本方案描述了一种利用呼吸测定法测定厌氧微生物群落共消化食物残渣废弃物与废弃活性污泥时甲烷产量及微生物动力学参数的最佳实践方法。
本文内容
摘要
摘要
在过去的几十年中，呼吸测量法被越来越多地用于研究处理废水或消化废水污泥的微生物群落的生物动力学特性。利用呼吸测量法研究厌氧微生物群落在共消化有机废物流（如废水污泥和餐厨垃圾）过程中的生物动力学，是当前活跃的研究领域。迄今为止，该领域尚未发表过可视化的实验方案。因此，在本方案中，我们配置了一套呼吸测量系统，采用三种不同的食料与微生物（F:M）比例，以餐厨垃圾和废弃活性污泥为底物，随时间测量甲烷产量和产气速率。结合底物利用情况的测定数据，可为理解不同底物浓度如何影响厌氧微生物群落产甲烷速率提供依据。此外，本方案还介绍了一种获取生物动力学参数（如甲烷产率速率常数和产率系数）的方法。其他研究人员可采用本呼吸测量方案，在厌氧条件下研究有机物降解过程，并推导微生物动力学参数。
引言
研究人员在实验室规模下采用多种方法研究微生物活性，包括批式实验、微宇宙系统和呼吸测量法等。呼吸计可用于在受控条件下，通过监测底物消耗和终产物生成，测定微生物群落在生长和/或衰亡阶段的细胞呼吸作用1。实验室规模呼吸计研究的结果还可用于估算生物动力学参数，以构建过程模型2。呼吸测量法已被用于研究好氧和厌氧条件下的微生物活性；然而，利用呼吸测量法测定生物甲烷潜力（BMP），特别是针对混合有机底物的生物甲烷潜力，仍是当前持续研究的领域3,4。
生活污水中的有机物被视为一种可行的可再生化学能源5。一百多年来，厌氧消化技术已被用于在污水处理厂（WWTP）处理废水污泥（即初沉污泥和剩余活性污泥，WAS），以产生富含甲烷的沼气6。然而，近年来才开始普遍研究多种有机废物的联合消化，例如将餐厨垃圾与剩余活性污泥（WAS）共同处理，该领域目前仍是研究热点。在许多发达国家，餐厨垃圾是一种持续产生且有机质含量高的废物流，在美国约占填埋物总质量的25%7。除了可减少进入填埋场的餐厨垃圾量外，将餐厨垃圾与剩余活性污泥（WAS）进行共消化还具有提高沼气产量的优势（相较于单一有机废物处理）。沼气通常含有60%–70%的甲烷、30%–40%的二氧化碳，以及微量其他气体（如硫化氢）8。该沼气可在污水处理厂（WWTP）现场经过净化后，利用热电联产技术进行燃烧，以抵消部分电力和热能需求9。
多项研究已探讨了厌氧微生物共消化有机废物的产甲烷潜力及生物动力学参数1。现有文献中的研究多采用血清瓶进行批次实验，通过在实验过程中多个时间点测定甲烷产量来评估产气情况，而另一些研究则通过将流量计直接连接至实验室规模或中试规模的生物反应器来测量甲烷产量2,10,11。采用呼吸仪（如本方案所述）连续测量甲烷产量，可在多种实验条件下对大量样品进行连续且精确的甲烷测定1,12。尽管已有若干研究测定了剩余污泥（WAS）与其他有机底物（如有机废弃物、脂肪、油类、油脂及农业废弃物）共消化过程中的甲烷产量10,13,14，但仍需开展大量工作以明确各种共消化情景下的甲烷产率。此外，迄今为止尚无公开的实验方案提供通过可视化图示详细描述食物残渣与剩余污泥共消化过程中甲烷产量测定的分步操作流程。因此，本研究提出了一种利用呼吸仪测定甲烷产量并推导生物动力学参数的实验方案，所用底物为稀释废水、剩余污泥（WAS）和食物残渣废弃物的混合物。实验中采用了不同的食物与微生物比例（F:M），以帮助阐明甲烷产量的变化规律。其他测定指标包括各样品的挥发性悬浮固体（VSS）、化学需氧量（COD）和pH值。本方案详细描述了呼吸仪的设置、样品制备及关键测定步骤。
方案
1. 底物的制备
- 采集约 1.5 L 的初沉池出水和约 1 L 的剩余活性污泥（WAS）。
