲液的35 mm培养皿中，并使用不锈钢微细针和精细镊子将血管两端固定在硅胶垫上。
  5. 使用显微剪刀和极细镊子仔细清洁颈静脉/股动脉节段。
    1. 仅针对颈静脉：移除其中一个固定针，使用显微剪刀沿穿刺/血栓部位对侧纵向剪开血管壁。轻柔地打开血管，使用4至5个被金属剪线钳剪断的半截针，将血管以腔面朝上的方式固定在硅胶垫上。
  6. 吸除缓冲液，迅速更换为含1%多聚甲醛的二甲胂酸钠缓冲液，并盖上培养皿盖。切勿让组织在任何时刻干燥，始终使其保持浸没于液体中。
  7. 将组织在4 °C下保存，直至进行电镜处理（图2B）。部分颈静脉/股动脉穿刺伤口样本用于SBF-SEM成像4，其余样本用于WA-TEM成像8,9。WA-TEM步骤将在下文详细描述。
    警告：所有涉及甲醛、环氧丙烷、OsO4和2,4,6-三(二甲氨基甲基)苯酚（DMP-30）的操作均须在化学通风橱中进行。这些为危险化学品。接触OsO4可能导致失明甚至死亡。
    注意：所有洗涤和染色步骤所用液体体积至少为样本体积的2倍。0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液可用1x磷酸盐缓冲液（PBS）替代。在固定过程中，必须始终避免样本干燥，否则将显著影响超微结构。请使用聚丙烯管。

3. 拼接宽视野透射电子显微镜（WA-TEM）样品的制备

注意：此步骤为一个决策点，此时研究者需确定将进行水银孔隙度-透射电子显微镜（WA-TEM）的制样。本制样流程不适用于聚焦离子束扫描电镜（SBF-SEM）。对于用于体积电子显微镜成像的 SBF-SEM，所有染色步骤必须在样品包埋于树脂之前完成。有关 SBF-SEM 制样方案，请参见4。

