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方法文章

使用自动三维神经元重建软件进行树突棘定量分析

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DOI：

10.3791/66493

⸱

2024年9月27日

 ,  ,  , 
1Section on Synapse Development Plasticity, National Institute of Mental Health, National Institutes of Health, 2Colgate University

本文内容

摘要

树突棘是大多数兴奋性突触的突触后区室。在神经发育、衰老、学习过程以及许多神经和精神疾病中，树突棘形态会发生改变，这凸显了可靠分析树突棘的重要性。本方案描述了如何使用自动三维神经元重建软件，准确且可重复地量化树突棘形态。

摘要

突触连接实现了神经元之间的信息交换与处理。兴奋性突触的突触后位点通常形成于树突棘上。树突棘是突触可塑性、神经发育以及神经和精神疾病相关研究中的重要结构。树突棘在其生命周期中会发生结构上的改变，其总数量、树突棘大小以及形态学定义的亚型等特性会随着不同生理或病理过程而发生变化。阐明调控树突棘结构变化的分子机制依赖于形态学测量，这就要求进行准确且可重复的树突棘分析，以提供可靠的实验依据。本研究详细介绍了一种利用Neurolucida 360（自动三维神经元重建软件）进行树突棘定量与分类的实验方案。该方案可用于测定树突棘的关键特性，如总密度、棘头体积，并可将树突棘分类为不同亚型，从而实现对树突棘结构表型的有效分析。

引言

树突棘是树突的突起，通常构成谷氨酸能突触的突触后位点1,2。在突触可塑性研究领域，树突棘具有特殊的重要性。当突触强度发生变化时，树突棘常随之改变：在长时程增强（LTP）过程中，树突棘会变大、增强；而在长时程抑制（LTD）过程中，则会变小、减弱3,4,5,6,7。除了突触可塑性之外，树突棘的形态特征在整个生命周期中也会发生变化。在早期发育阶段，存在一个树突棘形成和生长的时期，随后经历树突棘修剪过程，直至达到稳定状态8,9,10。在衰老的大脑中，树突棘的丢失伴随着脑萎缩和认知功能下降11。此外，许多神经系统疾病、神经退行性疾病和精神疾病均表现出异常的树突棘特征。精神分裂症患者多个脑区的树突棘数量减少，这可能源于突触修剪异常12。自闭症谱系障碍也以树突棘病理为特征13。树突棘丢失是阿尔茨海默病和帕金森病的标志性特征14,15。鉴于大量研究课题均涉及树突棘特性的探讨，准确量化树突棘的技术显得尤为重要。

染色技术，即高尔基法，或通过染料填充或表达荧光蛋白来标记神经元，是树突棘可视化常用的手段16,17,18。一旦实现可视化，可使用多种免费或商业软件对树突棘进行分析。分析所期望获得的结果是决定选用何种软件的关键因素。对于以树突棘密度为核心问题的研究，Fiji 是一种可行的软件选择。然而，该方法主要依赖耗时的手动计数，可能引入主观偏差。一些新插件（如 SpineJ）可实现自动量化，并能更准确地分析树突棘颈部19。但这些方法的局限性在于无法进行三维分析以确定树突棘体积，因为 SpineJ 仅适用于二维图像堆栈。此外，通过这些方法获取树突棘亚型信息也较为困难。四种主要的树突棘亚型——细长型（thin）、蘑菇型（mushroom）、短粗型（stubby）和丝状伪足型（filopodia）——各自代表不同的功能，通常依据形态学特征进行分类20。细长型树突棘具有细长的颈部和明确的头部结构21；蘑菇型树突棘的头部更大且更突出22；短粗型树突棘较短，头部与颈部之间差异不明显23；丝状伪足型为未成熟树突棘，具有细长的颈部，且无明显可辨的头部24。尽管分类提供了有价值的信息，但树突棘在形态维度上实际呈连续分布。分类本身基于一系列形态学测量参数的范围界定25,26。在此方法中，手动测量树突棘以进行分类进一步增加了研究人员的操作负担。

其他专门针对三维树突棘分析的软件在研究树突棘体积及其亚型特性方面更为适用27,28,29,30,31。尽管三维分析存在诸如z轴平面分辨率低和图像模糊等困难，这些软件仍可在用户引导下以半自动化方式实现对树突及其树突棘的可靠三维重建。部分此类树突棘分析软件还具备将已识别的树突棘自动分类为不同亚型的功能，有助于减轻工作量负担并减少实验偏倚。Neurolucida 360 是一种可商业获取的软件，能够实现可靠且可重复的三维树突棘识别与分类32。本文中，我们提供了一套全面的实验方案，用于高效地制备固定组织样本、采集图像，并最终利用该软件对树突棘进行定量分析与分类。