注意：WAS 样品应在实验开始前立即采集；然而，WAS 可在 4 °C 下储存最多 48 小时，对作为底物使用无明显影响15,16,17。 - 实验前立即获取 2 L 厌氧培养物，并在 35 °C 下维持培养。在从厌氧消化器转移至收集瓶的过程中，应尽可能减少与空气的接触。
注意：本研究中使用的厌氧培养物取自一个日处理量为 8.5 百万加仑（38,640 m3/d）的污水处理厂，该厂采用厌氧消化处理污水初沉污泥。最佳操作实践是在采集厌氧培养物前用氮气冲洗收集瓶以维持厌氧条件，并在运输和储存过程中持续保持厌氧环境13。 - 收集食物废弃物，并在实验前于 4 °C 下储存最多 48 小时。
注意：根据实验设计，应仔细选择含有目标比例碳水化合物、蛋白质等成分的食物废弃物。食物废弃物中有机物的目标比例可能因实验而异。所收集食物中碳水化合物、蛋白质和脂肪的比例可通过已发表文献估算，或使用既定方法（如气相色谱法）进行测定。
2. 营养补充剂的制备
- 通过将800 mL去离子水（DI）与CoCl2·6H2O（0.25 g）、FeCl3·6H2O（5 g）、MnCl2·4H2O（0.05 g）、NaMoO4·2H2O（0.005 g）、NiCl2·6H2O（0.025 g）、CuCl2·2H2O（0.007 g）、ZnCl2（0.025 g）、H3BO3（0.025 g）和Na2SeO4（0.025 g）混合，配制矿物基础溶液#1。用去离子水（DI）定容至1 L。
- 通过将800 mL去离子水（DI）与CaCl2（27.7 g）和MgCl2·4H2O（101 g）混合，配制矿物基础溶液#2。用去离子水（DI）定容至1 L。
- 通过将800 mL去离子水（DI）与NH4Cl（38.2 g）和Na2SO4 （15 g）混合，配制营养基础液。使用去离子水配制的3.64 N NaOH将pH调节至7.0，并用去离子水（DI）定容至1 L。
3. 样品制备
- 将食物废弃物（表2）放入搅拌机（图1）中混合，制成均一混合物。确保混合物中无大颗粒食物残渣。加入去离子水（DI水）稀释以助于搅拌，并记录所加稀释水的体积，用于后续化学需氧量（COD）测定的计算。此稀释后的食物废弃物称为“工作废弃物”。将工作废弃物置于1 L塑料瓶中，于4 °C保存。
- 根据表1标记四个2 L烧杯。将烧杯放置于搅拌台上，并各加入一根大搅拌子。按照表1中的配比，在2 L烧杯中分别加入食物废弃物、剩余污泥（WAS）以及稀释液（对照组使用去离子水，处理组使用初沉池出水）。
- 向每个烧杯中各加入12 mL矿物基础溶液#1、矿物基础溶液#2和营养基础溶液。
- 向每个烧杯中加入2.4 g NaHCO3（粉末），搅拌30秒。根据表1标记八个呼吸测定瓶，并向每瓶中加入一个磁力搅拌子。
注：此步骤将为对照组和三种不同F:M比的处理组各制备两个重复样品。 - 根据表1向每个2 L烧杯中加入厌氧菌种并进行搅拌。立即用刻度量筒量取500 mL混合液，转移至已标记的呼吸测定瓶中，用氮气吹扫后立即盖紧瓶盖。
注：操作过程中应尽量避免厌氧微生物与大气氧接触（如有条件，应在厌氧操作箱内完成转移）。
4. 初始条件的量化
- 使用第3部分剩余的样品（约200 mL）测定每个样品的pH值、总化学需氧量（tCOD）、溶解性化学需氧量（sCOD）、总悬浮固体（TSS）和挥发性悬浮固体（VSS）18。
- 如有必要，根据检测设备的检出限，用去离子水稀释样品。
注：化学需氧量（COD）的测定采用制造商提供的操作步骤。
- 如有必要，根据检测设备的检出限，用去离子水稀释样品。
5. 呼吸计装置设置
- 将呼吸计（图2）设置为低氧厌氧模式。
- 同时按下复位按钮和开机按钮。
注意：此操作仅适用于本研究中使用的型号。 - 将冷却器（图3）设定为 35.5 °C。
- 在每个 CO2 和水分吸收管（图4 和 图5）中心填充等量混合的 CaSO4 与 KOH 颗粒，两侧用玻璃棉包裹。
