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构建人阴道芯片中的健康与菌群失调阴道微环境模型

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DOI：

10.3791/66486

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2024年2月16日

 ,  ,  , 
1Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University, 2Vascular Biology Program and Department of Surgery, Boston Children's Hospital and Harvard Medical School, 3Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于构建微流控阴道芯片（Vagina Chip）培养装置的实验方案，该装置可在微需氧条件下研究人类宿主与活性阴道微生物组之间的相互作用。该芯片可作为研究阴道疾病以及开发和测试潜在治疗干预措施的工具。

摘要

女性健康，尤其是女性生殖道（FRT）疾病，一直未获得应有的关注，尽管生殖系统异常可能导致危及生命的疾病、不孕或妊娠不良结局。该领域的一个障碍在于，目前缺乏能够真实模拟女性生殖道生理及病理生理状态的临床前实验模型。现有 体外 动物模型无法完全重现激素变化、微需氧环境以及与阴道微生物组的相互作用。器官芯片（Organ-on-a-Chip，Organ Chip）微流控培养技术的出现为解决这一问题提供了潜在方案，该技术能够模拟人体器官主要功能单元的组织-组织界面、血管灌注、间质液流动以及物理微环境。近期已开发出一种人源阴道芯片（Vagina Chip），可实现人源阴道微生物群落与原代人阴道上皮的共培养，并与阴道间质组织形成界面，同时施加动态流体流动。该芯片能够模拟人阴道在健康与菌群失调微生物组条件下的生理响应。本文详细描述了构建人源阴道芯片的具体实验方案。

引言

以Lactobacillus spp. 为主导的阴道微生物组有助于维持酸性微环境，在维护女性生殖健康方面发挥着重要作用1。然而，有时构成微生物组的微生物群落组成会发生变化，导致阴道细菌多样性增加。这种生态失衡常表现为从以Lactobacillus为主的状态转变为由更多 样化的厌氧菌物种（例如Gardnerella vaginalis）主导的状态，与多种生殖系统疾病相关，如细菌性阴道病、萎缩性阴道炎、尿路感染、外阴阴道念珠菌病、尿道炎和绒毛膜羊膜炎2，3，4，5。这些疾病反过来会增加女性感染性传播疾病和盆腔炎性疾病的风险6，7，8，9。此外，它们还会增加孕妇早产和流产的风险10，11，12，并被认为与不孕症有关13，14，15，16。

尽管已有研究尝试利用在静态二维（2D）培养系统中培养的阴道上皮细胞来模拟阴道菌群失调17,18，但这些模型无法有效模拟阴道微环境的生理特征和复杂性19。动物模型也曾被用于研究阴道菌群失调；然而，其月经周期及宿主-微生物组相互作用与人类存在显著差异，因此这些研究结果的生理相关性仍不明确19,20,21。为克服上述问题，研究人员已采用人类阴道组织类器官和Transwell插入式模型来研究女性生殖道（FRT）中的宿主-病原体相互作用19,22,23,24。但由于这些模型属于静态培养，仅能支持人类细胞与活体微生物共培养较短时间（<16–24 小时），且缺乏人类阴道微环境中许多其他潜在的重要物理特征，例如黏液分泌和液体流动22。

器官芯片是包含一个或多个平行中空微通道的三维（3D）微流控培养系统，微通道内壁由在动态流体流动条件下培养的活细胞构成。双通道芯片可通过在分隔两个平行通道的多孔膜两侧分别培养不同类型的细胞（例如上皮细胞与间质成纤维细胞，或上皮细胞与血管内皮细胞），从而重建器官水平的组织-组织界面。图1两种组织可分别暴露于流体流动，也可处于微需氧条件下，以实现与复杂微生物组的共培养。25,26,27,28该方法最近被用于开发一种人源阴道芯片，其由对激素敏感的原代阴道上皮细胞构成，并与下方的间质成纤维细胞相互连接，可在上皮腔内维持较低的生理氧浓度，并支持与健康及菌群失调的微生物组共培养至少3天 体外29已证明，阴道芯片可用于研究有益（健康）微生物的定植 L. crispatus 联盟，并检测由非最佳（非健康）状态引起的炎症和损伤 G. vaginalis 包含共生群落。 本文详细描述了构建人类阴道芯片以及在芯片上建立健康与失调菌群的方法。

方案

本研究严格遵守机构关于人类细胞使用的规定。细胞购自商业来源（参见材料表）。所有步骤均须在生物安全柜（BSC）中无菌操作。本实验方案仅使用带滤芯（或屏障）的移液器吸头。