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方案

所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院《院内研究中使用动物的指南》，并经国家精神卫生研究所动物护理与使用委员会批准。

1. 固定海马脑片的制备

  1. 通过腹腔注射 Ketamine/Xylazine（Ketamine：100 mg/kg；Xylazine：8 mg/kg）对小鼠进行麻醉。通过夹捏尾部验证麻醉效果，并将小鼠固定在灌注板上。
  2. 使用大型手术剪剪除胸部的皮肤和毛发，以便更清晰地观察下方的肋骨。
  3. 在肋骨下方做一水平切口，避免损伤肝脏和膈肌。用精细镊子提起剑突并剪开肋骨两侧，将肋骨翻向颈部区域，并用止血钳夹住固定。
  4. 将21 G蝶形针插入心脏左心室，开始以约5 mL/min的速度用室温1×PBS进行灌注。用小型手术剪在右心房做一小切口。持续用PBS灌注，直至从心房流出的液体变澄清。
  5. 关闭灌注泵，以防止气泡进入管路。将PBS管路转入盛有冰上预冷的4%多聚甲醛（PFA）PBS溶液的容器中。以5 mL/min的速度用PFA灌注，直至动物全身僵硬，约使用25 mL。
    注意：为获得最佳固定效果，请确保PFA新鲜（若储存于4°C，储存时间不超过1周）。
  6. 用小型手术剪去除颅骨表面的皮肤。沿颅骨中央裂隙用小型手术剪做正中矢状切口。在嗅球前方和小脑上方做横向切口。
  7. 用精细镊子打开颅骨以暴露脑组织。使用刮勺从嗅球处轻轻取出脑组织，并将其置于含4% PFA的PBS溶液中固定过夜。
    注意：如需更全面的小鼠灌注方案，请参见Gage等人的研究33。
  8. 通过将固定后的脑组织从4% PFA PBS溶液转移至15%蔗糖PBS溶液中1天进行冷冻保护。随后，更换为30%蔗糖PBS溶液继续处理1天，直至脑组织完全沉入溶液底部。
  9. 将脑组织从蔗糖溶液中取出，放入盛有PBS的培养皿中。使用刀片切除小脑和嗅球。
  10. 在样品托表面放置少量（直径1–2 cm）最佳切割温度化合物（OCT）。将脑组织冠状面朝下，尾端切面嵌入OCT中。将样品托置于研碎的干冰中快速冷冻，直至肉眼观察完全冻结，约需5–7分钟。
  11. 确保冷冻切片机刀片角度设置在0°至5°之间，以获得均匀切片。调整滚轮板角度以优化切片展平效果。具体操作请参考仪器使用手册。
  12. 将样品托放入冷冻切片机中，使脑组织腹面最接近刀片。将脑组织切成30 µm厚的背侧海马区切片，丢弃海马前方的所有切片。
    注意：本步骤可根据需要调整为任意目标脑区。步骤1.9–1.12将根据所选脑区的不同而相应调整。
  13. 将背侧海马切片转移至PBS中。使用画笔轻轻将海马区切片贴附于载玻片上。用棉签或精细擦拭纸去除多余液体。
  14. 在载玻片上滴加100 µL封片介质，覆盖所有脑切片。为防止产生气泡，使用镊子缓慢将盖玻片放下至封片介质上。若出现气泡，可用镊子轻敲盖玻片使其逸出。封片后静置过夜，再进行成像。

2. 高分辨率共聚焦成像

  1. 使用低倍目镜识别荧光细胞。切换至63倍（NA = 1.4）或更高倍数的物镜，并在物镜上使用适当的浸没介质。
    注意：为获得最佳结果，建议使用配备63倍或更高倍数物镜的激光扫描共聚焦显微镜。
  2. 选择标记清晰且重叠较少的树突节段进行图像采集。调节激光功率和增益，确保荧光树突信号未达到饱和。此外，降低扫描速度可提高图像分辨率。
  3. 采集包含完整树突节段的Z轴层扫图像（z-stacks），以供后续分析。Z轴层扫厚度大于10 µm时应避免，因其会增加Z平面内树突重叠的可能性。
    注意：应使用可设置的最小Z步进尺寸（0.2–0.7 µm）和1艾里单位（airy unit）的针孔尺寸。较小的步进尺寸会增加Z层扫中的图像数量，从而弥补许多显微镜在Z轴分辨率上的局限性。
  4. 可选：若条件允许，可使用显微镜配套的去卷积软件对图像进行去卷积处理，以获得更高分辨率的图像。