- 将样品瓶的管路和针头连接至吸收管，再从吸收管连接至气体入口（图6）。
- 在呼吸计笔记本电脑上运行呼吸计程序 RSA-8-v2.0。
注意：此操作仅适用于本研究中使用的型号。 - 在程序中选中所有瓶，然后选择 编辑 > 数据标签，为所有瓶命名。
注意：此操作仅适用于本研究中使用的型号。 - 通过点击程序中的 开始按钮 启动气体产量测量。将程序设置为每半小时末记录一次数据。通过选择 速率图 或 体积图 监测气体产量。
注意：此操作仅适用于本研究中使用的型号。 - 实验结束后（约 7 天），在程序中停止运行，关闭冷却器，并关闭 RSPF 模块。将数据文件保存为 CSV 格式，然后转换为 Microsoft Excel 文档。
注意：此操作仅适用于本研究中使用的型号。
6. 呼吸后测量
- 对最终样品进行 pH、总悬浮固体（TSS）、挥发性悬浮固体（VSS）和化学需氧量（COD）的测定，方法同第 4 节。
结果
食物废弃物组成
本研究中使用食物废弃物包含五种常见于大学餐饮设施供应的食物类型。每种食物样品含有不同量的脂肪、碳水化合物和蛋白质，具体如表2所示19。混合食物残余物中，碳水化合物占44%，蛋白质占36%，脂肪占16%，其他物质占4%。每种食物类型取近似相等的质量（56 g 至 86 g），以提供具有代表性的餐饮设施有机底物用于厌氧共消化。随后调整食物残余物的质量，以实现各实验情景下所需的食物与微生物比（F:M）（分别为0.3、0.7和1.1）。
挥发性悬浮固体和有机物测定
初始和最终挥发性悬浮固体（VSS）以及初始和最终需氧量的结果见表3。需氧量以BOD5表示，该值通过化学需氧量（COD）使用公认的换算比例（COD = 1.6BOD5）换算得到8。如表所示，初始VSS浓度（在表3中也以质量形式表示）从对照组到最高的F:M比（1.1）逐渐增加。所有考察的F:M条件下均出现了VSS的降解，即有机物在厌氧条件下转化为甲烷和二氧化碳等气态终产物。由于该转化过程，VSS浓度从实验初期的测量值下降至实验结束时的最终测量值。VSS的降解量随着F:M比的增大，从对照组开始逐步增加。出乎意料的是，F:M = 0.7 条件下的VSS降解量超过了F:M = 1.1 的条件，这可能是由于F:M为1.1时发生了抑制作用所致。
测得的初始氧需求浓度与挥发性悬浮固体（VSS）的变化趋势相同，即从对照组到最高F:M比组逐渐升高（表3）。与VSS的降解类似，除对照组外，其余样品的五日生化需氧量（BOD5）浓度均从初始值到最终值有所下降。对照组的氧需求量有所增加，可能是由于内源性衰减所致。与VSS降解不同的是，各样品从初始到最终测量期间氧需求量的降低幅度相对较小，降幅介于1%至3%之间，且未随F:M比呈现明显趋势。这一现象的可能原因是颗粒态有机物向溶解性有机物的转化，该过程通常发生在较长时间尺度下，常成为厌氧微生物群落代谢的限速步骤20。
甲烷产量
在190小时的研究期间，不同F:M比下的甲烷产量和产率存在差异。实验结果表明，较高的F:M比可产生更多的甲烷总体积（图7）。对照组未添加底物，仅产生少量甲烷（约72 mL），这可能是由于污泥中可溶性BOD5含量较低和/或内源性衰减所致。正如预期，其他试验组添加底物后，甲烷产量均高于对照组。F:M比为0.3的试验组产生的甲烷体积约为对照组的5倍（约354 mL）。将F:M比提高至0.7后，甲烷产量比F:M比为0.3的试验组高出1.6倍（约574 mL）。同样，将F:M比进一步提高至1.1后，甲烷产量比F:M比为0.7的试验组高出1.9倍（约1098 mL）。各F:M比条件下观测到的最大体积甲烷产量（Ymax）列于表4中。甲烷随时间的生成速率也随F:M比的变化而改变。如图8所示，随着F:M比的增加，甲烷的生成速率以及持续产甲烷的时间均有所延长。