使用自动三维神经元重建软件进行树突状脊柱定量

Summary

树突棘是大多数兴奋性突触的突触后隔室。树突状脊柱形态的改变发生在神经发育、衰老、学习以及许多神经和精神疾病的过程中，这强调了可靠的树突状脊柱分析的重要性。该协议描述了使用自动三维神经元重建软件准确且可重复地量化树突棘形态。

Abstract

突触连接允许神经元之间交换和处理信息。兴奋性突触的突触后部位通常形成于树突棘上。树突棘是以突触可塑性、神经发育以及神经和精神疾病为中心的研究中非常有趣的结构。树突棘在其生命周期中会发生结构修饰，其特性（如脊柱总数、树突棘大小和形态学定义的亚型）会随着不同的过程而变化。描述调节树突棘这些结构改变的分子机制依赖于形态学测量。这需要准确且可重复的树突棘分析来提供实验证据。本研究概述了使用 Neurolucida 360（自动三维神经元重建软件）进行树突棘定量和分类的详细方案。该协议允许确定关键的树突状脊柱特性，例如总脊柱密度、脊柱头部体积和脊柱亚型的分类，从而能够有效分析树突状脊柱结构表型。

Introduction

树突棘是树突的突起，通常包括谷氨酸能突触的突触后部位 ^1,2。树突棘在突触可塑性领域特别有趣。当突触强度发生变化时，棘通常会发生变化，在长期突触增强时变得更大更强，在长期突触抑制中变得更小更弱 3,4,5,6,7。除了突触可塑性之外，树突棘的轮廓在整个生命周期中都会发生变化。在早期发育中，有一段树突状脊柱形成和生长的时期，然后是树突状脊柱修剪，直到达到稳定状态 ^8,9,10。在衰老的大脑中，脊柱缺失伴随着大脑萎缩和认知能力下降¹¹。此外，许多神经、神经退行性和精神疾病的特征是异常的树突棘。受精神分裂症影响的个体的多个大脑区域的树突棘较少，可能是由于突触修剪改变所致¹²。自闭症谱系障碍也以树突状脊柱病变为特征¹³。树突状脊柱缺失是阿尔茨海默病和帕金森病的标志^14,15。鉴于研究主题广泛，包括对树突状脊柱特性的研究，准确定量脊柱的技术至关重要。

染色，即高尔基体法，或通过染料填充或表达荧光蛋白标记神经元是树突状脊柱可视化的常用方法 16,17,18。可视化后，可以使用各种免费和市售软件客户端对 spine 进行分析。分析的预期结果是决定哪种软件最有用的重要因素。斐济是解决以树突棘密度为中心的问题的可行软件选项。然而，这种技术在很大程度上依赖于耗时的手动计数，这可能会引入潜在的偏差。SpineJ 等新插件允许自动定量，此外还允许更准确的脊柱颈部分析¹⁹。这些方法的一个缺点是丢失了用于确定脊柱体积的三维分析，因为 SpineJ 仅限于二维图像堆栈。此外，通过这些过程获取脊柱亚型信息变得具有挑战性。四种主要的脊柱亚型，薄、蘑菇、粗短和丝状伪足，都意味着单独的功能，并且主要通过形态学分类²⁰。细刺的特点是细长的脖子和清晰的头部²¹。蘑菇刺有一个更大而明显的刺头²²。粗短的刺很短，头部和颈部之间几乎没有差异²³.丝状伪足是未成熟的棘，脖子细长，没有明显可观察到的头部²⁴。虽然分类提供了有价值的信息，但 spine 存在于维度的连续体上。分类基于形态测量范围^25,26。在这种方法中，手动测量棘以进行分类会加剧研究人员的后勤负担。

其他专门针对三维树突状脊柱分析的软件选项更适合研究脊柱体积和亚型属性 27,28,29,30,31。尽管三维分析存在困难，例如 z 平面分辨率差和拖尾，但这些软件选项允许以用户引导的半自动方式可靠地重建树突和树突棘。将识别出的脊柱自动分类为其亚型也是其中一些脊柱分析软件包中的一个功能。这可以减轻对潜在工作量和实验偏倚的担忧。Neurolucida 360 是一种市售软件，可实现可靠且可重复的三维树突棘识别和分类³²。在这里，我们提出了一个全面的协议，以有效地准备固定组织、获取图像，并最终使用该软件对树突棘进行量化和分类。

