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建立人骨肉瘤组织来源的患者异种移植小鼠模型

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DOI：

10.3791/66491

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2024年3月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of theory and therapy of muscles and bones, Ministry of Education

通讯作者： Yanping Yang <yanpingyangks@163.com>

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了利用人骨肉瘤组织建立患者来源的异种移植（PDX）小鼠模型的方法。

摘要

骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤。尽管近年来出现了新的治疗方案，但骨肉瘤患者的预后并未显著改善。因此，建立一个高保真的临床前模型至关重要。患者来源的异种移植（PDX）模型能够忠实地保留每位患者肿瘤的遗传、表观遗传及异质性特征。因此，PDX模型被认为是用于癌症转化研究中多种癌症研究的真实体内模型。本文提供了一套完整的建立和维持PDX小鼠模型的实验方案，该模型可准确模拟人类骨肉瘤的形态学特征。该方法包括将新鲜切除的人类骨肉瘤组织立即移植到免疫缺陷小鼠体内，并进行连续传代。所描述的模型可用于研究骨肉瘤的生长、耐药性、复发和转移过程，同时有助于靶向治疗药物的筛选以及个体化治疗方案的建立。

引言

骨肉瘤是一种起源于骨间叶细胞的原发性恶性骨肿瘤，在青少年和儿童中最为常见。它常发生于长骨干骺端的骨骺部位，具有恶性程度高、早期转移和预后差的特点1,2。肺转移是骨肉瘤患者死亡的主要原因。非转移性骨肉瘤患者的5年生存率为65%–70%3。然而，在过去40年中，转移性骨肉瘤患者的5年生存率（仅为20%）并未显著提高，且25%的骨肉瘤患者在确诊时已出现转移4。目前，骨肉瘤治疗的一线药物已达成共识，但在化疗方案和治疗时间上仍存在显著差异5。基于合适的动物模型开展临床前实验，以获得更有效的化疗方案，具有重要意义。

目前，常用于骨肉瘤临床前实验的模型包括基于细胞系的模型 体外 细胞培养和 体内 细胞来源的异种移植模型（CDX）以及患者来源的异种移植模型（PDX）6,7.

细胞系便于培养和使用 体外 用于研究，或移植至免疫缺陷小鼠以建立CDX模型8然而，培养的细胞系 体外 可能无法准确反映恶性肿瘤的异质性以及患者的个体特征，这是由于为适应环境而发生的潜在突变所致 体外 在连续传代过程中，它们缺乏肿瘤在体内生长和发育所必需的微环境及免疫系统。尽管CDX模型相较于某些方法具有一些优势 体外 细胞培养，尽管从CDX模型获得的肿瘤组织相较于培养的细胞系具有更有限的瘤内异质性和免疫系统代表性，但仍可能无法完全反映骨肉瘤患者的个体特征 体外9因此，建立高保真度的临床前模型至关重要。

PDX 模型涉及将新近切除的人类癌组织直接移植到免疫缺陷小鼠体内。该方法能够忠实地保留每位患者肿瘤的遗传、表观遗传及异质性特征，即使在小鼠体内连续传代后仍可维持。此外，PDX 模型已被证实可准确预测后续临床结果10，因此在个体化治疗开发和精准医学研究中具有重要价值11。

本研究描述了通过移植人骨肉瘤组织在免疫缺陷小鼠中建立PDX模型的步骤。此类模型可作为骨肉瘤临床前实验研究的平台。

方案

所有涉及人体组织的研究均已获得上海中医药大学附属龙华医院（中国上海）机构伦理审查委员会的批准（批准号：2013LC52），并根据《赫尔辛基宣言》的要求获取了患者的书面知情同意。本动物实验的IACUC编号为PZSHUTCM221017013。四只四周龄雄性CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl 小鼠饲喂双狮牌辐照啮齿类动物饲料 GB 14924.3 并提供无菌水，在SPF条件下，每笼5只小鼠饲养于IVC小鼠笼中，光照/黑暗循环为12小时/12小时。 材料表 包含本实验方案中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息。