例如，在F:M比为0.3的试验组中，研究进行至129小时后即未再观测到甲烷生成（最大产量为354 mL），而F:M比为1.1的试验组在研究结束时仍持续产生少量甲烷。在所有试验组中，甲烷生成速率随时间推移而下降，这是由于底物可用性降低所致。尽管研究结束时系统中仍存在较高的氧需求量（表3），但该部分有机物可能不具备生物可利用性，或厌氧微生物群落可用的电子受体（如二氧化碳）已有限。最后，单位观测降解的VSS（mg）所产生的甲烷量（mL）比较显示，F:M比为0.3和0.7时的值介于1.3至1.6 mL/mg之间，而F:M比为1.1时每单位降解VSS产生的甲烷更多（3.7 mL/mg）（表4）。Tchobanoglous等（2014）提供了常见进料底物单位降解固体量对应的典型气体产率范围，包括脂肪（约1.4 mL/mg）、油脂（约1.1 mL/mg）和蛋白质（约0.7 mL/mg）8。Mata-Alvarez等（2014）综述了在实验室规模和中试规模生物反应器中，将废水污泥与多种底物共消化的研究，涉及不同底物组合及比例（例如不同比例的剩余活性污泥WAS与油脂FOG）10。他们发现，单位降解挥发性悬浮固体（VSS）所产生的甲烷量因共消化底物种类及其配比不同而差异显著，范围为每降解1 mg挥发性固体（VS）产生0.2 mL至1.1 mL沼气。本研究的代表性结果，特别是F:M比为0.3和0.7的条件，与已有对比研究结果相比具有良好的可比性。
生物动力学参数
随时间变化的甲烷产量可用于确定多个重要的生物动力学参数。这些生物动力学参数可进一步用于在类似条件下预测甲烷产量，而无需使用呼吸计。甲烷产率常数k可通过各试验F:M比下的观测呼吸计数据进行对数最小二乘拟合得出（即图8所示数据）。以F:M比为0.3的情形为例，其代表性对数函数为 y = 93.465ln(X) - 175.91。其中，93.465的单位为小时，需转换为天并取倒数，得到k = 0.257。各F:M比对应的速率常数（k）及决定系数（R2）见表4。
随后可利用该速率常数来确定每种底物与微生物比（F:M）下任意时刻的甲烷产率。有机底物随时间产生的甲烷速率可用以下方程建模[1]21：
(1) 
在 t = 0 到 t = t 的范围内对上述方程进行积分，可得到以下结果[2]：
(2) 
其中，Y = 任意时间的甲烷产率 [mL]；Ymax = 呼吸计实验中观测到的最大甲烷产率 [mL]；k = 甲烷产气速率常数 [d-1]；t = 时间 [d]
尽管上述用于推导动力学参数的一级动力学方法对实验数据具有非常合理的拟合度（如表4中的R2值所示），但其他研究也报道了使用其他模型来拟合甲烷产量数据，包括修正的Gompertz模型、双底物模型和Cone模型2。
图 1：厨余垃圾搅拌器。用于混合厨余垃圾的标准搅拌器。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：呼吸计。 用于测量甲烷产量的完整呼吸计装置。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：呼吸计冷却器中的样品瓶。 呼吸计冷却器内部视图，包含八个样品瓶。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 4：呼吸计净化器。 呼吸计净化器的特写视图。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 5：呼吸计净化装置与控制模块连接示意图。 呼吸计的控制模块及净化装置设置示意图。请点击此处查看该图的放大版本。
图 6：呼吸计洗涤管路装置示意图。 样品瓶与呼吸计之间洗涤管路装置的近距离视图。 请点击此处查看此图的放大版本。