  1. 在35 mm培养皿中用Hank's平衡盐溶液（HBSS）或PBS于室温（RT）清洗组织样本2次。保持样本固定，以便在这些制备步骤中追踪样本的方向。
  2. 在冰上用0.8 mL的0.05%孔雀绿/2.5%戊二醛/0.1 M二甲胂酸钠（pH 6.7–7.0）固定20分钟。
  3. 去除固定液，用0.1 M二甲胂酸钠洗涤样本4次，每次5分钟。去除0.1 M二甲胂酸钠。
  4. 用0.8 mL的0.8% K3Fe(CN)6 或 K4Fe(CN)6/1.0% OsO4 K3Fe(CN)6 溶于0.1 M二甲胂酸钠中进行后固定。在培养皿上加盖以避光（OsO4对光敏感）。在室温下染色20分钟至1小时。
  5. 去除OsO4，用0.1 M二甲胂酸钠缓冲液洗涤4次，每次5分钟。去除二甲胂酸钠缓冲液，然后在冰上用1%单宁酸染色20分钟。
  6. 去除单宁酸，用0.1 M二甲胂酸钠缓冲液洗涤1次，每次5分钟，再用分子级去离子水（DI水）洗涤2次，每次5分钟。
  7. 用0.5%醋酸铀（UA）在室温下染色1小时，或在4 °C避光过夜。
  8. 去除醋酸铀，用分子级去离子水洗涤5次，每次5分钟。在最后一次洗涤前，当样本仍浸没在DI水中时，用刀片沿固定样本的硅胶垫边缘切割。将这块小硅胶垫从培养皿中取出，放入聚丙烯管中。
    注意：样本在管中时必须保持固定在硅胶片上。此步骤中改用聚丙烯管是必要的，因为后续步骤中使用的环氧丙烷会降解35 mm培养皿的聚苯乙烯。
  9. 去除最后一次缓冲液后，用25%乙醇短暂冲洗1次。弃去25%乙醇，在冰上用25%乙醇孵育3分钟。
  10. 去除25%乙醇。用50%乙醇短暂冲洗1次。弃去50%乙醇，在冰上用50%乙醇孵育3分钟。
  11. 去除50%乙醇，用75%乙醇短暂冲洗1次。弃去75%乙醇，在冰上用75%乙醇孵育3分钟。
  12. 去除75%乙醇，用95%乙醇短暂冲洗1次。弃去95%乙醇，在冰上用95%乙醇孵育3分钟。
  13. 去除95%乙醇，用100%乙醇（200 proof）洗涤3次，每次至少10分钟。去除100%乙醇，加入环氧丙烷（PO）。用PO冲洗3次，每次至少10分钟。
  14. 按以下方法配制树脂混合液。
    1. 将树脂组分在60 °C加热至完全液化。在50 mL离心管中于60 °C下充分混合12.5 mL Embed-218、7.5 mL Araldite 502和27.5 mL DDSA。该混合液可在4 °C保存6个月。使用前加热至60 °C。使用前分装所需量。
  15. 按以下方法包埋样本。
    1. 取一份树脂混合液置于离心管中，加入20 µL/mL的DMP-30活化剂。在60 °C下旋转充分混合，溶液颜色应变深。
    2. 用PO将该份活化树脂稀释50%，并让树脂与PO充分混合。
    3. 从含样本的离心管中去除最后一次PO冲洗液，替换为50%树脂/PO混合液，几乎完全充满离心管。在室温下旋转过夜。
    4. 次日，将新的一份树脂（每样本1 mL）与20 µL/mL的DMP-30混合。
  16. 在解剖显微镜（约6倍放大）下，将样本置于含少量来自样本管的50%树脂/PO混合液的聚丙烯培养皿中，小心地将组织上的固定针取出。仅将组织转移至另一含有少量含DMP-30活化剂的100%树脂的聚丙烯培养皿中。
  17. 用含DMP-30活化剂的100%树脂填充硅胶包埋模具，并小心将样本放入模具中。将模具放入烘箱，在60 °C下烘烤至少48小时。制备好的样本如图2B所示。
  18. 按照文献10,11所述进行拼接式广域透射电子显微镜（WA-TEM）成像。参见图3，展示从初始穿刺到三维重建的1分钟血栓的全过程。此处未包含拼接式WA-TEM电子显微成像的详细方案，因其超出本样本制备方案的范围。
    注意：WA-TEM是大多数配备计算机控制载物台的现代透射电子显微镜中一种未被充分重视的功能。支持这些功能的共享软件10,11可从科罗拉多大学博尔德分校David Mastronarde博士团队获取（http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/, http://bio3d.colorado.edu/imod/）。

结果

药物对穿刺伤口出血时间影响的定量分析
穿刺伤口出血时间提供了一种可在小鼠中便捷实施的药物风险生理模型。穿刺伤口实验所得结果具有预测性。本文展示了达比加群剂量-反应出血曲线。达比加群是一种凝血酶抑制剂，作为口服直接作用抗凝药（即所谓的DOAC12）使用。通过颈静脉穿刺伤口模型，评估不同剂量达比加群因延迟血栓形成而导致潜在出血时间延长的固有风险。在颈静脉穿刺前20分钟，经静脉（i.v.）给予15、50或150 μg/kg不同剂量的达比加群。我们展示了在不同浓度达比加群下的平均出血时间（图4）。在该剂量水平下，观察到出血时间显著延长，p <0.051。这表明该药物在人类使用中存在显著风险因素。实验表明，这些剂量的药物对正在形成的血栓超微结构具有显著影响。