Protocol

所有动物程序均遵循美国国立卫生研究院在校内研究中使用动物指南，并得到美国国家心理健康研究所动物护理和使用委员会的批准。

1. 固定海马切片的制备

1. 通过腹膜内注射氯胺酮/甲苯噻嗪（氯胺酮:100 mg/kg;甲苯噻嗪:8 mg/kg）。通过捏尾验证麻醉并将鼠标贴在灌注板上。
2. 使用大型手术剪刀去除胸部的皮肤和毛皮，以便更容易地看到下面的胸腔。
3. 在胸腔宽度以下进行水平切割，避开肝脏和隔膜。使用细镊子，向上拉剑突并切开胸腔的每个外侧。将胸腔向上翻转到颈部区域，并使用止血钳夹住到位。
4. 将 21 G 蝶针插入心脏左心室，开始以大约 5 mL/min 的速度灌注室温 1x PBS。用小手术剪刀在右心房上做一个小切口。用 PBS 灌注，直到离开心房的溶液变清。
5. 关闭灌注泵，确保没有气泡进入管路。将 PBS 中的管路放入冰冷的 4% 多聚甲醛 （PFA） 中的 PBS 中。以 5 mL/min 的速率灌注 PFA，直到动物完全变硬，大约 25 mL。
   注意:确保 PFA 是新鲜的（如果原液储存在 1°C 下，则不超过 4 周）以实现最佳固定。
6. 用小手术剪刀从颅骨表面去除皮肤。用小手术剪刀沿着颅骨的中央裂缝做一个矢状中段的切口。在嗅球和小脑上方进行侧切。
7. 用细镊子打开头骨，露出大脑。用抹刀轻轻地从嗅球中舀出大脑，并放入 4% PFA 的 PBS 中过夜。
   注:有关啮齿动物灌注的更全面方案，请参阅 Gage 等人 ³³。
8. 用 PBS 中的 15% 蔗糖代替 4% PFA 冷冻保护固定脑 1 天。在此之后，用 PBS 溶液中的 30% 蔗糖替换 15% 蔗糖 1 天，直到大脑沉入溶液中。
9. 从蔗糖溶液中取出大脑，并将其放入含有 PBS 的培养皿中。使用手术刀片切掉小脑和嗅球。
10. 在试样夹具座表面放置少量直径为 1-2 cm 的最佳切割温度化合物 （OCT）。将大脑冠状安装到标本架上，尾部切割面在 OCT 中。将标本架放入粉碎的干冰中直至明显冻结，快速冷冻大脑，大约 5-7 分钟。
11. 确保低温恒温器的叶片角度设置在 0° 到 5° 之间，以产生均匀的切片。调整卷板角度以实现最佳切片展平效果。具体说明请参阅设备手册。
12. 将标本架放入低温恒温器中，使大脑的腹面最靠近刀片。将大脑切成 30 μm 的背侧海马切片，丢弃海马体喙部的所有切片。
    注意:协议的这一部分可以适应任何所需的大脑区域选择。步骤 1.9-1.12 将根据感兴趣的区域而变化。
13. 将背侧海马切片转移到 PBS。使用画笔，轻轻地将海马切片安装在显微镜载玻片上。用棉签或精致的任务湿巾去除任何多余的溶液。
14. 将 100 μL 硬固封固剂涂抹在覆盖所有脑切片的显微镜载玻片上。为防止气泡，使用镊子将盖玻片缓慢降低到封固剂上。如果形成气泡，请用镊子轻轻敲击盖玻片，让它们逸出。成像前让载玻片凝固过夜。

2. 高分辨率共聚焦成像

1. 使用低放大倍率目镜识别荧光细胞。切换到 63x （NA = 1.4） 或更高的物镜，在物镜上涂抹适当的浸没介质。
   注:为获得最佳结果，请使用具有 63 倍或更高物镜的激光扫描共聚焦显微镜。
2. 识别标记良好的树突节段，重叠有限，用于图像采集。设置激光功率和增益以确保荧光树突不饱和。此外，降低扫描速度可以提供更好的图像分辨率。
3. 获取包含完整树枝状段的 z 堆栈，以供将来分析。大于 10 μm 的 Z 堆栈是不可取的，因为 z 平面中树突重叠的可能性会增加。
   注:使用可用的最小 z 步长 （0.2-0.7 μm） 和 1 个通风单元针孔尺寸。较小的步长会导致 z 堆栈中的图像更多，从而补偿许多显微镜有限的 Z 分辨率。
4. 可选:如果可用，请利用显微镜的相应反卷积软件功能对图像进行反卷积。这将允许更高分辨率的图像。

