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一种改良的大鼠鞘内导管置入方法

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DOI：

10.3791/66487

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2025年2月14日

 ,  ,  ,  , 
1Shanghai Key Laboratory of Anesthesiology and Brain Functional Modulation, Clinical Research Center for Anesthesiology and Perioperative Medicine, Translational Research Institute of Brain and Brain-Like Intelligence, Department of Anesthesiology and Perioperative Medicine, Shanghai Fourth People's Hospital, School of Medicine, Tongji University, 2Department of Anesthesiology, Women and Children's Hospital of Ningbo University, 3Department of Naval Diving Medicine, Naval Medical Center, Naval Medical University, 4Department of Diving and Hyperbaric Medicine, Naval Medical Center, Naval Medical University

本文内容

摘要

本文介绍了一种改良的大鼠鞘内导管置入方法，该方法操作简便、使用方便，是一种可靠的重复性鞘内给药途径。

摘要

鞘内导管置入术已广泛应用于动物实验，尤其是神经病理性疼痛相关研究。然而，传统方法仍存在 若干局限性。尽管一些研究者已尝试改进传统方法，现有技术仍需进一步优化。本文介绍一种改良的大鼠鞘内导管置入方法。

本方法使用一根20 cm长的不锈钢丝（直径0.2 mm）、一段15 cm长的塑料PE10管、一个自制的密封帽以及一块0.3 cm × 0.5 cm的抗过敏胶带。我们改进的鞘内导管置入方法具有多个优点。第一，将不锈钢丝引入PE10管可增加导管的弹性，提高鞘内导管置入的成功率，减少手术所需空间，并最大限度地降低对腰椎周围组织的损伤。第二，PE10管的长度在手术前即已确定，导管留置时间可超过一周。第三，PE10管通过“8”字缝合法固定4次，可防止动物活动时导管移位或回缩。第四，使用 自制密封帽封闭PE10管末端，不仅可防止脑脊液泄漏，还可减少反复剪切PE10管的需要。最后，将PE10管的体外端用胶带结扎固定，以防止动物活动时导管回缩。

该方法可提高大鼠插管的成功率，因为约80%的PE10导管在术后28天仍保持在位。因此，这种改良方法可能为重复性鞘内给药提供一种简单、便捷且可靠的途径。

引言

大鼠鞘内插管（也称为蛛网膜下腔插管）是一种通过椎间隙将导管插入蛛网膜下腔的技术1。药物可通过导管直接注入蛛网膜下腔，使研究人员能够在不考虑药物穿透血脑屏障影响的情况下，研究药物对脊髓的作用2,3。此外，鞘内插管后还可采集脑脊液，以研究中枢神经系统的微环境4,5。目前使用的鞘内插管方法最早由Yaksh和Rudy于1976年建立6，此后广泛应用于神经科学、麻醉与镇痛、脊髓介导的心血管调节，尤其是神经病理性疼痛等领域的动物实验2,7。然而，该方法仍存在若干局限性，例如脊髓损伤发生率高、蛛网膜下腔出血、术后感觉和运动功能障碍、术后死亡率高以及神经系统损伤风险较高等问题4,5,8,9,10。为克服这些局限，Størkson等人于1996年提出了通过腰椎间隙进行蛛网膜下腔插管的方法，并报告了更高的术后成功率11。值得注意的是，该方法中留置导管的固定仍是一大挑战，由于动物活动，导管回缩较为常见，导致鞘内给药不便。

由于上述局限性，一些研究者12,13,14,15 已尝试改进穿刺工具、导管插入方法以及导管固定方法，但由于操作困难，现有方法仍需进一步改进 在量化所用微珠直径、需要反复穿刺以及导管长度较短等方面。11

根据鞘内导管植入的腰椎入路方法1以及中心静脉导管植入的塞丁格技术16，我们建立了一种用于大鼠的鞘内导管植入方法，该方法采用不锈钢丝、自制密封帽和抗过敏胶带，以简化现有操作流程。通过该方法，导管可轻松插入蛛网膜下腔，并稳定固定于大鼠背部，避免了多次鞘内给药所需的重复穿刺。

本文介绍了一种改良方法，该方法可能提高大鼠鞘内插管的成功率，并具有代表性 一种简单、便捷且可靠的重复性鞘内给药方法。

方案

鞘内导管植入术严格按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中的建议进行，实验方案已获得中国实验动物伦理委员会批准（编号：TJBH15523201）。实验采用雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠。操作过程中注意尽量减少动物的疼痛与不适。