评估穿刺伤口血栓形成过程中血小板的活化状态
WA-TEM 方法在低倍镜下可提供伤口区域单平面的整体概览，而在高倍镜下则能呈现大量细节（图5）。所获得的细节信息可直接置于整体图像的上下文中进行分析。我们已利用该方法评估盘状血小板向正在形成的穿刺伤口血栓的募集过程。循环中的血小板呈盘状，因此得名，并含有完整的分泌颗粒。一个关键问题是：循环中的血小板如何被募集至不断生长的血栓中，同时又不干扰其余血小板的自由流动特性？我们的研究支持“拴系并激活”假说，即循环中的血小板以单个方式通过拴系过程被募集至血栓，这些血小板仍保持盘状形态并含有完整的细胞器2。该假说的证据来源于穿刺后1分钟时颈静脉血栓的WA-TEM观察。通过对仍在出血的伤口中部进行切片以获得完整的血栓横截面切片后，我们使用配备SerialEM软件10的透射电子显微镜和自动载物台，在横截面上以矩形XY光栅扫描方式采集了500–800帧图像，每帧图像为4,000 × 4,000像素，像素尺寸为3.185 nm。随后使用eTomo软件（IMOD软件套件的一部分）11将各帧图像拼接成一幅完整图像。最终生成一幅尺寸可变的单一图像，例如120,000像素 × 90,000像素，可在3DMOD软件中以低缩放倍数（0.02）全屏显示整体结构，或以高缩放倍数（0.25至1.0）观察细节，该软件同样属于IMOD软件套件（图5）。综合软件驱动的分析结果显示，在穿刺孔边缘与血栓结合的盘状血小板呈“串珠”样排列。在血栓内部稍深处，盘状形态变得不那么明显，血小板之间的连接更为紧密。在血栓更深层区域，血小板呈圆形，紧密堆积，并出现部分脱颗粒现象。形态学的连续变化提示，血小板最初通过一种长链分子（可能是血管性血友病因子）拴系于血栓表面，而后续的血小板活化过程则被限制在血栓内部进行。因此，血小板向血栓的募集可在不影响颈静脉内血液正常循环的情况下发生。

用于样本制备的显微镜装置，包括体视显微镜、解剖工具包、载玻片。
图 1：进行颈静脉/股动脉穿刺伤口血栓实验的手术装置示意图。 手术器械（A）和手术工具（B）经过精心布置，以确保操作动作高效，因为在实验过程中时间至关重要。（C）灌注固定后，在体视显微镜下观察，将含有穿刺伤口血栓的血管段固定在35 mm培养皿中的硅胶垫上。请点击此处查看该图的放大版本。

霉菌解剖结构示意图，包含B和C区域的显微图像；真菌生长的详细聚焦图。
图2：从血管到包埋在塑料中的样本，这些样本将被切片用于WA-TEM或SBF-SEM分析。（A）显示股动脉存在穿刺伤口及血管外血栓积聚（圆圈和箭头所示）。（B）血栓（圆圈和箭头所示）被包埋在塑料中，用于通过超薄切片机切片进行WA-TEM的二维成像。（C）血栓（圆圈和箭头所示）被包埋在塑料中，并修整成短棒状，长度小于1 mm，以便固定在SBF-SEM成像室内的针状样品台上。请点击此处查看该图的放大版本。

血管内血流与内皮组织因子；血管壁结构的示意图和3D模型。
图3：穿刺损伤至血栓形成过程：从穿刺损伤处血流准备状态（A）到穿刺后1分钟颈静脉血栓的图像切片（B）的示意图。图像切片中血管壁以蓝色标注，靠近血管壁的小黑点为红细胞，血栓中的血小板聚集体呈深灰色区域。本图已根据文献1修改。请点击此处查看该图的放大版本。

出血时间与达比加群剂量关系图；显示出血时间随剂量增加而延长
图4：颈静脉穿刺伤口实验中以图形形式生成的数据示例。 达比加群剂量-反应出血曲线如图所示。该图已根据原图修改1不同浓度达比加群下的平均出血时间，误差线表示标准差的上下范围. 采用学生t检验进行统计分析表明 p值 <0.05. 请点击此处查看此图的放大版本。

血管壁内血栓的显微分析；2.5% 和 50% 放大倍数的透射电镜图像，突出显示血小板。
图 5：拼接切片形成的透射电镜（WA-TEM）图像拼接图。 （A）采集多个高分辨率图像帧，然后将其拼接在一起，以便在更大范围内定位结构特征。（B）通过放大，可在整体背景下凸显重要细节（poly：多形核白细胞，endo：内皮细胞，col：胶原纤维）。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