3. 树突棘定量

1. 打开 Neurolucida 360（v2022.1.1 或更高版本）。在脊柱分析软件中打开图像文件 （File > Open > Image）。确保图像文件在主窗口和 3D 环境中可见。如果 3D 环境 窗口未出现，请在 Trace 选项卡的主窗口顶部工具栏中的 3D Environment 上单击鼠标左键（补充图 1）
   注意:该协议的这一部分可以适用于任何树突状图像，而不仅仅是来自小鼠组织的树突。
2. 在 3D Environment （3D 环境） 窗口的 Change Image Display （更改图像显示） 选项卡中，确保图像在 Display Image As （显示图像为） 框中显示为 3D 体积。在 Image 选项卡的 Image Stack Settings 框中，选择 Max Projection 在 Show Surface As 下拉菜单中。（补充图 2）
3. 确定适合追踪的树突段。
   1. 左键单击 3D Environment （3D 环境） 窗口顶部工具栏中的 Move Pivot Point （移动枢轴点） 工具。左键单击所需的树突以设置新的枢轴点。这将更改方向以启用有效的放大。
   2. 通过左键单击 Reset Orientation 图标重新建立原始方向。设置轴心点后，左键单击 Move Pivot Point 工具开始描摹树突。（补充图 2）。
      注意:理想的枝晶是与任何坐标平面中的其他枝晶重叠有限且不与另一个枝晶相交或与下面的另一个枝晶表面相交的枝晶。在 XY 平面中与其他树突较近的树突也更可取，以防止将相邻的树突不恰当地分配给被追踪的树突。还必须注意的是，不同厚度、顺序和与胞体距离的树突具有不同的树突棘密度^34,35。这需要在实验设计中加以考虑。厚度为 <1.5 μm 的二级树突是示踪的理想选择（图 1）。
4. 左键单击 3D Environment 窗口的 Tree 选项卡。左键点击 User-Guided 作为追踪模式，左键点击 Directional Kernels 作为 User-Guided Tracing Options 中的方法。
5. 当出现圆形内核时，左键单击树突以开始跟踪。沿树突段移动光标。这将自动填充内核。如果内核没有自动填充，请参阅步骤 3.51。
   1. 在树突上轻轻地来回移动光标，直到填充内核。左键单击可保留检测到的现有内核。如果内核停止填充，则当内核在树突的进一步下方填充时，单击鼠标左键以手动放置一个内核。右键单击以结束跟踪。确保追踪的枝晶长度至少为 7 μm（补充图 3）。
6. 通过左键单击并拖动 3D 环境 窗口，使用 3D 环境的所有三个方向（俯仰、偏航和滚动）验证树枝状追踪的准确性。确定树枝状描摹位于树突上适当位置之外的点。在某些情况下，它看起来从上到下都是准确的，但在 z 维度中，这些点不在树枝晶上（图 2）。
7. 要更正未正确跟踪的树突段，请左键单击 Tree （树） 菜单中的 Edit （编辑） 选项卡。左键单击感兴趣的树突，然后左键单击 Points。
8. 通过单击和拖动将放置不当的点移回树枝线段上。通过左键单击点并单击 Delete 按钮来删除无关的点。如果树枝突未充分填充，请更改点的大小。要更改点的大小，请左键单击一个点并调整厚度滑块以更改大小（补充图 4）。
   注意:填充不足的树突会导致识别作为树突节段组成部分的假刺。相反，过度填充的树突会掩盖真正的书刺。
9. 在继续进行步骤 3.10 中的书脊识别之前，对图像中的多个树突重复步骤 3.3-3.8。
10. 左键单击 3D Environment （3D 环境） 窗口中的 Spine （主干） 选项卡。设置 Outer Range、Minimum Height 和 Minimum Voxel Count 的检测设置。根据准备工作的不同，在有明确和具体的更改理由的情况下，可能需要更改预设值。预设条件为"外部范围":2.5 μm，"最小高度":0.3 μm，"最小体素数":10 个体素。
    注:不同的准备工作，例如细胞培养物与急性组织，以及不同的发育时间点将需要不同的标准，这些标准必须从现有文献中得出。同样重要的是要注意，更改检测设置可能会显著改变结果。例如，较高的最小高度可以排除短刺。检测设置必须在整个实验过程中保持一致。
11. 将 Detector Sensitivity 设置为 70%，然后左键单击 Detect All。这将填充所有树突上由此检测器灵敏度识别的棘。如果需要以树突特定的方式选择树突，请左键单击单击 图像以检测最近分支上的所有树突框， 然后左键单击具有不同检测器灵敏度的每个树突。
    注意:在这个阶段，并非所有树突棘都会填充是正常的。同样，非 spine 可能会不正确地填充。最初的 70% 灵敏度也很灵活;这可能会根据准备情况而改变。
12. 通过在所有三个方向上单击并拖动树突来检查此检测器灵敏度选择的刺。如果检测到的大多数骨架未完全填充，请继续执行步骤 3.12.1。如果检测到的书脊已过度填充，请继续执行步骤 3.12.2。如果检测到的棘似乎已充分填充，请继续执行步骤 3.13。