1. 材料与仪器准备

注意：材料和仪器的准备对于成功实施鞘内导管置入术至关重要。

  1. 准备一根15 cm长的PE10管（长度根据大鼠头部与尾端之间的距离确定），将一根20 cm长、直径为0.2 mm、两端抛光的不锈钢丝插入PE10管中作为支撑，并在管的一端距端口2 cm处做标记，以指示插入深度（如图1A、B中的黑色十字所示）。
  2. 剪去22 G针头的尖锐针尖，并封闭其远端（图1C）。
  3. 将一根硬膜外导管（外径1.0 mm）切成1 cm长的小段；然后将一段插入去除了针尖的22 G针头中（图1D），并用加热的直头镊子封闭该段导管的远端。此装置称为管封帽（图1E）。
  4. 用剪刀将一条丝质胶带（1.25 cm × 9.1 m）裁剪成0.3 cm × 0.5 cm的抗过敏胶布（图1F）。

2. 手术准备

  1. 手术前对用于鞘内插管的器械进行灭菌处理。手术所用器械包括有齿镊、剪刀、灌胃装置、手术刀柄和#10刀片。（图2）。
  2. 将PE10管和导丝浸入75%乙醇中约2小时进行灭菌。

3. 手术

  1. 麻醉大鼠 使用3%异氟烷，流速为3 L/min。
  2. 将大鼠置于手术台上，用镊子夹捏后肢足掌以观察缩足反射。若刺激后肢无运动反应，则表明麻醉成功。在鞘内导管置入前，通过肌肉注射给予1 mg/kg美洛昔康以确保充分镇痛。
  3. 用剃毛器去除背部腰椎区域及两耳之间的毛发。
  4. 将一支离心管（直径3 cm）置于腹部下方 在腰臀交界处固定大鼠，以增加腰椎的屈曲程度，从而为针头和导管的通过提供更大空间。
  5. 用聚维酮碘溶液对手术部位（腰椎区域以及两耳之间区域）进行消毒 然后用乙醇溶液冲洗三次。用无菌敷料覆盖大鼠，并暴露手术部位。术前用生理盐水冲洗PE10管和导丝。
    注意：未包裹尾巴，以便在鞘内插管过程中观察尾巴的运动。
  6. 通过定位左侧和右侧髂嵴中点处的L6棘突，确定L5与L6之间的椎间隙位置。操作者用左手拇指和示指固定皮肤，然后在L4至S1棘突上方做一条长约3-4 cm的正中切口。
  7. 用剪刀钝性分离皮下组织。再次定位L5和L6之间的椎间隙，并在L5和L6棘突两侧各做一小型切口（0.3 - 0.5 cm）。
  8. 用有齿镊夹住并提起L5棘突，以扩大椎间隙。然后用剪刀钝性分离椎体周围的肌肉，直至完全暴露L6棘突顶端。
    注意：应避免切除椎体或肌肉的任何部分，以尽量减少对周围组织的损伤。
  9. 用有齿镊提起L5背侧突，同时用另一把镊子扩大椎间间隙，然后用棉球清理L5-6椎间区域，直至倒置的 "V" 区域完全暴露。
  10. 用23 G针头刺穿倒置标本的脊柱 "V" L6 背侧突起顶部下方的区域
    注意：观察到尾巴抽动和/或有无色透明液体从蛛网膜下腔流出，表明已成功穿刺进入蛛网膜下腔。
  11. 在穿刺部位将装有不锈钢丝的PE10管插入椎管，管子向尾部倾斜约30°。调整插入角度，直至PE10管可无阻力地顺利插入（此过程中可观察到尾巴抽动）。
  12. 当PE10管的标记区域到达后部肌肉时，停止插管。
  13. 缓慢地将不锈钢丝从PE10管中取出。可能会观察到尾部抽动现象。
    注意：可能会观察到尾部抽动，移除导丝后，可能有透明液体（或淡红色液体）从导管流出。
  14. 然后，将PE10管连接至1 mL注射器，通过注射器注入20 µL生理盐水。移除注射器后，生理盐水会持续从PE10管流出，表明其已成功插入蛛网膜下腔。
  15. 确认PE10管通畅后，用4-0缝线缝合一侧椎体旁肌肉并打结。随后将缝线绕过PE10管并再次打结。不要剪断缝线；缝合另一侧肌肉后，再次将缝线绕过PE10管，打第三个结，然后剪断缝线。
    注意：此步骤使用8字缝合法固定PE10管，以降低导管移位和回缩的可能性。
  16. 在耳间中点下方1 cm处做一个0.5 cm长的切口。用剪刀钝性分离皮下组织，插入金属灌胃管并向尾侧推进，直至管尖在腰部切口处可见。
  17. 将PE10导管的远端插入灌胃管，直至PE10导管从灌胃管的另一端穿出；然后轻柔地撤出灌胃管。
  18. 当确认PE10管再次通畅后，用4-0缝线缝合腰部切口周围的剩余肌肉，将缝线围绕PE10管打结，并再打一个结以再次固定PE10管。
  19. 缝合皮肤，注意避免损伤PE10管。随后用4-0缝线缝合颈部皮肤，将缝线围绕PE10管打结，以固定PE10管。
  20. 当确认PE10管再次通畅后，用密封帽封闭其体外端。
  21. 用一片纸巾将PE10管擦干，然后将抗过敏胶带在PE10管上缠绕数圈，以防止大鼠活动时PE10管回缩。

