抗疲劳汤对中枢性疲劳大鼠模型行为学及血清学指标的影响

摘要

本文介绍了一种通过改良多平台法（MMPM）建立大鼠中枢疲劳模型，并结合行为学反应和血清学指标的监测，评估抗疲劳汤剂（AFD）对中枢疲劳作用的实验方案。

摘要

本研究旨在通过观察经药物干预后采用改良多平台法（MMPM）建立中枢疲劳模型的大鼠行为学表现及血清学指标，评估抗疲劳汤剂（AFD）对抗中枢疲劳的作用。采用抓力测定评估大鼠的肌肉力量，利用旷场实验评价类似焦虑的行为，通过 Morris 水迷宫实验评估大鼠的记忆功能。在完成行为学评估后，采集大鼠血清样本，检测皮质酮（CORT）和乳酸（LAC）的浓度。LAC 浓度采用比色法测定，CORT 浓度则采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）进行检测。与空白对照组相比，经 MMPM 建模后，大鼠抓力显著下降，记忆能力受损。血清学分析显示，模型组大鼠 LAC 和 CORT 水平升高。AFD 能在一定程度上明显逆转这些不良变化。研究结果表明，AFD 及辅酶 Q10 对中枢疲劳大鼠的体力和认知能力以及血清生物标志物水平具有积极改善作用。

引言

疲劳是一种多因素且非特异性的现象，通常表现为疲倦感以及功能下降¹。疲劳可分为外周性疲劳和中枢性疲劳，前者发生在肌肉层面，后者起源于中枢神经系统^3,4。长期的中枢性疲劳可能显著导致多种心理问题，包括焦虑、抑郁、心理困扰和记忆障碍^5,6。尽管中枢性疲劳会造成显著的不适，但目前针对该症状的特异性药物仍十分缺乏⁷。虽然中枢神经系统兴奋剂哌甲酯可提供暂时性缓解，但其副作用（如失眠和心悸）可能加重病情^8,9。

在既往的临床应用中，中医药在治疗中枢性疲劳方面已显示出良好的疗效，采用的方法包括口服汤剂、针灸和太极拳^10,11,12。抗疲劳方剂（Anti-fatigue decoction, AFD）是由李锋教授基于丰富的临床经验研制的有效方剂，已显示出积极的治疗作用。该方剂由黄芪（Astragalus membranaceus）、枳壳（Fructus aurantii）、山楂（Fructus crataegi）、五味子（Schisandra chinensis）、当归（Angelica sinensis）和铁皮石斛（Dendrobium officinale）组成，配比为15:15:10:5:7:8。AFD汤剂经去离子水煎煮三次，每次加水量为药材量的十倍，每次1小时，最终浓缩至110 mL。在前期研究中，我们采用改良多平台法（Modified Multiple Platform Method, MMPM）建立了中枢性疲劳动物模型，并通过行为学及中枢神经系统神经递质检测证实了中枢性疲劳的表现¹³。本研究在中枢性疲劳动物模型中应用AFD干预，通过行为学评估来考察其药理作用。

方案

本研究工作遵循动物福利的伦理准则。通过维持适当的护理和饲养条件，确保动物的健康与福祉，所有实验程序均经北京中医药大学机构动物护理与使用委员会批准（BUCM-4-2019041504-2094）。

1. 动物饲养与分组

注意：在整个研究过程中，均遵循“3R”原则（减量、优化和替代）来保障动物福利。

1. 本研究选用54只6周龄、体重为210 g ± 10 g的清洁级（SPF级）Wistar大鼠。
2. 将大鼠饲养于动物实验设施中，环境条件控制为：温度23 ± 2 °C，相对湿度50%，光照/黑暗周期为12 h/12 h。实验前让动物适应环境3天。
3. 采用随机数字表法将大鼠随机分为6组，分别为空白对照组（图中标记为"a"）、模型组（图中标记为"b"）、AFD低剂量组（AFD-L；图中标记为"c"）、AFD中剂量组（AFD-M；图中标记为"d"）、AFD高剂量组（AFD-H；图中标记为"e"）和辅酶Q10组（CoQ10；图中标记为"f"），每组9只大鼠。