    1. 将 Detector Sensitivity 提高 5%-10%，然后再次左键单击 Detect All 。这将以更高的灵敏度将以前检测到的所有棘替换为新棘。根据需要重复，直到检测到的棘被充分填充。
    2. 将 Detector Sensitivity 降低 5%-10%，然后再次左键单击 Detect All （全部检测 ）。这将用较低敏感度的新棘替换以前检测到的所有棘。根据需要重复，直到检测到的棘被充分填充。
13. 在 3D 环境的 Spine 选项卡中单击左键单击 Keep Existing Spines。如果已选择 Click Image to Detect All on Nearest Branch，请取消选择它。
    注意:通过选中 Keep Existing Spines（保留现有刺）， 可以确保手动新识别的树突刺不会覆盖以前识别的刺。确保在继续之前选中此框，以免覆盖以前的工作。
14. 左键单击 Move Pivot Point 并左键单击需要进一步检测树脊以设置枢轴点的树突。
    1. 取消选择 Move Pivot Point （移动枢轴点）。识别未填充的树突棘。将 探测器灵敏度 提高 10%-20%，然后左键单击脊柱。如果检测到的书脊填充不足或填充过多，请继续执行步骤 3.14.3 或 3.14.4。如果主干未填充，则会显示消息 Unable to detect a spine at the selected location 。在这种情况下，请继续执行步骤 3.14.2。
    2. 逐渐增加 检测器灵敏度 ，可能超过 100%，直到检测到书脊并充分填充。如果检测到脊柱但填充不足，请继续执行步骤 3.14.3。如果书脊填满，请继续执行步骤 3.14.4（图 3）。
    3. 左键单击 Edit 选项卡，然后左键单击填充不足的书脊。左键单击 Remove （删除）。取消选择 Edit 选项卡。将灵敏度提高 5%-10%，然后左键单击脊柱。如果书脊仍然填充不足，请重复此步骤。
    4. 左键单击 Edit 选项卡，然后左键单击过度填充的书脊。左键单击 Remove （删除）。取消选择 Edit 选项卡。将灵敏度降低 5%-10%，然后单击书脊。如果书脊仍然填满，请重复此步骤。
15. 重复步骤 3.14-3.14.4，直到检测到通过视觉识别识别的所有棘。仔细检查树突中是否存在属于相邻树突的任何刺、对应于无真实信号的假刺或可能被错误标记为刺的树突段。使用 Remove 功能删除这些假主刺。
16. 检查树突上已识别的棘。在某些情况下，多个 spine 可能显示为一个砾岩 spine。如果一个书脊似乎包含两个，请左键单击 Edit 选项卡。左键单击书脊，然后左键单击 Hide Selection。确认企业主干后，在 Edit （编辑 ） 选项卡中，左键单击 Show Selection （显示选择 ） 并选择 Split （拆分）。如果一个砾岩中有两个以上的棘，则可能需要重复此步骤（图 4）。
    注意:如果砾岩主干在步骤 3.16 后没有分裂，请删除主干 。然后以较低的灵敏度选择砾岩中更强烈的脊柱。一旦填充了更强烈的棘，就提高灵敏度以选择另一个未填充的棘。或者，删除 conglomerate spine 然后提高灵敏度可能允许正确拆分。
17. 在检测并适当填充所有视觉上可识别的棘后，在 Spine 选项卡中，左键单击 Classify All 将棘分为四个子类型:薄、蘑菇、短和丝状伪足（图 5）。
    注意:Spine 分类参数可以在 Spine 选项卡的 Classification 框的 Settings 窗口中更改。与检测器设置一样，强烈建议更改现有参数的明确理由。预设值为头颈比:1.1，长头比:2.5，蘑菇头大小:0.35 μm，丝足长度 - 3 μm。
18. 在 3D Environment （3D 环境） 窗口的顶部工具栏中，选择 Save and View in Neurolucida Explorer（在 Neurolucida 资源管理器中保存并查看）。Neurolucida Explorer 是从追踪中收集数据的地方。该作品将保存为包含所有描摹和骨架的 .dat 文件。
19. 在 Explorer 窗口的 View 选项卡中，左键单击 Select All 以突出显示所有树突和骨架。
20. 左键单击上方工具栏中的 Analyze 选项卡。左键单击 Structure 下拉菜单。左键单击 Branched Structure Analysis。
21. 根据感兴趣的变量，可以选择任何分析。对于以 spine density 和 average spine volume（平均书脊体积）为中心的问题，最有用的两个方法是 Each Tree > Each Dendrite 和 Spines > Spines Details（ 每个树 树突详细信息）。选择 "确定"，数据将显示在两个单独的窗口中。
22. 将数据复制到电子表格中，以便进一步编译和分析。
    注意:单个树将由树突分隔，但 spine 体积不会。使用电子表格中的 sort 功能，可以按特征过滤 spine 详细信息。