4. 利多卡因验证实验

  1. 手术后，将大鼠放回笼中（每笼一只），并在麻醉恢复期间密切观察，直至大鼠恢复意识。
  2. 待大鼠完全清醒后，取下封帽，使用 Hamilton 注射器以 0.02 mL/s 的速度向 PE10 管中注入 20 µL 的 2% 利多卡因，随后注入 10 µL 生理盐水。
  3. 用封帽重新封闭 PE10 管。
  4. 将大鼠置于桌面上并仔细观察。若经 PE10 管鞘内注射利多卡因后出现后肢麻痹，则表明导管置入成功（图 3）。后肢麻痹通常持续约 30 分钟10。
    注意：在进行后续实验前，应让大鼠恢复 5–7 天。
  5. 在恢复期间密切观察大鼠，直至其肢体功能完全恢复。

结果

进行鞘内注射时，需剪断PE10导管的体外端，并在两次药物注射之间用密封帽封闭PE10导管。在我们的预实验中，鞘内导管置入的成功率约为95%（20只大鼠中有19只成功）；操作过程中出现尾巴甩动和/或释放出无色透明液体即表明置管成功。约85%的导管在术后7天仍保留在位，约80%的导管在术后28天仍保留在位。大鼠在术后很快恢复，术后7天内未观察到任何并发症。日常活动正常，未见行为学异常。这些结果表明，我们的方法在成功率和长期留置率方面优于以往报道的方法。

通过导管注射利多卡因后出现下肢完全瘫痪，表明鞘内导管置入成功15。鞘内导管置入的成功率通过成功置管的大鼠数量除以大鼠总数计算得出。采用我们改进的方法，成功率为95%，高于Hou等报道的方法所达到的88%15。结果如图4所示。

鞘内导管在鞘内置管后的第2、5和7天进行监测，留置导管成功率为留置成功的导管大鼠数/大鼠总数 × 100%。在StØrkson等人的研究中11，鞘内置管后第2、5和7天的留置导管成功率分别为94%、81%和65%。采用本实验技术，鞘内置管后第2、5和7天的留置导管成功率分别为95%、90%和85%（图5）。

不同针头长度的比较；六幅图示，在白色背景上用尺子测量针头。
图 1．鞘内插管所用材料与仪器。（A）准备一根15 cm长的PE10管，并在距一端2 cm处做标记，以指示插入深度。（B）将一根20 cm长、两端抛光的不锈钢丝插入PE10管中作为支撑。（C）用剪刀剪去22G针头的尖端，并用镊子封闭远端。（D）将硬膜外导管（外径1.0 mm）切成1 cm长的片段，然后插入已去除尖端的22G针头中。（E）用加热的直头镊子封闭硬膜外导管的远端；此装置称为管封帽。（F）用剪刀裁剪出一块0.3 cm × 0.5 cm的抗过敏胶带（丝质胶带，1.25 cm × 9.1 m）。请点击此处查看该图的放大版本。

手术器械排列：灌胃针、剪刀、镊子、持针器、手术刀；实验操作准备。
图2脊髓鞘内导管置入术的器械准备 使用乙醇对器械（如带齿镊、剪刀、灌胃装置、手术刀柄和#10刀片）进行灭菌约2小时，然后在手术前约30分钟用生理盐水冲洗。 请点击此处查看该图的放大版本。