图7：采用不同F:M比的总甲烷产量。 各F:M比（0.3、0.7、1.1）下的甲烷产量随时间（0小时至190小时）的变化情况。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 8：使用不同 F:M 比值的甲烷产率。展示了各 F:M 比值（0.3、0.7、1.1）下随时间（0 小时至 190 小时）变化的甲烷产率。请点击此处查看该图的放大版本。
表1：不同食微比的样品瓶组分。 各食微比（0.3、0.7、1.1）及空白瓶的组分质量、浓度和体积。请点击此处下载该表格。
表2：有机底物样品组成。 食物废弃物的质量及其按食物种类划分的组成百分比，以及碳水化合物、蛋白质和脂肪的比例。请点击此处下载该表格。
表3：挥发性悬浮固体和氧需求量测定结果（±标准偏差）。 不同F:M值（0.3、0.7、1.1）下的VSS和COD。 请点击此处下载该表格。
表4：动力学参数示例。 基于甲烷产量计算的动力学参数。请点击此处下载该表格。
讨论
本方案提供的方法可帮助研究人员和实践人员利用呼吸计量法测定厌氧消化有机废物流的生物甲烷潜力。在本方案中，我们展示了在一系列F:M比条件下，将典型的餐厨垃圾与污水处理厂（WWTP）的剩余污泥（WAS）进行共消化以产生甲烷的过程。本方案通过提供一种逐步进行的呼吸计量方法，用于连续测量甲烷产量，并采用一级动力学模型确定生物动力学参数，从而丰富了现有文献。已有若干研究采用微宇宙实验，在特定时间点测量甲烷产量10,22，而另一些研究则通过在长期运行的连续流实验室规模或中试规模生物反应器上安装流量计来测量甲烷产量14,23。呼吸计量法的优势在于可在多种实验条件下连续监测甲烷的生成。由于呼吸计量实验无需构建生物反应器，因此相较于某些实验室或中试规模实验，其实验条件可更频繁地进行调整。得益于这一优势，呼吸计量实验可在相对较短的时间内用于测定多种有机废物组合共消化所产生的甲烷产量。例如，作为本研究方案的下一步，可将化学能密度远高于剩余污泥的油脂类物质（Fats, oils, and grease）与餐厨垃圾进行共消化，以量化随时间推移甲烷产量可能的提升幅度。该方法的应用可进一步积累关于共消化方案中多种底物组合下的甲烷生成速率和生物动力学参数的文献资料。此外，除了确定最优底物组合外，甲烷产量结果和生物动力学参数还可用于完善现有程序中的性能建模（例如针对污水处理设计的程序），或预测共消化方案从实验室或中试规模放大至全规模时的运行表现24,25。
此外，本方案可进行调整，以向厌氧微生物群落提供定制化的底物进料。例如，若研究人员希望考察仅提供碳水化合物或仅提供蛋白质对厌氧微生物群的影响，则可相应地调整本方案中的底物。或者，若研究人员希望测试添加特定化学需氧量（COD）组分（例如仅溶解性COD或仅颗粒性COD）或高浓度特定底物（如乙酸盐、挥发性脂肪酸或厌氧代谢中间产物）对甲烷生成的影响，也可采用本方案的变体。在修改底物或调整特定底物的底物与微生物量比（F:M）时，一项被证实的最佳实践是：保持各样品中厌氧微生物群的质量一致，仅调整底物的质量（应采用质量与质量之比）。除了修改底物外，研究人员还可将本方案与其他分析方法结合使用，以更深入地理解底物利用与甲烷生成过程。例如，研究人员可将本方案与微生物群落分析（如16S rRNA基因测序或宏基因组学）相结合，以更好地关联群落结构与功能。
尽管该方法具有实用性，但仍存在若干局限性。呼吸计和生物甲烷潜力测试通常配置为批量反应器；然而，实际规模的厌氧共消化器通常以连续流系统运行，污泥停留时间通常超过10天1。因此，通过呼吸测定实验获得的数据可用于估算甲烷生成速率并建立生物动力学参数，但在可行的情况下，这些数据应在现场通过长期运行的较大规模消化器进行验证。