3. 树突棘定量分析

  1. 打开 Neurolucida 360（v2022.1.1 或更高版本）。在树突棘分析软件中打开图像文件 (文件 > 打开 > 图像)。确保图像文件在主窗口和 3D 环境中可见。如果3D 环境窗口未出现，请在主窗口顶部工具栏的追踪选项卡中左键单击 3D 环境（补充图 1）
    注意：本实验方案的这一部分可适用于任何树突图像，不仅限于小鼠组织来源的树突。
  2. 在 3D 环境窗口的更改图像显示选项卡中，确保在显示图像为框中将图像显示为3D 体数据。在图像选项卡的图像堆栈设置框中，在表面显示为下拉菜单中选择最大投影（补充图 2）。
  3. 确定一个适合追踪的树突节段。
    1. 在3D 环境窗口的顶部工具栏中左键单击移动枢轴点工具。在目标树突上左键单击以设置新的枢轴点。这将改变视角方向，以便有效放大。
    2. 通过左键单击重置方向图标恢复原始方向。设置枢轴点后，左键单击移动枢轴点工具以开始追踪树突（补充图 2）。
      注意：理想的树突应是在任一坐标平面上与其他树突重叠较少，且不与其他树突相交或位于其上方表层。在 XY 平面上与其他树突距离较远的树突也更理想，以避免将邻近的树突棘错误地归入被追踪的树突。还必须注意，不同粗细、不同级数以及距胞体不同距离的树突具有不同的树突棘密度34,35。实验设计中需考虑这一因素。二级树突，厚度<1.5 µm，是理想的追踪候选（图 1）。
  4. 在3D 环境窗口中左键单击树状结构选项卡。在用户引导追踪选项中，将追踪模式设为用户引导，方法设为方向性核函数。
  5. 当出现圆形核时，在树突上左键单击以开始追踪。沿树突节段移动光标，系统将自动填充核。如果核未自动填充，请参见步骤 3.51。
    1. 在树突上轻轻来回移动光标，直到核被填充。左键单击以保留已检测到的核。如果核停止填充，在树突更远位置出现核时左键单击以手动放置一个核。右键单击以结束追踪。确保被追踪的树突长度至少为 7 µm（补充图 3）。
  6. 通过左键单击并拖动3D 环境窗口，从 3D 环境的俯仰（pitch）、偏航（yaw）和滚转（roll）三个方向验证树突追踪的准确性。识别出树突追踪偏离树突正确位置的点。有时从上方观察时追踪看似准确，但在 z 维度上，这些点并不在树突上（图 2）。
  7. 要校正错误追踪的树突节段，请在树状结构菜单中左键单击编辑选项卡。左键单击目标树突，然后左键单击点。
  8. 通过点击并拖动，将位置不当的点移回树突节段上。通过左键单击点并点击删除按钮来删除多余的点。如果树突未充分填充，请调整点的大小。要调整点的大小，请左键单击一个点并调节粗细滑块以改变其尺寸（补充图 4）。
    注意：树突填充不足可能导致将树突节段的组成部分误识别为假树突棘；相反，过度填充树突可能掩盖真实的树突棘。
  9. 在进行步骤 3.10 的树突棘识别之前，对图像中的多个树突重复执行步骤 3.3–3.8。
  10. 在 3D 环境窗口中左键单击树突棘选项卡。设置外范围、最小高度和最小体素数的检测参数。根据样本制备情况，若存在明确且具体的调整理由，可能需要修改预设值。预设条件为：外范围：2.5 µm，最小高度：0.3 µm，最小体素数：10 个体素。
    注意：不同的样本制备方式（如细胞培养物与急性组织）以及不同的发育时间点，需要依据现有文献确定不同的标准。还必须注意，改变检测参数会显著影响结果。例如，较高的最小高度可能排除较短的树突棘。在整个实验过程中，检测参数必须保持一致。
  11. 将检测器灵敏度设为 70%，然后左键单击全部检测。这将在所有树突上填充由该灵敏度检测到的树突棘。如果希望以树突特异性方式选择树突棘，请左键单击点击图像以在最近分支上全部检测复选框，并使用不同的检测器灵敏度手动依次点击每根树突。
    注意：在此阶段，并非所有树突棘都会被填充是正常现象。同样，非树突棘结构也可能被错误填充。初始的 70% 灵敏度也是可调的；具体数值可能因样本制备情况而异。
  12. 通过在三个方向上点击并拖动树突，检查该检测器灵敏度所选中的树突棘。如果大多数被检测到的树突棘未充分填充，请进入步骤 3.12.1。如果被检测到的树突棘过度填充，请进入步骤 3.12.2。如果被检测到的树突棘填充适当，请进入步骤 3.13。