1. 培养人阴道上皮细胞

  1. 将50 mL阴道上皮细胞培养基（VEM，参见材料表）预热至37 °C。
  2. 取9 mL VEM加入15 mL离心管中。随后，解冻一管人阴道上皮细胞（HVECs），并将其加入含有VEM的离心管中。
  3. 在室温（RT）下，以300 × g 离心15 mL离心管5分钟，吸除上清液，保留沉淀。
  4. 用2 mL VEM轻柔重悬沉淀，将1 mL细胞悬液分别加入两个已含有14 mL VEM的T75培养瓶中。
  5. 将培养瓶置于37 °C、5% CO2 条件下培养。每2天更换一次VEM，直至HVECs融合度达到约70%（约5天）。

2. 培养人子宫成纤维细胞

  1. 在双蒸水（ddH2O）中配制10 mL浓度为15 μg/mL的聚-L-赖氨酸溶液（PLL）。向两个T75培养瓶中各加入5 mL PLL溶液，37 °C孵育1小时。
  2. 将50 mL成纤维细胞培养基（FM，见材料表）预热至37 °C。
  3. 吸除PLL溶液，每个培养瓶用5 mL ddH2O洗涤一次。
  4. 取9 mL FM分装至15 mL离心管中，并解冻一管人子宫成纤维细胞（HUFs）。
  5. 将HUFs加入含FM的15 mL离心管中。
  6. 在室温下以300 × g离心5分钟，吸除上清液，保留细胞沉淀。
  7. 用2 mL FM轻柔重悬细胞沉淀，将1 mL细胞悬液分别加入两个含有14 mL FM的T75培养瓶中。
  8. 将培养瓶置于37 °C、5% CO2培养箱中培养，每隔2天更换培养基，直至细胞融合度达到约70%。

3. 芯片活化与通道包被

  1. 将芯片（商业获取，参见材料表）在真空干燥器中脱气 30 分钟。
  2. 将活化试剂 1（AR-1）和活化试剂 2（AR-2）（参见材料表）在不拆除包装的情况下于室温平衡 15 分钟。
  3. 用铝箔包裹一支 15 mL 圆锥形离心管以避光。缓慢将 1 mL AR-2 溶液沿 AR-1 小瓶内壁加入，并充分混匀。将混合液转移至已包裹铝箔的 15 mL 管中。
  4. 以每次 1 mL 的增量反复向 AR-1 小瓶中加入 AR-2 溶液，直至 AR-1 粉末完全从瓶壁洗脱。
  5. 用 AR-2 溶液将 AR-1 重悬液定容至 10 mL。
  6. 向每个芯片的顶侧通道入口加入 200 µL 该溶液，同时从出口端抽吸（图 1A）。对基底侧通道重复此操作。加液时保持移液枪垂直于芯片，以确保密封良好且液体流动无阻。
  7. 对所有芯片重复步骤 3.6。
  8. 检查所有芯片是否存在气泡。若发现气泡，向受影响的通道中补充溶液以去除气泡。
  9. 从芯片表面抽吸去除多余的 AR-1 溶液，注意避免接触通道的入口和出口。
  10. 将芯片放入一个 150 mm 培养皿中，并将未加盖的培养皿置于紫外灯箱内。
  11. 将紫外灯箱朝向生物安全柜（BSC）后方，使芯片持续暴露于紫外光下 30 分钟。芯片内溶液颜色将由深粉色变为红褐色。
  12. 通过向入口加入 200 µL AR-2 溶液并同时从出口抽吸，清洗每个通道。
  13. 用 200 µL 冷的 DPBS (-/-) 重复上述操作两次，每次均从入口加液并同时从出口抽吸，以清洗每个通道。
  14. 配制顶侧通道包被液（含 200 µg/mL I 型胶原和 30 µg/mL IV 型胶原的 DMEM 混合液）（参见材料表），并置于冰上保存。
  15. 配制基底侧通道包被液（含 15 µg/mL PLL 和 200 µg/mL I 型胶原的 DMEM 混合液），并置于冰上保存。
  16. 向基底侧通道入口加入 200 µL 基底侧通道包被液。当包被液到达出口时，用 P200 吸头堵住出口。继续加样，直至入口和出口处的吸头内液体体积相等，然后将移液枪上的吸头卸下，使其保留在入口处。
  17. 同样地，向顶侧通道加入 200 µL 顶侧通道包被液。
  18. 从芯片表面抽吸去除多余的包被液。
  19. 检查所有芯片是否存在气泡。若发现气泡，向受影响的通道中补充包被液以去除气泡。
  20. 将芯片置于 150 mm 培养皿中，在 37 °C、5% CO2 条件下过夜孵育。