进行伤口愈合实验的大鼠，显示背部皮肤上的切口及愈合进展。
图3。鞘内导管植入后利多卡因验证实验的结果。 鞘内注射20 µL 2%利多卡因后，再注射10 µL生理盐水，大鼠出现短暂性瘫痪：下肢瘫痪在30秒内发生，并于30分钟后消失，表明鞘内导管植入成功。 请点击此处查看该图的放大版本。

成功导管插入率对比图，改进方法为95%，先前方法为88%。
图4。本研究改进方法与既往报道方法在导管插入成功率方面的比较。 请点击此处查看该图的放大版本。

长期留置导管率图表，比较先前方法与改进方法在7天内的表现。
图5。本研究改进方法与既往报道方法在长期留置导管率上的比较。 请点击此处查看该图的放大版本。

　改良方法先前方法改良方法的优势先前方法的劣势
插管引导方法不锈钢丝引导套管（20G 0.9×38 mm）增加导管的弹性难以感知阻力，增加操作难度
提高鞘内插管的成功率因反复穿刺造成组织损伤
降低对手术空间的要求导管一端被拉伸至原长度的1.5倍，导致两端直径不同
最大程度减少对腰椎周围组织的损伤由于20G引导套管的直径是拉伸后PE10导管的2倍或更大，易导致脑脊液泄漏
PE10导管长度15 cm14 或 28 cm无论导管留置时间长短，均易于确定PE10导管的长度较短的PE10导管留置时间较短；较长的PE10导管易脱出体外
固定方法“8”字缝合，缝合4次1 或 2个结节避免动物活动期间导管移动或回缩导管两端直径不同，制结过程中PE10导管易发生移位
导管封闭方法自制帽盖无防止脑脊液泄漏需要反复剪切PE10导管
避免反复剪切PE10导管
防回缩方法抗过敏胶带1 或 2个结节防止动物活动期间导管回缩易发生回缩

表1. 改进方法与先前报道方法的优缺点。

讨论

为提高改良方法下鞘内插管的成功率，有几点关键提示。首先，应准备一根长20 cm、两端抛光的不锈钢丝，并将其插入PE10管中作为支撑。其次，操作者需用棉球清洁L5-6椎间隙后，充分暴露倒置的"V" 区域，并用有齿镊提起L5背侧棘突，同时用另一把镊子撑开椎间隙。第三，PE10管应以“8”字缝合法固定四次。最后，PE10管的体外端应用带子结扎，并用自制帽密封。

鞘内导管置入的成功率以及对椎体周围组织的损伤程度可能显著影响实验结果的可靠性15。因此，在建立动物模型及相关实验中，尽可能提高成功率并减少对周围组织的损伤至关重要 1。在本改良方法中，将一根不锈钢丝插入PE10导管中作为引导，从而增加导管的弹性，提高鞘内导管置入的成功率。此外，该改良方法减少了操作所需的空间，并通过钝性分离而非切割的方式最大限度地减少了对腰椎周围组织的损伤。相比之下，在先前报道的方法11中，使用20 G引导套管以降低穿刺阻力，常需反复穿刺，可能造成组织损伤。另外，在先前报道的方法中，为减小PE10导管的直径，需将其浸入温水（60 °C）中，然后在一端拉伸至原始长度的约150%，但该方法可能无法保证导管直径的一致性，从而导致脑脊液泄漏，因为20 G引导套管的直径约为拉伸后PE10导管直径的两倍或更大。此外，在本方法中，腰椎功能得到最大程度的保留，避免了手术对后续实验结果的影响。这些结果与Xu等2报道的结果一致。

在先前报道的方法11中，若将PE10导管固定在穿刺部位附近，其长度约为14 cm，但在这种条件下，导管留置时间通常短于7天（或导管被大鼠自行拔出）。若将导管固定于颈部背部，则PE10导管长度约为28 cm，显著长于本方法所用的PE10导管（15 cm）。尽管按照Størkson等11报道的方案制备了结节，但仍有一些导管被动物排出体外，术后7天时仅约65%的导管仍保留在原位，这显著影响了后续实验的结果。在本方法中，PE10导管采用“8”字缝合法固定4次，并将导管体外端用绑带系紧，以降低移位和回缩的可能性。采用本方法后，术后7天约85%的导管仍保留在原位，术后28天时仍有约80%的导管保持固定。

在先前报道的方法11中，每次给药时均需剪断鞘内导管的体外端。然而，反复进行鞘内给药可能缩短导管留置时间，从而使鞘内给药变得不便。因此，在我们的方法中，采用自制帽封闭PE10管，并每日用乙醇消毒一次。该方法不仅可防止脑脊液泄漏，还能减少为鞘内给药而反复剪切PE10管的需要，确保药物的有效递送。