1. 人骨肉瘤组织的制备

注意：本研究中的人类骨肉瘤组织取自一名15岁骨肉瘤患者在化疗前的股骨病变部位切除样本12。

  1. 将新鲜切除的骨肉瘤组织立即置于组织保护液中，以在用无菌生理盐水冲洗后最大程度地保持骨肉瘤细胞的活性。
    注意：新鲜切除的骨肉瘤组织必须尽快移植到小鼠体内。在移植前，组织可在保护液中保存最多24小时。用于建模的骨肉瘤组织必须来自未经化疗的患者。接受过化疗的患者其肿瘤细胞活性较差，可能导致模型建立失败并丧失高保真性。
  2. 尽快将保存在组织保护液中的新鲜切除骨肉瘤组织转移至实验室。
  3. 准备建立PDX模型所需的实验器械和材料：手术刀（图1A）；眼科镊（图1B，C）；眼科剪（图1D）；缝合针（图1E）；缝合线（图1F）；直针持（图1G）；标记笔（图1H）。
    注意：所有手术器械在使用前必须经高压灭菌 处理。
  4. 在无菌操作台中，用预冷的无菌生理盐水冲洗骨肉瘤组织两次。
  5. 剔除骨肉瘤组织中出血和坏死的区域。
  6. 在含有预冷无菌生理盐水的培养皿中，用手术刀将清洗后的骨肉瘤组织切成3 mm3大小的组织块，并置于冰上保存。

2. 通过将骨肉瘤组织移植至小鼠 flank 区域建立 PDX 模型

  1. 通过皮下注射给予小鼠术前镇痛药物美洛昔康（5 mg/kg/24 h），并将裸鼠置于无菌手术巾上。在整个手术过程中提供保温支持。
  2. 通过暴露于3%异氟烷和97%氧气中诱导小鼠麻醉。待小鼠完全麻醉后，将其转移至鼻罩，并以1.5%异氟烷和98.5%氧气维持麻醉状态。
  3. 捏压脚趾以确认小鼠是否完全麻醉；若仍有痉挛或抽搐反应，需延长等待时间。
    注意：所有操作必须在无菌罩内使用无菌器械进行。为防止麻醉期间小鼠眼睛干燥，应涂抹眼用软膏。
  4. 将小鼠固定于侧卧位（图2A）。使用聚维酮碘和70%乙醇消毒棉球交替擦拭小鼠一侧 flank 区域三次，为骨肉瘤组织移植做消毒准备。
    注意：手术消毒应以中心为起点，呈环形向外螺旋式进行。
  5. 使用记号笔在皮肤上标记手术切口位置。
  6. 使用手术刀从皮肤至皮下组织做一5 mm切口（图2B）。
  7. 用左手持眼科镊提起切口上侧皮肤边缘，右手持直型持针器在小鼠真皮层下方向上进行钝性分离（图2C）。
  8. 用左手持眼科镊固定切口上侧皮肤，右手持眼科镊将骨肉瘤组织置于切口上方约5 mm处的皮下，完成骨肉瘤组织移植（图2C）。
    注意：确保骨肉瘤组织移植至真皮层下方。钝性分离应使用直型钝头解剖镊（如直型持针器）进行，以避免在寻找小鼠皮肤真皮层时穿透胸腔。
  9. 使用可吸收缝线对切口进行缝合，5 mm切口缝合2–3针（图2D）。
  10. 将小鼠放回清洁笼具，并持续监测直至其完全从麻醉中恢复。
    注意：通过移植人源骨肉瘤组织建立的PDX模型定义为第0代（P0），通过移植P0代PDX组织建立的模型定义为第1代（P1），后续依次为P2和P3。

3. 患者来源的异种移植瘤组织的收集

  1. 每周测量一次肿瘤体积。当肿瘤大小达到 1500 mm3 时，在吸入 CO2 后采用颈椎脱位法处死小鼠。人道终点包括肿瘤溃烂或前肢活动障碍。
    注：使用卡尺测量肿瘤的长径（a）和短径（b）。按以下公式计算肿瘤体积（V）：V = 1/2 × a × b2。
  2. 将小鼠侧置以暴露肿瘤，并用浸有酒精的棉球对肿瘤部位的皮肤进行消毒。
  3. 使用眼科剪完整分离肿瘤。使用电子天平称量肿瘤组织的质量。

4. 原发性临床肿瘤组织及PDX肿瘤组织的病理学检查

  1. 将肿瘤组织置于含有 30 mL 10% 中性缓冲甲醛溶液的 50 mL 管中固定 24 小时13。用流动水彻底冲洗肿瘤组织，以去除固定液。
  2. 将肿瘤组织脱水并包埋于石蜡中14。
  3. 切片肿瘤组织，并进行常规组织学检查15。

结果

本方案详细描述了建立PDX小鼠模型的步骤，通过将新鲜切除的人骨肉瘤组织立即移植并在小鼠中连续传代，保留了人骨肉瘤的形态学特征。本文中，已成功利用人骨肉瘤组织建立了PDX小鼠模型。