4. 用 HUFs 接种芯片基底通道

  1. 每天在显微镜下观察烧瓶中 HUF 的生长情况。
  2. 当 HUF 培养物达到 70%–90% 汇合度时（接种后约 3 天），将 25 mL FM、5 mL 无 Ca2+/Mg2+ 的 DPBS（DPBS (-/-)）、10 mL 胰蛋白酶/EDTA 和 15 mL 胰蛋白酶中和液（TNS，参见 材料表）预热至 37 °C。
  3. 吸除烧瓶中的培养基，加入 5 mL DPBS (-/-) 洗涤一次，然后再次吸除。
  4. 向每个烧瓶中加入 4 mL 胰蛋白酶-EDTA，于 37 °C 孵育 3–5 分钟，直至细胞脱落。
  5. 向每个烧瓶中加入 6 mL TNS，将细胞悬液转移至 15 mL 圆锥形离心管中。
  6. 用移液器充分混匀细胞悬液，取 10 µL 进行细胞计数。将 10 µL 细胞悬液与 10 µL 台盼蓝混合，使用血细胞计数板进行计数。
  7. 将细胞悬液在室温下以 300 x g 离心 5 分钟，吸除上清液，将沉淀重悬于预热的 FM 中，最终浓度为 7.5 x 105 个细胞/mL。
  8. 用 200 µL FM 清洗基底通道。
  9. 将 15 mL VEM 预热至 37 °C，用 200 µL VEM 清洗顶膜通道。
  10. 向顶膜通道入口加入 200 µL 完全 VEM，同时用移液器吸头堵住出口。持续加样直至入口和出口吸头内的液体体积相等，然后将移液器吸头从移液器上取下，使其保留在入口处。保持顶膜通道充满液体，并在入口和出口均用吸头封堵。
  11. 缓慢将 50 µL HUF 细胞悬液通过移液器加入基底通道入口，同时从出口端进行轻柔吸液。当移液器吸头中剩余约 2 µL 细胞悬液时，不要按压或释放移液器活塞，立即移开移液器吸头，以避免产生气泡。用移液器吸头封堵入口和出口。
  12. 在显微镜下检查是否存在气泡。若存在气泡，则用 FM 清洗基底通道，并重复步骤 4.11。
  13. 将已封堵的芯片倒置放置于 15 mL 离心管架上，于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 1 小时。孵育后观察芯片，检查细胞是否贴壁。
  14. 用移液器吸头封堵基底通道的出口。向基底通道入口加入 200 µL FM，加入过程中不要按压移液器活塞。将吸头从移液器上取下，使培养基在重力作用下自由流经通道，到达出口端的吸头。
  15. 将接种了 HUF 的芯片在 37 °C、5% CO2 条件下孵育过夜。

5. 用阴道上皮细胞接种芯片顶侧通道

  1. 将 50 mL VEM 预热至 37 °C。
  2. 制备顶端通道包被液（含 200 µg/mL I 型胶原的 DMEM），置于冰上保存。
  3. 用移液器吸头堵住顶端通道的出口。
  4. 向顶端通道入口加入 200 µL 顶端通道包被液。缓慢加入包被液，直至入口和出口吸头内的液体体积相等，然后将移液器吸头从移液器上取下，使其保留在入口处。
  5. 吸除芯片表面多余的溶液。
  6. 将芯片置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 1 小时。
  7. 1 小时后，通过向顶端通道入口加入 200 µL VEM 并同时从出口端吸出液体，清洗顶端通道包被液。
  8. 在显微镜下观察 HVEC 生长情况，待细胞融合度达到约 70%–90% 时进行下一步。
  9. 若细胞融合度为 70%–90%，则将每瓶所需的 6 mL 完全阴道上皮细胞培养基（VEM）和 4 mL 胰蛋白酶/EDTA 溶液预热至 37 °C。
  10. 吸除 HVEC 培养瓶中的培养基，加入 5 mL DPBS (-/-) 洗涤一次，随后吸除洗涤液。
  11. 每瓶加入 4 mL 胰蛋白酶溶液，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 3–5 分钟，直至细胞脱落。
  12. 向培养瓶中加入 6 mL VEM 以终止胰蛋白酶反应，并将细胞悬液转移至 15 mL 圆底离心管中。
  13. 用移液器充分混匀细胞悬液，取 10 µL 进行细胞计数。将 10 µL 细胞悬液与 10 µL 台盼蓝混合，使用血细胞计数板进行计数。
  14. 在室温下以 300 × g 离心 5 分钟，吸除上清液，将沉淀重悬于 VEM 中，调整细胞终浓度为 350–400 万个细胞/mL。
  15. 将 25 mL FM 预热至 37 °C。
  16. 用移液器吸头堵住顶端通道出口，缓慢将至少 40 µL HVEC 细胞悬液加入顶端通道入口。加入细胞悬液直至入口和出口吸头内液体体积相等，然后将移液器吸头从移液器上取下，使其保留在入口处。保持基底通道充满 FM，并用吸头封闭其入口和出口。
  17. 小心吸除芯片表面多余的培养基，并在显微镜下检查是否存在气泡。若存在气泡，则重复步骤 5.16。
  18. 将芯片置于大型培养皿中，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育过夜。
  19. 次日，在显微镜下观察芯片中细胞的贴壁情况。
  20. 移除顶端和基底通道入口及出口处的移液器吸头。
  21. 用移液器吸头堵住基底通道出口，向基底通道入口加入 200 µL FM，不要按压移液器活塞。将移液器吸头从移液器上取下，使培养基在重力作用下自由流经通道至出口吸头。
  22. 对顶端通道使用 VEM 重复步骤 5.21 。
  23. 将双接种的芯片在 37 °C、5% CO2 条件下继续孵育 24 小时。