    1. 将检测器灵敏度提高 5%–10%，然后再次左键单击全部检测。这将用更高灵敏度下的新检测结果替换之前的所有树突棘。根据需要重复此操作，直到检测到的树突棘充分填充。
    2. 将检测器灵敏度降低 5%–10%，然后再次左键单击全部检测。这将用更低灵敏度下的新检测结果替换之前的所有树突棘。根据需要重复此操作，直到检测到的树突棘充分填充。
  13. 在 3D 环境的树突棘选项卡中左键单击保留现有树突棘。如果已选择点击图像以在最近分支上全部检测，请取消选择。
    注意：勾选保留现有树突棘可确保手动新识别的树突棘不会覆盖先前已识别的树突棘。请在继续操作前确保此选项已选中，以免覆盖先前工作成果。
  14. 左键单击移动枢轴点，然后在需要进一步检测树突棘的树突上左键单击以设置枢轴点。
    1. 取消选择移动枢轴点。识别一个未填充的树突棘。将检测器灵敏度比前次检测提高 10%–20%，然后左键单击该树突棘。如果检测到的树突棘填充不足或过度，请进入步骤 3.14.3 或 3.14.4。如果树突棘未被填充，将出现提示信息无法在选定位置检测到树突棘。此时请进入步骤 3.14.2。
    2. 逐步提高检测器灵敏度，必要时可超过 100%，直到树突棘被检测到并充分填充。如果树突棘被检测到但填充不足，请进入步骤 3.14.3。如果树突棘过度填充，请进入步骤 3.14.4（图 3）。
    3. 左键单击编辑选项卡，然后左键单击填充不足的树突棘。左键单击移除。取消选择编辑选项卡。将灵敏度提高 5%–10%，然后左键单击该树突棘。如果树突棘仍填充不足，请重复此步骤。
    4. 左键单击编辑选项卡，然后左键单击过度填充的树突棘。左键单击移除。取消选择编辑选项卡。将灵敏度降低 5%–10%，然后点击该树突棘。如果树突棘仍过度填充，请重复此步骤。
  15. 重复步骤 3.14–3.14.4，直到所有通过视觉识别的树突棘均被检测到。仔细检查树突，确认是否存在属于邻近树突的树突棘、无真实信号对应的假树突棘，或将树突节段误标为树突棘的情况。使用移除功能删除这些假树突棘。
  16. 检查树突上已识别的树突棘。在某些情况下，多个树突棘可能表现为一个聚集的树突棘。如果某个树突棘看似包含两个结构，请左键单击编辑选项卡。左键单击该树突棘，然后左键单击隐藏选中项。确认为聚集树突棘后，在编辑选项卡中左键单击显示选中项，并选择拆分。如果一个聚集结构中包含两个以上树突棘，可能需要重复此步骤（图 4）。
    注意：如果在步骤 3.16 后聚集树突棘仍未拆分，请先移除该树突棘。然后在较低灵敏度下选择聚集结构中信号更强的树突棘。待该较强树突棘填充后，再提高灵敏度以选择另一个未填充的树突棘。或者，可先删除聚集树突棘，再提高灵敏度，以实现正确拆分。
  17. 当所有视觉上可识别的树突棘均被正确检测并充分填充后，在树突棘选项卡中左键单击全部分类，将树突棘分为四种亚型：细长型（thin）、蘑菇型（mushroom）、短 stubby 型和丝状伪足型（filopodia）（图 5）。
    注意：可在树突棘选项卡的分类框的设置窗口中更改树突棘分类参数。与检测器设置一样，强烈建议在更改现有参数时提供明确的理由。预设值为：头颈比：1.1，长度与头径比：2.5，蘑菇型头部尺寸：0.35 µm，丝状伪足长度：3 µm。
  18. 在 3D 环境窗口的顶部工具栏中，选择保存并在 Neurolucida Explorer 中查看。Neurolucida Explorer 是从追踪结果中提取数据的工具。工作将被保存为包含所有追踪和树突棘信息的 .dat 文件。
  19. 在 Explorer 窗口的视图选项卡中，左键单击全选以高亮显示所有树突和树突棘。
  20. 左键单击顶部工具栏中的分析选项卡。左键单击结构下拉菜单。左键单击分支结构分析。
  21. 根据感兴趣的变量，可选择任意一种分析方式。对于树突棘密度和平均树突棘体积相关问题，最常用的两种分析为每棵树 > 每根树突和树突棘 > 树突棘详情。选择确定后，数据将在两个独立窗口中显示。
  22. 将数据复制到电子表格中，以便进一步汇总和分析。
    注意：单个树状结构将按树突分隔，但树突棘体积不会。利用电子表格中的排序功能，可按特征对树突棘详情进行筛选。