2. 建模与干预

注意：该模型的建立基于先前的文献¹³。

1. 使用自制的造模箱（由北京中医药大学神经免疫实验室提供）。
   注意：建模箱的长度为110 cm，宽度为60 cm，高度为40 cm。底部固定有15个圆形平台（直径6.5 cm，高度8 cm），平台间水平间距为13 cm，垂直间距为10 cm。开放旷场箱的长度、宽度和高度分别为100 cm、100 cm和35 cm。底部为黑色，侧壁为深蓝色。开放旷场箱底部被划分为25个边长为25 cm的正方形区域，其中中央9个方格定义为中央区，外周16个方格定义为周边区。
2. 确保水池中的水位高于平台约1厘米，并将水温维持在23 ± 2 °C。
3. 实验开始后，将大鼠放入表面覆盖有金属网的盒子中，并用重物压住以防止动物逃逸。在金属网下方悬挂充足的食物，并提供清洁的饮用水。
4. 每天18:00将模型组大鼠放入箱中，次日8:00取出。每次造模结束后，将大鼠擦干并放回清洁的笼具中。连续造模21天。
5. 实验过程中，需清洁箱体，每日更换水，并提供充足的食物。
6. 第15天^th 造模当天开始，于每日上午10:00通过胃灌注给予药物，连续7天。
   1. AFD-L 组给予 3.24 g/kg/d 剂量，AFD-M 组给予 6.48 g/kg/d 剂量，AFD-H 组给予 12.96 g/kg/d 剂量。辅酶 Q10 组给予 10 mg/kg/d 剂量。
   2. 通过灌胃给予药物时，将所需剂量溶于蒸馏水中配制成混悬液。各组给药体积为10 mL/kg。空白组和模型组给予等量蒸馏水。
      注意：给予大鼠的剂量是根据体表面积（BSA）法计算，并按照人体常规治疗剂量进行换算得出的¹⁴.