6. 将芯片连接至微流控装置并诱导阴道上皮细胞分化

  1. 将 50 mL FM 和 VEM 分别分装至两个 50 mL 锥形管中，并在 37 °C 下预热。
  2. 将预热至 37 °C 的 FM 和 VEM 培养基在无菌条件下抽真空脱气 5 分钟。
  3. 对动态流体模块（DFM，参见材料表）的托盘进行消毒和清洁。从包装中取出芯片盒（pods），并将其放入托盘中。
  4. 向顶端入口储液池（右上储液池；图 1B）加入 2 mL 脱气后的 VEM。沿储液池壁缓慢加样，以避免气泡形成。
  5. 向基底入口储液池（左上储液池，图 1B）加入 3 mL 脱气后的 FM。沿储液池壁缓慢加样，以避免气泡形成。
  6. 向顶端出口储液池（右下储液池，图 1B）加入 500 µL 脱气后的 VEM。倾斜芯片盒，使培养基覆盖储液池底部整个表面。
  7. 向基底出口储液池（左下储液池，图 1B）加入 500 µL 脱气后的 FM。倾斜芯片盒，使培养基覆盖储液池底部整个表面。
  8. 将装有芯片盒的托盘滑入 DFM 中，并运行Prime循环两次。检查每个芯片盒底部各端口是否有液滴流出。
  9. 若经过 4 次"Prime"循环后仍未形成液滴，可直接接触芯片盒出口储液池内的端口（图 1B），用移液器加入 200 µL 相应培养基，以促使培养基在储液池与通道之间流动。此操作称为"手动引液（Hand-priming"）。
  10. 从芯片上移除移液器吸头，并在每个芯片的所有端口上滴加相应培养基液滴。
  11. 将芯片滑入芯片盒中，并将芯片盒放回托盘。
  12. 吸除芯片表面残留的培养基，然后将每个托盘滑入 DFM 中。
  13. 在 DFM 上设置以下参数：顶部和底部—液体；顶端（上通道）流速—15 µL/h；基底（下通道）流速—30 µL/h；拉伸= 0%；频率= 0 Hz。
  14. 在 DFM 上运行Regulate循环，并让液体持续流动过夜。
  15. 24 小时后，将顶端通道流速调整为 0 µL/h，基底通道继续维持 30 µL/h 的流速，再持续 24 小时。
  16. 通过向低糖 DMEM 培养基中添加 4 mM L-谷氨酰胺、20 mM 氢化可的松、1x ITES、20 nM 三碘甲腺原氨酸、100 µM O-磷酸乙醇胺、180 µM 腺嘌呤、3.2 mM 氯化钙、2% 热灭活胎牛血清（FBS）、1% 青霉素-链霉素（Pen-strep）以及 120 mL Ham's F-12 培养基，配制 500 mL 分化培养基（DM），并过滤除菌（参见材料表）。
  17. 将 50 mL DM 在 37 °C 水浴中预热。
  18. 向 50 mL DM 中加入 20 µL 10 µM 雌二醇（参见材料表），充分混匀，并在无菌条件下抽真空脱气 5 分钟。
  19. 将 50 mL VEM 在水浴中加热至 37 °C，并在无菌条件下抽真空脱气 5 分钟。
  20. 从 DFM 中取出托盘，置于生物安全柜（BSC）中，吸除芯片盒中的培养基，注意避免触碰储液池中的端口（图 1A）。然后，向顶端通道入口储液池加入 2 mL VEM，向基底通道入口储液池加入 3 mL DM。
  21. 将托盘重新放回 DFM 中，设置顶端通道流速为 15 µL/h，基底通道流速为 30 µL/h。
  22. 让 DFM 持续流动 4–7 小时。随后，将顶端通道流速设为 0 µL/h 以停止流动，基底通道继续以 30 µL/h 流动。
  23. 每隔 48 小时，按照步骤 6.16–6.19 更换培养基。
  24. 在接下来的 5 天中，每天在顶端通道间歇性地流动培养基 4–7 小时，操作参照步骤 6.20–6.21。
  25. 通过向 dd H2O 中添加 1.26 mM 氯化钙、0.49 mM 六水合氯化镁、0.406 mM 硫酸镁、5.33 mM 氯化钾、137.93 mM 氯化钠、0.441 mM 磷酸二氢钾和 5.55 mM D-葡萄糖，配制低缓冲能力含葡萄糖的 Hanks 平衡盐溶液（HBSS (LB/+G)）培养基（参见材料表）；pH 值为 4.8。
  26. 通过向低糖 DMEM 培养基中添加 4 mM L-谷氨酰胺、20 mM 氢化可的松、1x ITES、20 nM 三碘甲腺原氨酸、100 µM O-磷酸乙醇胺、180 µM 腺嘌呤、3.2 mM 氯化钙、2% 热灭活胎牛血清（FBS）以及 120 mL Ham's F-12 培养基，配制 500 mL 不含青霉素-链霉素的 DM，并过滤除菌。
  27. 第 6 天，按照步骤 6.16–6.19，将顶端通道培养基更换为 HBSS (LB/+G)，基底通道培养基更换为不含青霉素-链霉素的 DM。
  28. 在进行细菌接种前，将 DFM 的流速设置为顶端通道 15 µL/h，基底通道 30 µL/h，持续 24 小时。