我们介绍一种详细的穿刺损伤方法，用于在颈静脉和股动脉中形成止血性血栓，及其 原位 灌注固定及用于拼接宽视野透射电子显微镜的样品处理。整体操作流程适用于生成用于超微结构分析的止血性血栓，并可用于比较实验小鼠的出血时间，例如接受不同类型和剂量药物处理的小鼠。该方法也适用于比较对照野生型小鼠与基因敲除小鼠（如血小板中与黏附配体相互作用的各种糖蛋白的基因敲除小鼠）的出血时间，并进一步进行高分辨率电子显微镜分析。该方案可轻松调整为以免疫荧光分析作为主要检测手段，但会失去电子显微镜在结构细节上的优势。另一方面，免疫荧光是定位结构内蛋白质分布的重要工具。与任何技术方案相同，本流程中某些步骤尤为关键，同时存在若干可作为选择节点的关键步骤，这些节点对后续分析具有重要意义。

关键步骤、后续分析的选择要点以及局限性描述如下。实际穿刺步骤：使用注射器针头以25°角对静脉或动脉进行穿刺。这种方法可最大程度降低同时刺穿静脉或动脉两侧壁的风险。而90°角穿刺则可最大程度避免刮伤血管内皮层或损伤血管外侧的血管外胶原基质，但同时会增加刺穿血管两侧壁的风险。具体角度选择取决于操作者的经验、手法和信心。

此处的主要固定使用灌注的多聚甲醛，这是一种含有单个反应性醛基的小分子。由于多聚甲醛仅含有一个化学反应性基团，因此其交联细胞成分的倾向较小，对抗原性的破坏也较弱，总体而言，与常用于电子显微镜的固定剂戊二醛相比，被认为是一种相对较弱的固定剂。戊二醛含有两个反应性醛基，因而能产生更多的分子间交联。13。这是一个 原位 旨在保护结构的步骤。灌注步骤可清除制备物中非血栓捕获的红细胞，从而获得基本不含大多数红细胞的样本，便于聚焦于血小板特性的观察。我们已探索使用 原位 使用血管外施加的戊二醛/多聚甲醛混合液进行固定。该方法效果显著，尤其适用于高流量/高压力情况。然而，该方法会将循环中的红细胞固定在原位，这可能使后续对电子显微照片中血小板聚集体形态及组成的分割分析变得复杂。由于戊二醛会产生较强的自发荧光，因此会显著干扰后续的免疫荧光实验。

将固定的血管在硅胶垫上固定并展开，对于定位血栓以进行包埋至关重要。在此步骤中，需记录并明确样本相对于血流方向的方位，以便后续步骤使用。在开放的血管中，穿刺孔和形成的血栓可以很容易地被定位。相比之下，在切除的完整血管中，血栓则难以找到，尤其是在含有大量固定循环红细胞的样本中，这一问题尤为突出。因此，能够准确追踪到“针尖般大小”的血栓所在位置至关重要。

将血管展开并拍摄血栓形成位置以及穿刺孔所在位置后，即进入一个选择节点。在整体实验流程中，后续所展示的步骤专门针对WA-TEM样品的制备。在此步骤，也可选择其他实验方案。一方面，样品可转而用于免疫荧光显微镜检测，而非电子显微镜检测；另一方面，样品也可用于连续块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）或其他三维电子显微镜技术，而非WA-TEM。SBF-SEM的样品处理步骤明显不同，因为该方法要求所有用于电子显微镜的重金属染色步骤均需在包埋前完成4。

本方案中的重金属染色步骤旨在区分膜结构与富含核酸的核糖体和染色体等生物复合物。也可采用其他重金属染色方案，例如 Storrie 和 Attardi14 以及 Liu 等人15 所述方法。