图3A 显示了PDX模型在P0代的小鼠代表性图像，该小鼠在移植15岁患者股骨骨肉瘤组织两个月后。图3B 显示了PDX模型在P1代的小鼠代表性图像，该小鼠在P0代移植PDX组织一个月后。图3C 显示了PDX模型在P2代的小鼠代表性图像，该小鼠在P1代移植PDX组织一个月后。图3D 显示了PDX模型在P3代的小鼠代表性图像，该小鼠在P2代移植PDX组织一个月后。

当肿瘤体积达到1,500 mm3时，通过吸入CO2后采用颈椎脱位法处死小鼠，以收集PDX肿瘤组织。来自临床患者和小鼠的肿瘤组织随后被包埋在石蜡中，并进行H&E染色。临床患者肿瘤组织的代表性H&E染色图像见图4A。P0、P1和P2代PDX小鼠肿瘤组织的代表性H&E染色图像见图4B、C、D。在P0、P1和P2代建立的PDX模型中，均保留了亲代临床患者肿瘤组织中骨肉瘤的特征，即细胞较小，细胞核呈圆形且深染。

手术器械排列，标注的工具，用于解剖或缝合演示的设置。
图1：手术器械。（A）手术刀。（B,C）眼科镊子。（D）眼科剪刀。（E）缝合针。（F）缝合线。（G）直型持针器。（H）标记笔。请点击此处查看该图的放大版本。

实验研究中小鼠解剖标记及手术步骤示意图。
图 2：PDX 模型的建立。（A）使用标记笔标出小鼠 flank 区域的骨肉瘤组织移植部位。（B）从皮肤至皮下组织切开一条长约 5 mm 的切口。（C）钝性分离并移植骨肉瘤组织。（D）缝合切口。请点击此处查看该图的放大版本。

小鼠模型中肿瘤的进展；实验示意图 A-D 显示了生长阶段及治疗效果。
图 3：源自一名15岁患者股骨骨肉瘤组织的PDX移植瘤生长情况。 （A）通过移植人骨肉瘤组织建立的PDX（P0）。 （B）通过移植P0代PDX组织建立的PDX（P1）。 （C）通过移植P1代PDX组织建立的PDX（P2）。 （D）通过移植P2代PDX组织建立的PDX（P3）。 请点击此处查看该图的高清版本。

组织病理学分析；细胞形态学比较；标记的显微镜图像 A-D, E-H。
图 4：原发性临床组织和PDX组织切片的苏木精-伊红（H&E）染色。 H&E染色检测到以下组织学特征：（A）15岁患者股骨骨肉瘤组织，（B）P0代PDX组织，（C）P1代PDX组织，（D）P2代PDX组织。比例尺：（A-D）100 µm；（E-H）20 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

PDX 模型能够模拟人类癌症的特征，并且与原发性肿瘤保持更高的相似性，包括遗传和基因组改变、组织学特征、异质性以及基因表达谱16,17,18,19。因此，它们保留了癌症患者的分子表型和基因型，为研究肿瘤生物学和评估潜在治疗手段提供了创新性的方法。这些方法包括对新型抗癌药物进行临床前筛选，其反应与真实临床反应高度相似；检测药物耐药生物标志物；在个体化临床治疗方案选择中筛选敏感药物；以及预测患者预后20。此外，PDX 模型的建立过程相对简单，无需特殊设备。

本研究成功利用人骨肉瘤组织建立了PDX小鼠模型。研究揭示了利用人骨肉瘤组织成功建立PDX模型的若干关键因素。首先，人骨肉瘤组织在小鼠体内的可移植性是可行的，这使得可在小鼠系统中研究人骨肉瘤的生物学特性。较高的成瘤率可能归因于使用了免疫缺陷小鼠，其缺乏功能性免疫系统，从而使移植的骨肉瘤细胞能够增殖而不被排斥。此外，本研究证实PDX模型保留了原始人骨肉瘤组织的组织学特征。原发患者肿瘤与PDX肿瘤在肿瘤形态及组织病理学特征方面均相似。这表明PDX模型能够准确地再现骨肉瘤特征，使其成为研究骨肉瘤进展、转移及治疗反应的有力工具。

然而，在进行PDX建模时需要关注几个关键点。首先，用于移植的人类骨肉瘤组织必须为新鲜切除的样本，并应尽快保存于组织保护液中。最好在切除后12小时内完成移植，尽管保存在组织保护液中的人类骨肉瘤组织其肿瘤细胞活性最多可维持24小时16。其次，为最大程度保留患者的分子表型和基因型，建议优先选用未接受过化疗患者的肿瘤组织；尽管接受过一次或两次化疗的患者来源的骨肉瘤组织也可成功移植至免疫缺陷小鼠。此外，若患者接受了多次化疗，肿瘤细胞活性将显著降低，导致移植建模失败；然而，与初诊患者来源的骨肉瘤组织相比，复发患者来源的组织在移植至免疫缺陷小鼠后可能具有更高的成瘤成功率。第三，将骨肉瘤组织移植至皮肤真皮层下方可提高免疫缺陷小鼠中的成瘤率21。