7. 分化芯片的细菌接种

注意：以下步骤需在符合微生物操作规范的实验室和生物安全柜中进行。

  1. 计算接种物中每种细菌菌株的CFU/mL。混合每种细菌菌株所需量，使总量达到约5 x 106 CFU/mL
  2. 将混合物在7,000 x g条件下离心 g 4 °C 条件下离心 7 分钟，小心移除上清液。将沉淀重悬于 HBSS（LB/+G）中，即为细菌接种物。
  3. 从芯片舱中取出芯片。用移液枪头堵住基底通道的出口，向基底通道入口加入200 µL不含青链霉素的DM，加样时不要按压移液枪的活塞。松开移液枪上的枪头，使培养基在重力作用下自由流经通道至出口。
  4. 向顶端通道入口加入37 µL细菌接种液，同时从出口端抽吸。当移液枪头中剩余约2 µL时，取出枪头，并用移液枪头封住顶端通道的入口和出口。
  5. 对于对照（未接种）芯片，使用 37 µL HBSS (LB/+G) 重复步骤 7.4。
  6. 吸除芯片表面的任何培养基。将芯片置于150 mm的培养皿中，在37 °C、5% CO₂条件下孵育。2 24 小时。
  7. 将芯片架（不含芯片）放置于托盘上，放入37 °C、含5% CO₂的培养箱中2 24 小时。
  8. 将 50 mL HBSS (LB/+G) 和 50 mL 不含青霉素-链霉素的 DM 预热至 37 °C。
  9. 向50 mL不含青链霉素的DM中加入20 µL 10 µM雌二醇，充分混匀，并在无菌条件下真空脱气5 min。将(HBSS (LB/+G))置于真空条件下脱气5 min。
  10. 小心吸取pod中的培养基，避免接触储液槽的进液口和出液口。
  11. 向顶端入口端口储液池中加入 3 mL 脱气的 (HBSS (LB/+G))，向顶端出口端口储液池中加入 500 µL 脱气的 (HBSS (LB/+G))。
  12. 向基底侧入口端口储液池中加入 3 mL 脱气的不含青链霉素的 DM，向基底侧出口端口储液池中加入 500 µL 脱气的不含抗生素的 DM。
  13. 将含有样本舱（不含芯片）的托盘插入DFM，并运行两次引物循环。检查样本舱底部每个端口是否有液滴流出。
    注意：如果滴液在4秒后仍未形成 "Prime" 循环过程中，直接接触芯片出口储液池内的端口（图1B) 并用移液器加入200 µL相应的培养基，使培养基在储液池与通道之间流动。
  14. 从芯片上取下移液器吸头，并在所有通道的入口和出口处分别滴加相应培养基的液滴。
  15. 将芯片插入卡盒，并将卡盒放入托盘中。
  16. 吸出顶端和基底出口微槽中的培养基以及芯片表面的任何培养基。然后将托盘推入DFM。
  17. 在DFM上设置以下参数：顶部和底部 - 液体；顶端（顶部）流速 - 40 µL/h；基础（底部）流速 - 40 µL/h；拉伸 - 0%频率 - 0 Hz运行 调节 周期。
  18. 4小时后停止灌流，收集流出液，即顶侧和基底侧出口储液器中的培养基。
  19. 测量并记录流出液的体积。
  20. 将芯片重新放入DFM中，设定顶端流速为0 µL/h，基底流速为30 µL/h，启动流体并运行过夜。
  21. 将收集的流出液分装至各种计划进行的检测中，并在适当的温度下保存。
    注意：进行菌落形成单位（CFU）测定时，加入甘油至终浓度为16%，并立即于-80 °C保存。
  22. 吸出仅位于基底侧出口储液池中的培养基，并将双流体微灌注系统（DFM）中的顶端和基底侧流速均设置为40 µL/h。启动灌注4小时，然后重复步骤7.18–7.21。此步骤将用于收集48小时的流出液。
  23. 重复步骤 7.22，持续 72 小时或直至实验结束。
  24. 在实验终点，按照步骤 7.18–7.19 收集流出液。
  25. 通过在 TrypLE express 中加入 1 mg/mL 的 Collagenase IV 制备消化液。将 10 mL 消化液预热至 37 °C。
  26. 用移液枪头堵住基底通道的出口端。向基底通道中加入 100 µL 消化液。充分混匀后，用移液枪将通道中的全部液体收集至标记为“Tube B”的离心管中。
  27. 用移液枪头堵住顶端通道的出口端。向顶端通道加入 100 µL 消化液。充分混匀后，用移液枪将通道中的全部液体收集至标记为“Tube A”的离心管中。
  28. 向顶端和基底通道的入口处各加入100 µL消化液，同时用移液器吸头堵住出口。将芯片以及A管和B管置于37 °C孵育1–1.5小时。
  29. 使用已插入入口和出口的封堵吸头，将消化液在通道内充分混匀。分别收集顶端通道和基底端通道的内容物至A管和B管，分别为芯片顶端消化液和基底端消化液。
  30. 使用血细胞计数板对A管中的细胞进行计数。同时，从芯片消化液中取出一份等分试样，用于后续7.21步骤的菌落形成单位（CFU）测定。