Results

有效利用这种分析方法从选择树突段进行追踪开始。如图 1 所示，用于描摹的理想树突并不靠近其他树突。并行运行的树突可能会导致无法正确识别来自相邻树突的书脊。树突在不同的 z 平面中直接相交或垂直延伸，也大大增加了准确的树枝状追踪的难度。注意枝晶厚度的差异也很重要。如前所述，不同厚度的树突的脊柱密度存在关键差异³⁶。随着距分支点³⁷ 的距离增加，同一枝晶中也可能存在差异。描摹相同顺序和厚度的树突，理想情况下具有相似的分支点原点，可以控制树突棘密度的现有异质性。在某些制剂中确定分支点可能被证明是不可行的，但枝晶的厚度应始终是枝晶示踪的可控因素。树突节段的准确追踪对于从该分析中获得准确的结果至关重要。有必要确保追踪的枝晶的所有点都真正位于树突内。从不同方向观察三维枝晶可以帮助完成此过程。如图 2A、B 所示，自上而下的视图显示了似乎是正确追踪的树突。在侧视图中;但是，许多点并不位于枝晶本身上。 这些问题在图 2C 的侧视图中不存在。确保在追踪过程中正确填充树突也很重要。填充不足的树突可能会导致树突碎片被错误地识别为刺。由于最小高度阈值，过度填充的树突可能会阻止识别真正的书刺。这种对用户引导的追踪的手动评估对于实现准确的树突棘分析至关重要。

树突棘的识别也需要用户指导的方法。使用"Detect All"功能设置均匀检测器灵敏度阈值是不够的，原因有很多。使用"Detect All"功能对于识别最明显的刺很有用，但必须检查这些刺的填充以进行验证。具有初始 "Detect All" 的已识别主刺可能填充不足。为了纠正这个问题，必须单独删除识别出的脊柱，然后以更高的检测器灵敏度手动重新识别（图 3A-C）。这确保了脊柱被充分填满。必须手动考虑的棘所需的检测器灵敏度存在很大异质性。提高检测器的灵敏度以检测所有刺可能会导致刺过度填充，这也需要手动校正（图 3D）。探测器灵敏度不当的另一个问题是不恰当地创建了一个砾岩棘，一个充满的树突棘包含多个棘。彼此靠近的两个脊柱可能会被错误地合并为一个砾岩脊柱（图 4A、B）。脊柱检测软件具有"拆分"功能，可用于分离因过量填充而合并的脊柱。"拆分"功能允许从砾岩脊柱中轻松生成单个棘（图 4C）。准确的树突描摹和树突棘填充可以准确分类为脊柱亚型。脊柱分类依赖于填充棘的形态和与树突的距离，因此过程中的每一步都在形态学分类中发挥作用（图 5）。

