小鼠伤口模型的建立与单细胞悬液的制备

摘要

本研究介绍了两种关键的实验技术：构建小鼠伤口模型以评估伤口闭合情况，以及从小鼠皮肤制备单细胞悬液以保持细胞活性。

摘要

急性全层皮肤损伤的处理在临床实践中具有较大挑战性。创面愈合过程涉及多种细胞群体以及复杂的创面微环境，这使得利用传统实验方法评估治疗效果及其相互作用变得困难。单细胞转录组测序技术极大地推动了人们对创面愈合过程中细胞功能与机制的理解。然而，小鼠创面模型构建方法的差异会引入混杂因素，从而影响实验结果。此外，小鼠皮肤组织的解离过程面临显著的技术难题，凸显了获得高质量单细胞悬液以实现准确转录组测序的关键需求。因此，本研究旨在优化小鼠创面模型的构建，以精确评估创面闭合的变化，同时消除可能影响后续测序结果的变量。此外，通过比较酶制剂制备方案与试剂盒方案，对单细胞悬液的制备进行了优化，以平衡成本与效率。

引言

小鼠因其基因序列与人类高度同源、繁殖速度快、成本低且体型易于操作，被广泛认可为研究中常用的动物模型¹。然而，小鼠与人类在皮肤结构上存在差异。小鼠具有一层独特的皮肤膜结构，可促进皮肤收缩，在该物种的伤口愈合过程中起关键作用。相比之下，人类的伤口愈合主要依赖于再上皮化和肉芽组织形成¹。

尽管皮肤结构存在这些物种间的差异，小鼠模型仍然是伤口修复研究中的首选，并且与其他动物模型相比仍具有重要意义^2,3。在使用小鼠皮肤模拟人类伤口愈合过程时，必须仔细考虑多种影响因素，包括选择合适的手术部位、考虑小鼠毛囊周期以及理解皮肤膜收缩的影响^4,5。采取相应的措施对于优化实验条件和提高观察结果的准确性至关重要。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）相比传统RNA测序能够在更精细的水平上对细胞进行测序，因而对样本质量要求更高，且组内差异需尽可能小。为建立稳定的小鼠急性全层皮肤缺损模型，开展了多项优化实验。这些实验结合了文献中已有的方法与创新性手段，以全面评估伤口愈合过程²

方案

所有实验程序均经中国人民解放军总医院第七医学中心伦理委员会批准。实验使用6周龄雄性C57/BL6小鼠。 

1. 小鼠伤口愈合模型

1. 动物分组
   1. 将小鼠随机分配至实验组和对照组（每组6只）。将小鼠饲养于特定病原体阴性（SPF）级动物实验设施中，环境温度维持在23–25 °C，湿度保持在50%–60%，光照周期为12小时明暗循环。
   2. 为小鼠提供自由摄取的标准饲料和经高压灭菌的自来水。
2. 术前准备
   1. 使用固定器或用手牢固地以俯卧位固定小鼠。将已恢复至室温的1%戊巴比妥钠溶液装入注射器，按0.1 mL/20 g体重剂量进行注射。
      注意：1%戊巴比妥钠溶液应避光保存于4 °C环境中。
   2. 用酒精棉签清洁小鼠腹部。以轻微角度将注射器刺入腹腔，注射前回抽以避免误注入膀胱或肠道。等待10分钟。
   3. 待小鼠停止抽搐且对刺激无反应后，于双眼涂抹白凡士林以防止角膜干燥。使用剃毛器修剪背部较长的毛发。
   4. 将脱毛膏涂抹于背部，等待2分钟，然后用湿润纱布轻轻擦拭去除，避免损伤小鼠皮肤。注意脱毛膏不可长时间停留。
   5. 使用碘伏和70%酒精交替擦拭三次，对周围皮肤进行轻柔消毒。
   6. 将皮肤活检打孔器、剪刀、镊子及其他器械进行高压....

结果

探索了多种实验方案的变体。优先选择印模（stamp）方案，因其对伤口愈合过程的干扰最小，并能维持伤口完整性，避免搔抓和缝合等因素的影响。这有助于在后续单细胞测序中避免引入噪声。在小鼠两侧均制造伤口时，由于小鼠皮肤固有的弹性，导致伤口区域出现明显差异。图3A，B）。双侧穿刺使伤口更靠近边缘区域，该区域易受小鼠自身抓挠行为的影响。7周龄及以上的小鼠被认为不适合本研究，因为其中一部分小鼠在约10周时出现背部皮肤不规则变暗的现象^th 术后第几天，表明毛发生长开始（图4A）。这引入了一个不希望存在的额外变量。

使用橡胶环时，无论采用软橡胶还是硬橡胶，由于小鼠频繁活动以及橡胶环黏附性有限，这些环通常在约12小时内从伤口部位脱落或移位。通过缝线固定的橡胶环容易撕裂，需反复缝合以保持稳定。这种重复缝合操作反过来对小鼠造成额外创伤（图4B、C

讨论

该实验方案的成功依赖于几个关键步骤。这些步骤包括通过彻底剃毛和清洁对伤口区域进行精确准备，创建特定大小和深度的标准伤口，以及仔细的伤口后护理以监测感染并给予适当的治疗。这些操作的标准化确保了不同实验条件之间的一致性，从而提高了结果的可靠性和可重复性¹⁰。

我们采用伤口印章标记法进行测序，因为其他方法会引入额外的变量，例如小鼠伤口刮擦和缝线撕裂^2,5。印章模型提高了小鼠伤口初始状态的一致性，为评估伤口愈合提供了标准化的基准，从而减少了在小鼠模型中估算伤口愈合速率时可能产生的误差。此外，印章标记有助于使用ImageJ等软件进行分析。然而，由于该方法不使用敷料覆盖伤口，因此对实验环境的消毒要求更高。如果发生感染，则需要重复实验。

个体小鼠之间的生物学差异可能会引入实验结果的变异性，因此需要更大的样本量以进行可靠的统计分析。该模型可扩展至其他测序技术，例如空间测序，从而进.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
75% 乙醇	Liuhe	JIUJING500ML
C57/BL6J 小鼠	Charles River Laboratories
胶原酶 D + Dispase II	Roche	11088858001
胶原酶 I	Roche	5349907103
胶原酶 IV	Roche	5267439001
棉签	Haishi	MIANQIAN
死细胞去除试剂盒	Miltenyi Biotec	130-090-10
DNase I	Roche	10104159001
gentleMACS 组织解离仪	Miltenyi Biotec	130-093-235
医用尼龙缝线	Jinlong	HM507
多组织解离试剂盒 1	Miltenyi Biotec	130-110-201
穿刺活检针	Integra Miltex
红细胞裂解液	Miltenyi Biotec	130-094-183
手术剪	Jinglu	JIANDAO
白凡士林	Shangyuan	BAIFANSHILIN