3. 行为学评估

1. 大鼠握力测试
   1. 抓住大鼠的尾巴，将其轻轻放置在握力计上。
   2. 以均匀的力度向后拉动大鼠，同时确保计算机系统正确记录数据。
      注意：实验前，技术人员需经过培训，以确保施加力量的一致性。
   3. 重复该过程三次，取三次测量值的平均值作为最终的握力值。
      注意：为尽量减少人为因素造成的误差，应由同一个人完成整个实验。
2. 大鼠旷场实验
   1. 在光线较暗且安静的环境中进行行为学实验。每次实验开始前，将大鼠置于行为学实验室内适应1小时。
   2. 确保有三名实验人员参与操作，并在放置或引导大鼠时穿着黑色衣物。在整个实验过程中，实验人员的身体或手臂不得跨越实验箱的边界。
   3. 打开分析软件。
      1. 点击顶部菜单中的文件，选择新建实验以创建新项目。在实验区域设置中，选择与大鼠活动区域相对应的形状。
      2. 使用鼠标在屏幕上绘制实验区域。校准摄像头并保存实验区域设置。
   4. 由第二名身穿黑色衣物的实验人员用手抓住大鼠背部，依次将其放置在指定区域的中心位置，然后迅速撤回手。
   5. 开始新的录像记录，设置录像时长为5分钟。
   6. 5分钟观察期结束后，迅速将大鼠从旷场箱中移出，并清理其排泄物。使用75%酒精清洁旷场箱。
   7. 对所有大鼠重复上述操作。
   8. 观察并记录：（1）总移动距离；（2）中心区域穿越次数：即大鼠四肢进入中心网格方格的次数；（3）在中心区域停留的时间，即大鼠在9个中心网格方格内停留的总时间。
3. 大鼠莫里斯水迷宫实验
   1. 在光线较暗且安静的环境中进行行为学实验。每次实验开始前，将大鼠置于行为学实验室内适应1小时。
      注意：大鼠经过4天训练；第5^天开始正式实验。
   2. 确保水池中的水位高于平台约1 cm，水温维持在23 ± 2 °C。
   3. 确保有三名实验人员参与操作，并在放置或引导大鼠时穿着黑色衣物。
   4. 将水池分为四个象限，在第二象限中央固定一个平台。在每个象限的池壁中心贴上不同颜色和形状的纸片。
   5. 打开分析软件。
      1. 点击顶部菜单中的文件，选择新建实验以创建新项目。在实验区域设置中，选择与大鼠活动区域相对应的形状。
      2. 使用鼠标在屏幕上绘制实验区域。校准摄像头并保存实验区域设置。
   6. 在学习阶段，由另一名实验人员依次将大鼠面朝池壁放入各个象限。每天的放置顺序不同，具体如下：
      1. 第一天，按以下顺序放置大鼠：第一象限、第二象限、第三象限、第四象限。
      2. 第二天，按以下顺序放置大鼠：第二象限、第一象限、第四象限、第三象限。
      3. 第三天，按以下顺序放置大鼠：第四象限、第三象限、第二象限、第一象限；
      4. 第四天，按以下顺序放置大鼠：第三象限、第一象限、第四象限、第二象限。
   7. 若大鼠在120秒内未能找到平台，则引导其到达平台，并让其在平台上停留10秒。
   8. 每日实验结束后，由第三名实验人员用毛巾擦干大鼠体表水分，并在另一房间内使用吹风机将其吹干，以避免噪音干扰。
   9. 在正式实验中，移除平台并将大鼠放入第三象限，记录其在120秒内的运动轨迹。
   10. 观察并记录：（1）大鼠在原平台所在象限的停留时间；（2）逃避潜伏期，即大鼠首次进入水池到成功到达平台所需的时间。

4. 血清生化分析

1. 样品处理
   注意：采样前一天允许禁食，但不禁水。
   1. 通过腹腔注射2%（w/v）戊巴比妥钠溶液，按0.5 mL/100 g体重剂量对大鼠进行麻醉。
   2. 完全麻醉后，使用采血管从腹主动脉采集血液。
   3. 将全血在室温（RT）放置2小时，然后在4 °C、1522.38 ×g 条件下离心20分钟以获取血清。分装后于-80 °C保存，以备后续使用。
2. 乳酸（LAC）测定
   注意：采用比色法测定LAC浓度。
   1. 按1:100的体积比将酶储备液与酶稀释液混合，配制酶工作液。
   2. 根据试剂盒说明书配制显色剂。
   3. 在空白管中加入20 µL蒸馏水。
   4. 在标准管中加入3 mmol/L标准溶液。
   5. 在测定管中加入20 µL待测样品。
   6. 向每根试管中加入1 mL酶工作液和0.2 mL显色剂。37 °C孵育10分钟后，加入2 mL终止液。
   7. 将200 µL反应液转移至96孔ELISA板中，在530 nm处测定各孔的吸光度（OD值），并根据OD值计算LAC浓度。
      ​注意：LAC浓度 = （样品孔OD值 - 空白孔OD值）/（标准孔OD值 - 空白孔OD值）× 标准溶液浓度 × 稀释倍数校正因子。
3. 皮质酮测定
   注意：使用市售ELISA试剂盒测定大鼠血清中皮质酮浓度。
   1. 实验前将辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体和洗涤液稀释成工作液。向包被板中各加入20 µL浓度分别为0 nmol/L、5 nmol/L、15 nmol/L、30 nmol/L、60 nmol/L、120 nmol/L和240 nmol/L的标准品。
   2. 向相应孔中加入20 µL血清样品，随后每孔加入200 µL酶结合物。充分振荡混匀后孵育60分钟。
   3. 弃去反应液，用洗涤液清洗3次（每次400 µL）。吸水纸上拍干后，每孔加入100 µL底物显色试剂。
   4. 在室温下孵育15分钟，然后每孔加入50 µL终止液。
   5. 在450 nm处测定各孔的OD值。利用标准孔的OD值绘制标准曲线，并据此计算样品孔的浓度。