由于需要手动选择和阈值，因此所有分析都必须遵循统一的标准。如果多个用户参与数据分析，则这一点尤其相关。为确保所有执行分析的研究人员都遵循相同的标准，研究人员应比较来自相同追踪树突的数据。这可以通过确保每个研究人员都以盲法方式根据共享的、统一的标准来识别脊柱，从而减少实验者偏见的可能性。由于疲劳，单个研究人员也可能在几天之间甚至同一天出现偏倚。这应该在整个数据分析过程中进行监控。为了进一步确保分析的有效性，将初始结果与文献中发表的结果进行比较可确保有效遵循方案。需要注意的是，这种比较只有在准备和参数共享的情况下才会有效。染色、荧光信号采集、树突的顺序和厚度或大脑区域的差异会导致不同的结果 ^8,36。在缺少已发表结果的情况下，使用多名研究人员来验证脊柱识别可以提高分析可靠性和可重复性的信心。本手稿中包括一个补充分析文件夹。该文件夹包含树突段、追踪树突、具有识别和分类棘的追踪树突样本图像文件，以及数据输出（补充表 1、补充文件 1、补充文件 2、补充文件 3 和补充文件 4）。新用户可以使用此数据集进行训练，以练习本文中描述的过程。用户生成的结果在所提供样本数据集的 10% 以内，被认为可以复制分析标准。由于完全填充的脊柱的潜在主观标准以及需要手动检查自动检测到的脊柱，研究人员之间和研究人员内部的差异是分析的正常部分。生成的结果是否超过该阈值;但是，应进行并排比较以确定不同脊柱体积的实例以及包含或排除不当的脊柱。然后，可以重新分析示例数据集，直到达到可接受的阈值。

图 1:选择用于树突棘分析的 树突。（A） 从 THY1-YFP 转基因小鼠系中 CA1 近端树突拍摄的 z 堆栈共聚焦图像的 3D 体积显示。请注意枝晶顺序的异质性，蓝色椭圆形中初级枝晶较厚，粉红色椭圆形中初级枝晶较细，次级和第三级枝晶较细。（B） 枝晶示踪的理想候选者用绿色椭圆表示。请注意厚度和有限的交集、重叠以及与其他树突的接近程度。红色椭圆表示树突追踪应避免的树突段，因为树突追踪需要避免，因为交集、重叠和靠近其他树突。较厚的初级树突也不是适合描摹的候选者。比例尺 = 25 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

图 2:准确追踪树突节段。 （A） 从 THY1-YFP 转基因小鼠系中的 CA1 近端树突拍摄的 z 堆栈共聚焦图像的 3D 体积显示，通过用户引导的定向内核方法进行追踪。比例尺 = 10 μm。（B） 树枝突描摹不佳的例子。树突似乎在自上而下的视图中被正确跟踪。侧视图显示树突未正确填充偏离树突的点。（C） 适当的枝晶描摹示例。自上而下的视图看起来与 B 相似，但侧视图却大不相同。C 中的枝晶被正确追踪，如完全填充且与树突没有偏差所示。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:使用手动选择准确填充树突棘。 （A） 从等待手动检测的脊柱的 THY1-YFP 转基因小鼠系中的 CA1 近端树突拍摄的 z 堆栈共聚焦图像的 3D 体积显示。比例尺 = 0.5 μm。（B） 树突棘填充不足的示例。由于填充不完全，仍然可以看到大量的荧光信号。（C） 正确填充的树突棘示例。在填充物外部几乎看不到的信号"电晕"是准确填充树突棘的标准。（D） 树突棘过度填充的示例。检测器灵敏度过高，导致书脊过度填充。填充物已经越过了荧光的边界，并且具有几乎难以察觉的电晕。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4:分裂砾岩树突棘。 （A） 从 THY1-YFP 转基因小鼠系中的 CA1 近端树突拍摄的 z 堆栈共聚焦图像的 3D 体积显示，其中两个棘非常靠近。比例尺 = 0.15 μm。（B） 两个独立棘被错误填充为一个砾岩树突棘的示例。（C） 使用"分裂"功能后，砾岩棘被分裂成两个不同的正确填充的树突棘。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5:树突棘鉴定和亚型分类。 （A） 从 THY1-YFP 转基因小鼠系中 CA1 近端树突拍摄的 z 堆栈共聚焦图像的 3D 体积显示，该图像分离用于树突棘定量和分类的追踪树突节段。比例尺 = 5 μm。（B） 追踪的树突段，识别并检查所有树突棘，以确保正确填充和分裂。在此步骤中，软件会任意地为已识别的骨架指定颜色。（C） 使用软件中定义的参数将所有已识别的树突棘分类为亚型。蓝色 = 蘑菇，黄色 = 薄，绿色 = 粗短。由于该组织的年龄，不存在丝状伪足。（D） 未填充（顶部）和填充（底部）的蘑菇色、细刺和短刺的代表性图像。比例尺 = 0.3 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