8. 芯片流出物与消化产物的分析

  1. 为对出水和消化产物中的细菌进行计数，将出水或消化产物用无菌 DPBS (-/-) 进行系列稀释，接种于合适的培养基平板上，在 37 °C 培养 24–48 小时，然后计数平板上的菌落。
  2. 为测定 pH 值，在收集 72 小时出水后立即取 10 μL 样品，使用 pH 试纸测定出水的 pH 值。
  3. 为分析细胞因子，使用出水样品通过基于 Luminex 的检测、ELISA 或其他适用技术检测特定细胞因子29,30。

结果

人类阴道由复层上皮构成，其下方为富含成纤维细胞的胶原结缔组织基质。为模拟这一结构，可在双通道微流控器官芯片装置中，将原代人阴道上皮细胞和成纤维细胞分别培养于同一多孔膜的两侧，从而构建组织界面。通过明场显微成像监测阴道上皮的形成过程，可观察到细胞逐渐形成连续的单层，并进一步发育为多层细胞结构（图2A）。既往研究已证实，从横切面观察，该形态特征与完全分层的上皮结构发育相对应29。然而，若上皮层呈现斑块状且不连续（图2B），则该阴道芯片可能不适合用于实验。

图3 展示了阴道芯片（Vagina Chip）构建过程的示意图。为了验证阴道芯片的功能，将芯片分别接种 L. crispatus 和 G. vaginalis，以模拟健康的和菌群失调的阴道环境。其中，G. vaginalis 是细菌性阴道病的主要致病菌。为了检测健康和菌群失调相关细菌是否成功在阴道芯片上定植，通过将芯片通道流出液及消化后的细胞层接种至选择性细菌培养基（L. crispatus 使用脱曼-罗戈萨-夏普（De Man-Rogosa-Sharpe, MRS）琼脂，G. vaginalis 使用布鲁氏菌血琼脂（Brucella blood agar, BBA）（参见材料表））并计数菌落，同时与原始接种物的平行培养结果进行比较，从而定量芯片中的细菌载量。接种后48小时内可在培养板上检测到 L. crispatus 和 G. vaginalis 的菌落（图2C），证实健康和菌群失调相关细菌均能在阴道芯片上成功定植。然而，若在接种物培养板上观察到细菌菌落，但在经过规定孵育时间后的流出液或消化产物培养板上未观察到菌落，则可认为细菌未能成功定植。