此外，在进行呼吸测定之前，必须谨慎选择和制备样品。较大的食物残渣颗粒会影响挥发性悬浮固体（VSS）和化学需氧量（COD）的测定结果，导致数据不准确。如果使用食物残渣作为底物，应将其充分匀浆，并去除大颗粒食物残渣——这一操作类似于全规模消化器中食物残渣接收池所采用的匀浆方法。使用去离子水（DI水）稀释有助于混合过程，这与大规模处理食物残渣时通常加水的做法相似。然而，必须尽一切努力确保稀释体积准确测量，并达到目标含水率。稀释过程极易引入误差，特别是当由经验不足的学生执行该实验方案时。
由于共消化过程中存在的微生物群落包含专性厌氧菌，在转移和样品制备过程中必须特别注意消除（或大幅减少）样品与氧气的接触。可通过氮气吹扫去除样品瓶中的氧气。此外，若有条件，应在厌氧工作站内完成厌氧培养物在收集瓶与呼吸仪样品瓶之间的转移操作。由于呼吸仪能够提供稳定一致的结果（如甲烷产量和产气速率），任何偏离预期结果的情况（例如微生物群落失活）均可在试验初期被迅速识别。采用重复样（双样或三样）可进一步帮助识别异常或无效的测试结果。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Respirometer Systems and Applications 公司的 Jim Young 博士就本实验方案的开发所进行的讨论。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 103 °C Oven Isotemp | Fisher Scientific | 13-247-737F | 型号：737F，鼓风干燥箱 |
| 550 °C Vulcan 烤箱 | Neytech（制造商）/ Cole Palmer（供应商） | 9493308 | 型号：3-550 |
| 有氧/厌氧呼吸计 | 呼吸测量系统及其应用（RSA） | PF-8000 | 型号：PF-8000 |
| 分析天平 | Mettler Toledo | 30029075 | 型号：ME204E，检测限：0.1 mg |
| 带56盎司塑料杯的搅拌机 | Hamilton Beach | 50190F | 型号：50190F |
| COD试剂管 TNT Plus试剂管测试 | HACH | TNT821 | TNT 821, 3–150 mg/L 化学需氧量 |
| COD试剂管 TNT Plus试剂管测试 | HACH | TNT822 | TNT 822, 20–1500 mg/L 化学需氧量 |
| 干燥器 | SP Bel-Art | 942070050 | 型号：SP Scienceware |
| 去离子水系统 | Milli-Q | ZIQ7010T0C | IQ 7010 Pure &和超纯水净化系统 |
| 无水 CaSO4 | W.A. Hammond Drierite 公司 | 13001 | 8目筛，1磅 |
| 玻璃纤维滤膜 | Whatman（制造商）/ Cole-Parmer（供应商） | 1827-150 | 型号：934-AH |
| 加热消化块 | HACH | DRB200-02 | DRB 200 |
| 加热磁力搅拌器 | 康宁 | 6795-620D | 型号：PC-620D |
| 工业级氮气（压缩气瓶） | 空气气体 | NI UHP300 | 300 立方英尺 |
| 沉淀物（KOH） | Fisher Scientific | AC134062500 | 500 g |
| pH计 | Fisher Scientific | 13-636-AP115 | AP115，Accumet pH计 |
| 紫外分光光度计 | HACH | LPV400.99.00012 | DR 3900 |
| 真空泵 | 胃癌 | 1HAB-25-M100X |
参考文献
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