注意静脉与动脉之间的差异非常重要。与静脉相比，动脉具有更高的压力，必须对此进行补偿16,17。例如，在制作股动脉损伤时使用直径较小的针头，而颈静脉损伤则使用较大直径的针头。这种调整可抵消动脉较高的压力，从而使两者的止血时间接近相等。在颈静脉穿刺损伤操作中，优先选择在高渗条件下使用多聚甲醛作为固定剂，因为多聚甲醛是一种含有单个醛基的小分子固定剂，作用迅速，但固定能力较弱，有助于保持抗原性完整。这意味着本文所述方案可进一步结合抗体介导的定位研究，用于光学显微镜或电子显微镜水平的检测18,19。对于股动脉穿刺损伤，则需在0.1 M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4）中联合使用交联能力更强的戊二醛和多聚甲醛，以稳定并固定动脉血栓。这一修改是为了应对动脉相较于静脉更高的血压。在动脉固定中，所用二甲胂酸钠的浓度仅为颈静脉血栓固定液中浓度的一半。

本文所述的电子显微镜样品处理流程专为全血栓透射电子显微镜（WA-TEM）设计，可提供有限体积的电子显微成像信息。WA-TEM可在整个血栓横切面上（平行或垂直于血流方向）生成一系列高分辨率图像，像素尺寸为3.185 nm或更小1。通过结合使用玻璃刀和钻石刀，手动制备深入血栓约10%、25%、50%、75%和90%位置的一系列横切面。获取完整的血栓横切面图像需要使用4,000 × 4,000像素的电子显微镜级相机拍摄数百帧图像，随后将这些图像拼接在一起。通常需要近400至800帧图像才能获得一幅完整的横切面图像。WA-TEM可与扫描电镜块面成像-扫描电镜技术（SBF-SEM）互补使用。SBF-SEM在扫描电镜成像室真空环境中，利用内置的钻石刀对样品进行逐步微切，同时连续获取块面的一系列图像1。这些图像可被整合以重建形成中血栓的完整三维结构。由于微切片机位于扫描电镜成像室内，SBF-SEM的所有染色步骤必须在包埋前完成。结合这两种电子显微技术，可在有限数量的横切面上以约3 nm或更高分辨率成像（WA-TEM），或对近毫米尺度穿刺伤口血栓的整个深度进行成像（SBF-SEM）。将拼接后的WA-TEM图像在3DMOD软件中查看10，可快速在不同放大倍数之间切换，从而将高分辨率图像置于整个血栓横截面宽度的上下文中进行观察。

总之，我们提供了一种经过验证的小鼠穿刺损伤血栓制备方案，并对其进行了固定 原位，并以一种便于在静脉或动脉中定位血栓及其相对于血流方向的方式进行电镜样品制备。文中提供了多个决策节点，供使用者根据具体研究需求选择样品分析方法。我们重点介绍突出细胞膜结构与其他细胞组分对比的电镜制备技术。本方案中对其他研究最具普遍意义的部分在于作者认识到大视野透射电镜（WA-TEM）是一种图像拼接技术，可支持在近毫米尺度的大结构（如正在形成的血栓）中获取细胞（例如血小板）的纳米级信息。最终实现将精细结构置于整体背景中进行分析的能力，正是将各个步骤整合为完整流程的核心优势。