健康的阴道环境呈酸性，而菌群失调会导致阴道pH值升高31。因此，也对阴道芯片上皮腔道流出液的pH值进行了分析。接种卷曲乳杆菌（L. crispatus）的阴道芯片的pH值与未接种的对照芯片相似，而与阴道加德纳菌（G. vaginalis）共培养时，pH值显著升高（图2D）。若观察到未感染的阴道芯片pH值偏高，则表明存在异常，此类芯片不应用于实验。

阴道组织的炎症状态也受阴道微生物组构成的影响，菌群失调的微生物组会引发炎症。在接种 L. crispatus 或 G. vaginalis 后第3天，分析阴道芯片顶端通道中的促炎性细胞因子发现，与未感染的芯片以及接种 L. crispatus 的芯片相比，接种 G. vaginalis 后的促炎反应明显更强（图2E）。综上所述，这些结果表明，阴道芯片能够紧密模拟人体阴道微环境在健康和菌群失调状态下的特征。

用于细胞研究的微流控芯片示意图及装置，显示顶侧和基底侧流动。
图1：双通道芯片及其配套pod装置。（A）双通道PDMS芯片的图像，显示其通道和端口。（B）pod装置的图像，显示顶侧和基底侧通道的储液池和端口。（C）示意图显示被微生物感染的阴道芯片的横截面视图。请点击此处查看该图的放大版本。

类器官芯片示意图，显示微通道对比；图表展示菌落形成单位（CFU）、pH值、细胞因子水平（IL-8、IL-6）
图2：阴道芯片模拟健康与菌群失调状态下的人体阴道微环境。（A）功能良好的阴道芯片顶侧通道中的阴道上皮细胞。上方图像中的比例尺为1 mm，下方图像中的比例尺为500 µm。（B）功能不佳的阴道芯片顶侧通道中的阴道上皮细胞。上方图像中的比例尺为1 mm，下方图像中的比例尺为500 µm。（C）阴道芯片中接种L. crispatus（LC）和G. vaginalis（GV）的情况。（D）与未感染（对照）阴道芯片相比，接种L. crispatus（LC）和G. vaginalis（GV）后72小时的阴道芯片pH值。（E）与未感染（对照）阴道芯片相比，接种L. crispatus（LC）和G. vaginalis（GV）后72小时的阴道芯片促炎反应。（C–E）图表数据表示4–6个芯片的平均值±标准差；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，与对照组阴道芯片相比；每个（●）代表一个芯片的数据。请点击此处查看该图的放大版本。

HVEC 和 HUF 细胞培养、细菌感染、细胞因子分析；实验流程图。
图 3：阴道芯片构建方案的示意图。 细胞接种及阴道芯片构建过程中各步骤的示意图。HVECs — 人阴道上皮细胞；HUFs — 人子宫成纤维细胞；VEM — 阴道上皮培养基；FM — 成纤维细胞培养基；DM — 分化培养基；PS — 青霉素-链霉素。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

以往的人体阴道 体外 模型无法真实再现阴道组织结构、液体流动以及宿主与病原体之间的相互作用19,22。动物模型也因不同物种间微生物组的差异以及动情周期或月经周期的不同而受到限制19,22。本文描述了一种构建人源阴道类器官芯片模型的实验方案，该模型可有效模拟人体对健康及失调微生物群落的反应。

本方案涉及在商用双通道器官芯片装置（参见材料表）中，于分隔平行微通道的共用多孔膜两侧分别接种阴道上皮细胞和成纤维细胞。该多孔膜允许生长因子及其他形式的细胞间信号分子迁移，而胶原涂层及细胞单层的存在则可防止通道间培养基的混合。当顶腔通道中形成阴道上皮细胞单层后，向基底通道流动的培养基中加入分化因子，这些因子穿过间质空间，从而促进阴道上皮细胞分化，形成复层上皮结构。接种时阴道上皮细胞的密度是决定分化阶段结束时阴道芯片健康状态的关键因素。因此，在启动分化前应评估阴道上皮细胞的密度，且必须在形成完整单层后方可启动分化。暴露于分化因子的过程可持续至达到所需的阴道上皮细胞密度，并在细菌接种前停止。此外，需注意不同供体（或商业来源）的原代阴道上皮细胞生长速率可能存在差异，这可能影响所构建阴道芯片的质量。在所有微流控器官芯片研究中，必须彻底清除芯片培养过程中可能在通道内形成的气泡，因为气泡会干扰培养基流动，最终导致营养供应减少及细胞活力下降。