有必要承认本研究的局限性。首先，PDX 模型的建立周期较长，从移植到肿瘤形成需要 4–12 周22。其次，由于移植的是已完全发育的骨肉瘤癌细胞组织，有关肿瘤起始和病因的信息可能缺失，且在移植过程中稀有的亚克隆或基因组改变可能丢失。对 PDX 肿瘤进行全基因组测序，并与患者样本进行比较，将有助于评估该模型的遗传保真度23。第三，小鼠宿主细胞可能浸润肿瘤，从而影响肿瘤细胞的活性9。第四，PDX 模型的失败率约为 50%24,25。最后，在某些情况下，由于肿瘤细胞移植至免疫缺陷小鼠后未发生转移，因而无法研究癌症转移过程26。

综上所述，本研究验证了利用人骨肉瘤组织成功建立PDX小鼠模型的可行性。该模型能够真实再现原始肿瘤的组织病理学特征，为探索骨肉瘤生物学特性及评估潜在治疗手段提供了有价值的工具。未来利用此PDX模型开展的进一步研究将加深我们对骨肉瘤的理解，并有助于为患者开发更有效的治疗策略。

披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本工作获得以下资助：（1）国家自然科学基金（81973877 和 82174408）；（2）上海市高峰高原研究型临床医学中心建设项目（2022ZZ01009）；（3）国家重点领域研发计划&中国国家重点研发计划（2020YFE0201600）；（4）上海市医院中药制剂工业转化协同创新中心；（5）上海中医药大学预算内研究项目（2021LK047）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10% 甲醛中性溶液武汉赛维尔生物科技有限公司G1101-500ml固定组织
高压灭菌器日本Hiryama公司HVE-50手术器械灭菌
CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl上海斯莱克实验动物有限公司/实验动物
游标卡尺烟台绿林工具有限公司034180A测量肿瘤体积
培养皿（60 mm）上海年悦生物科技有限公司430166, Corning移植过程中样品放置
消毒棉球上海宏隆实业有限公司20230627小鼠皮肤消毒
一次性无菌手套桂林恒保健康防护有限公司YT21131无菌操作
双狮辐照啮齿类动物饲料苏州双狮实验动物饲料科技有限公司GB 14924.3动物饲料
电子天平上海年悦生物科技有限公司1-2000称量肿瘤重量
伊红上海亘云生物科技有限公司E4009-25G苏木精-伊红染色
苏木精上海亘云生物科技有限公司H3136-25G苏木精-伊红染色
异氟烷深圳瑞沃德生命科技有限公司VETEASY小鼠麻醉 
独立通气笼具（IVC）小鼠笼苏州猴王动物实验设备科技有限公司HH-MMB-2动物屏障环境
标记笔斑马贸易（深圳）有限公司YYST5标记手术切口
奥林巴斯光学显微镜日本奥林巴斯公司BH20扫描组织切片
眼科软膏上海亘云生物科技有限公司SOICOEYEGRL防止小鼠麻醉期间眼睛干燥
眼科剪上海年悦生物科技有限公司Y00030 JZ剪开皮肤
眼科镊上海年悦生物科技有限公司BS-ZER-S-100 Biosharp移植过程中夹持骨肉瘤组织
石蜡江苏世泰实验器材有限公司80200-0015包埋骨肉瘤组织
石蜡切片机莱卡显微系统（上海）贸易有限公司RM2235骨肉瘤组织切片
生理盐水广州金盛生物科技有限公司605-004057冲洗及临时保存骨肉瘤组织
手术刀片上海医疗器械（集团）有限公司手术器械厂J11010-10# JZ分离骨肉瘤组织及制作手术切口
无菌操作台赛默飞世尔科技（中国）有限公司ECO0.9手术操作台
无菌手术单河南华昱医疗器械有限公司20160090提供无菌手术区域
直型持针器上海亘云生物科技有限公司J31050 JZ缝合伤口
缝合线上海浦东金环医疗用品有限公司F3124缝合伤口
缝合针上海浦东金环医疗用品有限公司F3124缝合伤口
组织保护液南京圣航生物科技有限公司BC-CFM-03维持组织细胞活性
离心管（50 mL）上海百赛生物科技有限公司BLD-BL2002500盛装甲醛固定液

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