披露

作者与本研究无利益冲突。

致谢

作者感谢阿肯色大学医学科学学院（Jerry Ware 和 Sung W. Rhee）、宾夕法尼亚大学（Tim Stalker 和 Lawrence Brass）、肯塔基大学（Sidney W. Whiteheart 和 Smita Joshi）以及美国国立卫生研究院生物成像与生物工程研究所（Richard D. Leapman 和 Maria A. Aronova）的同事们，从他们那里我们学到了许多知识。作者对美国心脏协会以及美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所提供的经费支持表示感谢（项目编号：R01 HL119393、R56 HL119393、R01 155519 至 BS，以及 NIH 资助项目 R01 HL146373 和 R35 HL150818 的子课题资助）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9% 生理盐水溶液MedlineBHL2F7123HH
27G × 3/4 EXELint 头皮静脉套管MedlineNDA26709
30G × 1/2 EXELint 皮下注射针头MedlineNDA264372
33G × 1/2 EXELint 专用皮下注射针头MedlineNDA26393
50 mL 圆底离心管Fisher Scientific06-443-20
酒精消毒片（70% 异丙醇）MedlineMDS090670Z
铝箔Fisher Scientific01-213-100
动物加热板Physitemp InstrumentsHP-1M
Araldite GY 502Electron Microscopy Sciences10900
Axiocam 305 Color R2 显微镜相机Carl Zeiss Microscopy426560-9031-000
BD Luer-Lok 注射器，20 mLMedlineB-D303310Z
氯化钙Fisher ScientificC79-500
细胞培养皿 35 mm × 10 mmCorning Inc.430165
棉签MedlineMDS202055H
DMP-30 活化剂Electron Microscopy Sciences13600
十二烯基琥珀酸酐 / DDSAElectron Microscopy Sciences13700
敷料镊，5"，弯曲，带齿，尖端窄Integra Miltex6-100
敷料镊，5"，标准型，带齿Integra Miltex6-6
EMBED 812 树脂Electron Microscopy Sciences14900
无水乙醇，200 proofElectron Microscopy Sciences15055
Fisherbrand 四格试管架Fisher Scientific03-448-17
Fisherbrand 数字计时器Fisher Scientific14-649-17
Fisherbrand 单通道注射泵Fisher Scientific7801001
纱布海绵 2" × 2"，4 层MedlineNON26224H
戊二醛（10% 溶液）Electron Microscopy Sciences16120
异氟烷液体吸入麻醉剂，100 mLMedline66794-017-10
珠宝匠式精细镊子，5F 型Integra Miltex17-305需要 2 对。
L/S 泵用硅胶管，L/S 15，25 英尺VWRMFLX96410-15
L-天冬氨酸Fisher ScientificBP374-100
硝酸铅Fisher ScientificL-62
孔雀绿 4Electron Microscopy Sciences18100
Masterflex L/S Easy-Load II 泵头VWRMFLX77200-62
Masterflex L/S 可调速数字驱动器VWRMFLX07528-10
MSC Xcelite 5" 剪线钳Fisher Scientific50-191-9855
四氧化锇 4% 水溶液Electron Microscopy Sciences19150
多聚甲醛（16% 溶液）Electron Microscopy Sciences15710
Physitemp 温度控制器Physitemp InstrumentsTCAT-2LV
亚铁氰化钾Sigma-AldrichP-8131
环氧丙烷，ACS 级试剂Electron Microscopy Sciences20401
Pyrex 玻璃烧杯Fisher Scientific02-555-25B
小鼠直肠温度探头Physitemp InstrumentsRET-3
Scotch Magic 透明胶带，3/4" × 1000"3M Company305289
0.2 M 二甲胂酸钠缓冲液，pH 7.4Electron Microscopy Sciences11623
SomnoFlo 低流量电子蒸发器Kent ScientificSF-01
SomnoFlo 小鼠起始套装Kent ScientificSF-MSEKIT
不锈钢显微钉Fine Science Tools26002-10
体视显微镜 steREO Discovery.V12Carl Zeiss Microscopy495015-9880-010
Sylgard 184 硅橡胶World Precision InstrumentsSYLG184硅胶垫
单宁酸Electron Microscopy Sciences21700
硫代碳酰肼（TCH）Sigma-Aldrich88535
醋酸铀酰Electron Microscopy Sciences22400
Vannas 弹簧显微剪Fine Science Tools15000-08
Von Graefe 眼科敷料镊，2.75"，弯曲，带齿Integra Miltex18-818需要 2 对。
Wagner 剪刀Fine Science Tools14068-12
Wahl MiniFigura 动物修剪器Braintree ScientificCLP-9868
Zen Lite 软件Carl Zeiss Microscopy410135-1001-000

参考文献

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