5. 统计分析

1. 使用适当的软件应用程序进行统计分析。测量数据以均值 ± 标准差表示。
2. 如果数据符合正态分布且方差齐性，进行独立样本 t 检验。
3. 如果数据符合正态分布但方差不齐，进行近似 t 检验。
4. 如果数据不符合正态分布，采用非参数检验进行比较。
5. 对计数数据的分析采用皮尔逊卡方检验。
   注意：设定显著性水平 α = 0.05，当 P < 0.05 时，认为差异具有统计学意义。
6. 使用适当的软件应用程序生成图表。

结果

与对照组相比，模型组大鼠的抓力显著下降。然而，低、中、高剂量的AFD给药均能以剂量依赖的方式逆转这一效应，如图1所示。同样，阳性对照药物也表现出逆转抓力变化的能力（图1）。

在旷场实验中，模型组大鼠的总移动距离、中央区域穿越次数以及中央区域停留时间均减少。低、中、高剂量的AFD给药均能以剂量依赖的方式逆转这些变化，如图2所示。同时，阳性对照药物也能缓解相关症状（图2）。各组旷场实验叠加轨迹频率的热图可参见图3。

在Morris水迷宫实验中，模型组大鼠表现出逃逸潜伏期延长以及在目标象限的游泳时间减少，表明其空间搜索能力较差。阳性对照药物辅酶Q10能够逆转上述变化。值得注意的是，低、中、高剂量的AFD均能逆转逃逸潜伏期的延长，如

讨论

复方中药AFD由黄芪（Astragalus membranaceus）、枳壳（Fructus aurantii）、山楂（Fructus crataegi）、五味子（Schisandra chinensis）、当归（Angelica sinensis）和铁皮石斛（Dendrobium officinale）组成，据传统中医理论认为具有健脾疏肝解郁的功效。此外，这些药材均被认为安全性良好，因此在中国常被作为药食两用。在既往临床实践中，AFD在治疗中枢性疲劳患者方面显示出较好的疗效，但其具体治疗机制仍需进一步研究。因此，本研究旨在通过动物实验验证AFD改善中枢性疲劳的作用，并进一步阐明其潜在作用机制。

建立能够准确反映疾病发病机制和临床特征的动物模型，对于开展药理学研究至关重要¹⁵。我们团队此前通过睡眠剥夺方法建立了一种中枢性疲劳大鼠模型，该模型表现为握力下降、焦虑以及记忆功能受损¹³。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
皮质酮检测试剂盒	德国DRG公司	EIA4164	步骤4.3
Curve Expert 1.4软件	CurveExpert Professional	版本1.4	用于皮质酮检测的计算
Ethovision软件	Noldus Information Technology，荷兰	版本15	分析软件与视频追踪系统
握力测试装置	北京中实迪创有限公司	ZS-ZL	步骤3.1
乳酸检测试剂盒	南京建成生物工程研究所	A019-2-1	步骤4.2
改良多平台法	北京中医药大学神经免疫实验室	无	步骤2.1
Morris水迷宫测试装置	北京中实迪创有限公司	ZS-Morris	步骤3.3
开放场测试装置	北京中实迪创有限公司	ZS-KC	步骤3.2
Prism	GraphPad	版本8	用于生成图表
SPSS 26.0	IBM	版本26.0	统计分析
Wistar大鼠	斯贝福（北京）生物技术有限公司		许可证编号：SCXK（京）2019-0010