补充图 1:访问 3D 环境。 在软件界面中查看共聚焦图像的 Z 轴堆栈。主查看器中 Trace 选项卡的 3D 环境导航已以黄色突出显示。 请点击此处下载此文件。

补充图 2:3D 环境的图像参数和方向设置。用于共聚焦 z 堆栈图像的 3D 环境查看器。高亮显示的 Change Image Display 选项卡中的参数（由黄色箭头表示）设置为 Display Image As: 3D Volume 和 Show Surface As: Max Projection。Move Pivot Point 和 Reset Orientation 由黄色箭头标识。请点击此处下载此文件。

补充图 3:树突线段追踪。 （A） 用于树突示踪的 z 堆栈共聚焦图像的 3D 体积。在 tree 选项卡、user-guided 和 directional 内核全部选中后，跟踪首先通过左键单击将初始内核放置在树突上。（B） 光标移动后定向内核沿树突向下传播。（C） 在树突上进一步单击鼠标左键可填充定向内核。（D） 定向内核未填充树突的示例。相反，一个孤核存在于该段的更下方。（E） 左键单击孤核可填充两点之间的枝晶。右键单击可结束跟踪。 请点击此处下载此文件。

补充图 4:追踪树突中的调整点。 （A） 追踪的树晶段等待点调整。树枝状编辑需要选择"树"选项卡和"编辑"选项卡。两者都以黄色突出显示。已选择 Dendrite 进行编辑，单击鼠标左键。（B） 选择以黄色突出显示的点选项卡，可以选择枝晶段上的单个点。绿点的厚度为 1.2 μm。（C） 调整点以更准确地填充枝晶。绿点的新厚度值为 0.6 μm。 请单击此处下载此文件。

补充表 1:示例图像分析结果。请点击此处下载此文件。

补充文件 1:带有树突和spines.dat的示例图像描摹 请单击此处下载此文件。

补充文件 2:使用 dendrites.dat 进行样本追踪 请单击此处下载此文件。

补充文件 3:样本树突图像 file.czi 请单击此处下载此文件。

补充文件 4:树突图像样本 file.jpx 请单击此处下载此文件。

Discussion

该协议详细介绍了样品制备、成像以及使用三维重建软件对树突棘进行定量和分类的过程的具体步骤。该软件是一个强大的工具，能够生成强大的结构数据，有助于各种研究。在整个过程中，有一些关键步骤可以减轻该协议的方法负担并提高数据的整体输出。标记树突棘的方法是研究人员在开始该协议之前首先应该考虑的事情之一。标记方法不足可能会导致脊柱定量问题。对在脊柱中低水平表达的某些蛋白质进行染色会导致信号对于软件来说太低。还必须注意的是，追踪最亮的荧光树突可能会引入偏差。虽然目前尚不清楚不同的荧光树突是否具有不同的生理特性，但这仍然是要考虑的方案的限制。此外，在一些转基因品系中，例如 THY1-YFP-H 品系，树突棘中的荧光直到 P21 左右才出现。这使得这条线不适合研究年轻的发育时间点。考虑用于标记刺以用于研究途径的方法并不是一个微不足道的方面，因为没有足够的荧光，该软件的可用性就会降低。同样，需要考虑图像采集硬件。事实证明，有些文件类型与其他文件类型的兼容性较差。具体来说，ND2 文件已被确定为有效使用该软件的问题文件类型。软件提供商建议在出现问题时转换为 JPEG2000 等文件类型。

组织制备和图像采集也是高质量脊柱定量的重要步骤。组织的正确固定、切片和封片可确保样品持久，并且可能干扰数据分析的伪影最少。组织成像也不仅仅是拍摄整个脑切片的 z 堆栈图像的问题。在成像过程中，目的应始终是获取包含树突的堆栈以进行脊柱定量。应重点获取包含易于追踪的树突的 z 堆栈。较厚的 z 堆栈通常会导致更多的背景树突。这使得使用软件有效追踪树突变得更加困难。在成像过程中花额外的时间来寻找更好的追踪候选者将在脊柱定量分析期间节省更多时间。此外，请确保 z 堆栈图像包含要描摹的整个树突。如果树突在 z 堆栈中只能部分查看，则由于 3D 渲染不完整，枝晶追踪和骨架识别将被证明是困难和不准确的。