改良方法与既往报道方法的优缺点总结于表1中。首先，对于改良方法而言，在PE10导管内插入不锈钢丝可增加导管的弹性，提高鞘内插管的成功率，减少手术所需操作空间，并最大限度地减少对腰椎周围组织的损伤。而在既往报道的方法中，需将20G引导套管插入至遇到阻力为止，常需反复穿刺，可能导致组织损伤。此外，该方法需将PE10导管一端拉伸至原长度的约150%，由于20G引导套管的直径大于或等于拉伸后PE10导管直径的2倍，因此可能导致脑脊液泄漏。其次，在改良方法中，PE10导管的长度在术前即已确定，导管留置时间可超过一周；而在既往报道的方法中，若将导管固定于穿刺部位，PE10导管长度约为14 cm，但由于大鼠活动易导致导管被拉出体外，导管留置时间通常短于7天；若将导管固定于颈部背部，则PE10导管长度约为28 cm，显著长于本方法所用导管长度。第三，在改良方法中，使用“8”字缝合法将PE10导管固定4次，以防止导管移动和回缩；同时采用自制帽封堵PE10导管末端，不仅可防止脑脊液泄漏，还可避免反复剪切导管；而在既往方法中，难以获得直径一致的熔珠，形成熔珠时常发生PE10导管移位，且常需反复剪切导管。最后，在改良方法中，将PE10导管的体外端用绑带固定，可防止动物活动时导管回缩；然而在既往方法中，由于难以获得直径一致的熔珠，熔珠无法可靠防止PE10导管回缩。

总体而言，这种改良的鞘内导管置入方法具有以下优点。首先，在PE10导管内插入不锈钢丝可增加导管的弹性，提高鞘内导管置入的成功率，减小手术所需操作空间，并最大限度地减少对腰椎周围组织的损伤，从而最大程度地保留腰椎功能，避免手术对后续实验结果造成影响。其次，采用“8”字缝合法将PE10导管固定4次，可有效防止导管在动物活动过程中发生移位或回缩。第三，使用自制的密封帽封闭PE10导管末端，不仅可防止脑脊液泄漏，还可避免反复剪切PE10导管；反复剪切导管可能导致导管缩短，给药物输送带来不便。最后，将PE10导管的体外端用抗过敏胶带结扎固定，以防止导管在动物活动时发生回缩。

然而，这种改良的鞘内导管置管技术存在一些局限性。首先，术后大鼠需要单独饲养（每笼一只），以避免损伤PE10管的体外端。其次，在鞘内注射利多卡因后，需要5-7天的恢复期，才能进行后续实验。

总之，这种改进的鞘内导管置入方法可作为重复给予鞘内药物的有用工具，并代表 一种简便、便捷且可靠的方法，以缩短实验周期。

披露

本文手稿的作者声明不存在利益冲突。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（编号：81971042）和上海市虹口区卫生健康委员会重点支持专科项目（编号：HKZK2020A06）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 cc 注射器Jiangxi Hongda Medical Equipment Co., Ltd1 cc
22 号 × 1” 针头Jiangxi Hongda Medical Equipment Co., Ltd22G
23 号 × 1” 针头Jiangxi Hongda Medical Equipment Co., Ltd23G
25 μL Hamilton 注射器Shanghai Bolige Co.,Ltd0.31mm 25 μL 
4-0 MERSILK 非吸收性缝线ETHICONSA83G
50 mL Corning 离心管，直径 3 cm430820CORNING
硬膜外导管及连接器Henan Tuoren Medical Device Co., Ltd常规型号
灌胃装置Shanghai Bolige Co.,Ltd8#
PE-10 微型医用导管BB31695-PE/1Scientific Commodities, Inc
手术刀柄及 #10 刀片Jiangsu Songxin Medical Equipment Co., Ltd125mm
剪刀Jiangsu Songxin Medical Equipment Co., Ltd100mm
Sprague-Dawley (SD) 大鼠Shanghai BK/KY Biotechnology Co., Ltd雄性
直径 0.2 mm 的不锈钢丝Dongguan Jiazhi Metal Products Technology Co., Ltd.0.2mm  ×  1m
有齿镊Jiangsu Songxin Medical Equipment Co., Ltd18cm
URGO 丝线胶带URGO1.25cm × 9.1m

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