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结果

有效利用该分析方法首先需要选择用于追踪的树突节段。如图1所示，理想的用于追踪的树突应与其他树突无紧密相邻。树突之间平行走行可能导致错误识别邻近树突上的树突棘。此外，在不同z平面内直接交叉或垂直走行的树突也会显著增加树突准确追踪的难度。还需注意树突厚度的差异。如先前报道所述，不同厚度的树突在树突棘密度上存在显著差异36。同一树突距离分支点越远，也可能出现树突棘密度的差异37。追踪相同级数和厚度的树突，理想情况下应具有相似的分支点起源，可有效控制树突棘密度固有的异质性。在某些样本中，识别分支点可能不可行，但树突的厚度应始终作为树突追踪中可控的因素。对树突节段的准确追踪对于获得可靠的分析结果至关重要。必须确保所追踪树突上的所有点确实位于树突内部。从不同方向观察三维树突结构有助于实现这一目标。如图2A、B所示，俯视图中看似正确追踪的树突，在侧视图中却显示出大量点并未位于树突本身上。而在

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讨论

本方案详细阐述了样本制备、成像以及利用三维重建软件进行树突棘定量与分类的具体步骤。该软件是一种强大的工具，能够生成可靠的结构数据，支持多种多样的研究。在整个过程中，存在一些关键步骤，可显著降低本方案的方法学负担，并提升数据的整体产出质量。树突棘标记方法是研究人员在开展本方案前首先需要考虑的问题之一。若标记方法不足，可能导致树突棘定量出现问题。对在树突棘中低水平表达的特定蛋白进行染色时，信号可能过弱，无法被软件有效识别。还需注意，追踪荧光最强的树突可能引入偏差。尽管目前尚不清楚不同荧光强度的树突是否具有不同的生理特性，但这仍是本方案中需要考虑的一个局限性。此外，在某些转基因品系中（例如 THY1-YFP-H 品系），树突棘中的荧光直到约出生后第21天（P21）才出现，因此该品系不适用于对较早发育阶段的研究。针对具体研究方向所采用的树突棘标记方法并非无关紧要，因为若荧光信号不足，软件的可用性将显著降低。同样，图像采集硬件的选择也需要慎重考虑。某些文件格式与分析软件的兼容性较差，特别是 ND2 文件已被证实会影响软件的有效使用。软件供应商建议，若出现此类问题，应将文件转换为 JPEG2000 等格式。

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢Carolyn Smith、Sarah Williams Avram、Ted Usdin以及NIMH SNIR提供的技术支持。我们还感谢科尔盖特大学贝塞斯达生物医学研究小组。本研究由NIMH院内研究计划（1ZIAMH002881，资助给Z.L.）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
518F 浸油Zeiss444960-0000-000
冷冻切片机LeicaCM3050S用于切片制备
精细镊子FST11150-10
止血钳FST13020-12
大型手术剪FST14002-16
LSM 880 共聚焦显微镜ZeissLSM 880
显微镜盖玻片Fisherbrand12-541-035
Mini-Peristaltic Pump IIHarvard Apparatus70-2027用于灌注
Neurolucida 360MBF Biosciencev2022.1.1树突棘分析软件
Neurolucida ExplorerMBF Biosciencev2022.1.1树突棘分析软件
OCT 包埋剂Sakura Finetek4583用于冷冻切片
多聚甲醛（37%）FisherbrandF79-1
Plan-Apochromat 63x/1.40 油镜 DICZeiss440762-9904-000
手术刀片FST10022-00
小型手术剪FST14060-09
刮勺 FST10091-12
蔗糖FIsherbrandS5-500
Superfrost Plus 载玻片DiaggerES4951+
Vectashield HardSet 封片介质Vector LaboratoriesH-1400-10

参考文献

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