本方案还介绍了如何使用阴道芯片在芯片上建立模拟健康阴道状态或细菌性阴道病的细菌群落。该阴道芯片也可用于研究其他阴道疾病或紊乱，但在开展此类研究时，应注意了解每种疾病的特征，并明确将研究结果与临床发现相关联的最佳方法。总之，人类阴道芯片为研究与女性生殖道相关的多种疾病和状况开辟了新途径，可成为探索潜在治疗手段的有力工具。

披露

Donald Ingber 是 Emulate 公司的创始人、董事会成员、科学顾问委员会主席及股权持有者。其他作者声明不存在利益冲突。

致谢

本研究由比尔及梅琳达·盖茨基金会（项目编号：INV-035977）和哈佛大学威斯生物启发工程研究所资助。我们还感谢威斯生物启发工程研究所的 Gwenn E. Merry 对本文稿的编辑。图 1 中的示意图使用 BioRender 绘制。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 µm SteriflipMillipore SCGP00525用于培养基脱气
双通道芯片EmulateBRK-S1-WER-24双通道芯片试剂盒的组成部分
200 μL 封堵吸头（或滤芯吸头）Thomas Scientific, SHARP1159M40用于芯片接种的吸头
活化试剂1（或ER-1粉末） EmulateChip S1 Basic Research kit-24PK双通道芯片试剂盒的组成部分；储存温度 -20 °C  
活化试剂2（或ER-2溶液） EmulateChip S1 Basic Research kit-24PK双通道芯片试剂盒的组成部分；储存温度 4 °C
腺嘌呤Sigma Aldrich A2786分化培养基的组分
布鲁氏菌血琼脂平板VWR International Inc. 89405-032含血红素和维生素K；用于阴道加德纳菌的计数
无Ca²⁺和Mg²⁺的DPBS（DPBS (-/-)）ScienCell303用于细胞洗涤
氯化钙Sigma Aldrich C5670分化培养基的组分
氯化钙（无水） Sigma Aldrich 499609HBSS（LB/+G）的组分
胶原蛋白I型 Corning354236用于HVEC的包被溶液
胶原蛋白IV型 Sigma Aldrich C7521用于HVEC的包被溶液
胶原酶IVGibco17104019用于从阴道芯片中解离细胞
完全成纤维细胞培养基 ScienCell2301用于HUF培养的培养基
完全阴道上皮培养基LifelineLL-0068用于HVEC培养的培养基
D-葡萄糖（右旋糖） Sigma Aldrich 158968HBSS（LB/+G）的组分
DMEM（低葡萄糖） Thermofisher12320-032分化培养基的组分
动态流控模块（或Zoë）EmulateZoë-CM1调节芯片的流速
Ham's F12Thermofisher11765-054分化培养基的组分
热灭活胎牛血清 Thermofisher 10438018分化培养基的组分
人子宫成纤维细胞ScienCell7040HUF
人阴道上皮细胞LifelineFC-0083HVEC
氢化可的松Sigma Aldrich H0396分化培养基的组分
ITESLonza17-839Z分化培养基的组分
L-谷氨酰胺Thermofisher25030081分化培养基的组分
六水合氯化镁Sigma Aldrich M2393HBSS（LB/+G）的组分
七水合硫酸镁Sigma Aldrich M1880HBSS（LB/+G）的组分
MRS琼脂平板VWR International Inc. 89407-214用于乳酸杆菌的计数
磷酸乙醇胺Sigma Aldrich P0503分化培养基的组分
青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep）Thermofisher 15070063分化培养基的组分
pH试纸Fischer-Scientific13-640-520用于pH值测定 
芯片模块（每芯片1个） EmulateBRK-S1-WER-24双通道芯片试剂盒的组成部分
聚-L-赖氨酸ScienCell403用于HUF的包被溶液
氯化钾 Sigma Aldrich P3911HBSS（LB/+G）的组分
磷酸二氢钾Sigma Aldrich P0662HBSS（LB/+G）的组分
无菌80%甘油 MP Biomedicals 113055034用于细菌样本的冷冻保存
三碘甲腺原氨酸Sigma Aldrich  T6397分化培养基的组分
台盼蓝溶液（0.4%） Sigma Aldrich T8154用于活/死细胞计数
TrypLE ExpressThermofisher 12605010用于从阴道芯片中解离细胞
胰蛋白酶中和液（TNS） ScienCell113用于中和胰蛋白酶
胰蛋白酶/EDTA溶液（0.25%）ScienCell103用于细胞解离 
β-雌二醇 Sigma Aldrich E2257分化培养基中的激素

参考文献

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构建人阴道芯片中的健康与菌群失调阴道微环境模型
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