追踪树突和获得已识别树突棘的准确轮廓的过程可能是一个艰巨的过程。它有一定程度的细微差别。在枝晶追踪期间，用户引导的功能有时无法按预期运行。有时，定向内核不会填充到某个 segment 上，也不会开始填充到不需要的 segment 上。规避这种情况的一种方法是从较小的典型工艺宽度开始。这使得树枝突在软件中更容易检测到，从而更容易追踪。如果 directional 内核无法完全填充，左键单击树突将手动放置一个。它会到达一个非常小的点，不会填充树突，但可以按照协议的步骤 3.8 所述通过厚度调整来纠正。虽然如果软件证明不足，可以手动追踪树突，但手动追踪树突并不是软件的一项功能。在某些情况下，可以看到清晰的脊柱，但无论探测器的灵敏度有多高，软件都无法检测到它。要检查的一件事是可疑的脊柱是否超出范围。如果它在范围内但仍未被软件识别，则此 spine 将被排除在分析之外。虽然这种情况可能很少发生，但这是一个需要考虑的限制。与任何需要阈值和手动分类组件的分析一样，有可能引入偏倚。在比较多个用户生成的数据时，此问题可能会进一步复杂化。这种分析的半自动性质旨在最大限度地减少这种偏差的引入，但并未完全消除。在我们的实验室中，研究人员在标准数据集上 10% 的差异是合理的，并且需要足够的实践和培训。虽然已经努力最大限度地减少偏倚，但在评估通过该协议生成的数据时考虑研究人员间偏倚仍然很重要。

考虑到该软件的小缺点，使用这种技术进行树突状棘分析的输出非常可靠。如前所述，可以从准确的树突节段追踪和脊柱识别中推断出无数指标。获取 spine 亚型信息的能力提供了比基本指标更深层次的有价值的见解。由于结构和功能之间的互连性，这些数据非常重要。每个 spine 亚型都表示一个功能。细棘是经历大量周转的主要亚型²¹。细刺也有可能发育成蘑菇刺³⁸。这与蘑菇刺与学习和记忆密切相关一致^38,39。粗短的刺也被认为是学习的一个组成部分，可能是蘑菇刺的残余物⁴⁰。丝状伪足虽然在许多成人组织中并不普遍，但却是发育中的关键脊柱前体^41,42。3D 电子显微镜仍然是对脊柱亚型进行最准确分类的金标准。虽然这项技术很有价值，但受到繁重的手动排序和分类的限制，容易出现人为错误。此分析的半自动设计减少了可能引入主观偏差的情况。虽然在该协议中进行完美分类所需的绝对分辨率和荧光强度方面可能存在缺点，但它仍然为 3D 电子显微镜和手动分类提供了一种方法学上负担较轻的替代方案。此外，使用本研究中概述的分析，可以对来自更广泛脑区样本的多个树突分支进行完整的树突分析。电子显微镜并非如此。通过使用该协议，可以以可靠和可重复的方式解决多个学科中以结构为中心的问题，包括但不限于突触可塑性、发育以及神经和精神疾病。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
518F 浸油	蔡司	444960-0000-000
低温恒温器	徕卡	CM3050S	用于切片制备
细镊子	FST	11150-10
止血钳	FST	13020-12
大手术剪刀	FST	14002-16
LSM 880 共聚焦显微镜	蔡司	LSM 880
显微镜盖板 Fisherbrand		12-541-035
微型蠕动泵 II	哈佛仪器	70-2027	用于灌注
Neurolucida 360	MBF Bioscience	v2022.1.1	脊柱分析软件
Neurolucida Explorer	MBF Bioscience	v2022.1.1	脊柱分析软件
OCT 化合物	Sakura Finetek	4583	用于低温恒温器切片
多聚甲醛 （37%）	Fisherbrand	F79-1
Plan-Apochromat 63x/1.40 油 DIC	蔡司	440762-9904-000
手术刀片	FST	10022-00
小型手术剪刀	FST	14060-09
刮刀	FST	10091-12
蔗糖	FIsherbrand	S5-500
Superfrost Plus 微载玻片		Diagger ES4951+
Vectashield HardSet 安装介质	Vector Laboratories	H-1400-10