本研究介绍了两种关键的实验技术：构建小鼠伤口模型以评估伤口闭合情况，以及从小鼠皮肤制备单细胞悬液以保持细胞活性。
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摘要
摘要
急性全层皮肤损伤的处理在临床实践中具有较大挑战性。创面愈合过程涉及多种细胞群体以及复杂的创面微环境，这使得利用传统实验方法评估治疗效果及其相互作用变得困难。单细胞转录组测序技术极大地推动了人们对创面愈合过程中细胞功能与机制的理解。然而，小鼠创面模型构建方法的差异会引入混杂因素，从而影响实验结果。此外，小鼠皮肤组织的解离过程面临显著的技术难题，凸显了获得高质量单细胞悬液以实现准确转录组测序的关键需求。因此，本研究旨在优化小鼠创面模型的构建，以精确评估创面闭合的变化，同时消除可能影响后续测序结果的变量。此外，通过比较酶制剂制备方案与试剂盒方案，对单细胞悬液的制备进行了优化，以平衡成本与效率。
引言
小鼠因其基因序列与人类高度同源、繁殖速度快、成本低且体型易于操作，被广泛认可为研究中常用的动物模型1。然而，小鼠与人类在皮肤结构上存在差异。小鼠具有一层独特的皮肤膜结构，可促进皮肤收缩，在该物种的伤口愈合过程中起关键作用。相比之下，人类的伤口愈合主要依赖于再上皮化和肉芽组织形成1。
尽管皮肤结构存在这些物种间的差异，小鼠模型仍然是伤口修复研究中的首选，并且与其他动物模型相比仍具有重要意义2,3。在使用小鼠皮肤模拟人类伤口愈合过程时，必须仔细考虑多种影响因素，包括选择合适的手术部位、考虑小鼠毛囊周期以及理解皮肤膜收缩的影响4,5。采取相应的措施对于优化实验条件和提高观察结果的准确性至关重要。
单细胞RNA测序（scRNA-seq）相比传统RNA测序能够在更精细的水平上对细胞进行测序，因而对样本质量要求更高，且组内差异需尽可能小。为建立稳定的小鼠急性全层皮肤缺损模型，开展了多项优化实验。这些实验结合了文献中已有的方法与创新性手段，以全面评估伤口愈合过程2,5。在构建伤口愈合模型时，采用小鼠全层皮肤切除方法，以模拟伤口修复与再生的生理过程，旨在利用scRNA-seq评估不同干预措施可能引起的生物学变化。 在制备单细胞悬液过程中，小鼠皮肤组织的解离面临诸多挑战，包括细胞活力低和细胞聚集率高等问题6。这些问题可能导致仪器堵塞或细胞捕获异常，从而影响数据质量。鉴于单细胞测序成本较高，开展多次预实验至关重要，以确保单细胞悬液的稳定性与可靠性。本研究评估了混合酶解法与组织解离试剂盒法在组织解离中的效果，以确定最优解离方案6,7。本研究为后续深入研究奠定了坚实基础。
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方案
所有实验程序均经中国人民解放军总医院第七医学中心伦理委员会批准。实验使用6周龄雄性C57/BL6小鼠。
1. 小鼠伤口愈合模型
- 动物分组
- 将小鼠随机分配至实验组和对照组（每组6只）。将小鼠饲养于特定病原体阴性（SPF）级动物实验设施中，环境温度维持在23–25 °C，湿度保持在50%–60%，光照周期为12小时明暗循环。
- 为小鼠提供自由摄取的标准饲料和经高压灭菌的自来水。
- 术前准备
- 使用固定器或用手牢固地以俯卧位固定小鼠。将已恢复至室温的1%戊巴比妥钠溶液装入注射器，按0.1 mL/20 g体重剂量进行注射。
注意：1%戊巴比妥钠溶液应避光保存于4 °C环境中。 - 用酒精棉签清洁小鼠腹部。以轻微角度将注射器刺入腹腔，注射前回抽以避免误注入膀胱或肠道。等待10分钟。
- 待小鼠停止抽搐且对刺激无反应后，于双眼涂抹白凡士林以防止角膜干燥。使用剃毛器修剪背部较长的毛发。
- 将脱毛膏涂抹于背部，等待2分钟，然后用湿润纱布轻轻擦拭去除，避免损伤小鼠皮肤。注意脱毛膏不可长时间停留。
- 使用碘伏和70%酒精交替擦拭三次，对周围皮肤进行轻柔消毒。
- 将皮肤活检打孔器、剪刀、镊子及其他器械进行高压灭菌。保持操作区域无菌。后续手术应在洁净的手术布上进行。
- 使用固定器或用手牢固地以俯卧位固定小鼠。将已恢复至室温的1%戊巴比妥钠溶液装入注射器，按0.1 mL/20 g体重剂量进行注射。
- 全层皮肤切除
注意：采用伤口夹板模型评估治疗对伤口愈合的效果。- 使用永久性记号笔，在小鼠背部中央上方标记一个直径为8 mm的圆形区域。
- 用洁净镊子提起背部皮肤，先用精细手术剪进行初步切开。随后用镊子夹住部分已切开的皮肤，沿标记的圆形仔细切除皮肤组织。
- 使用定制的不锈钢环（内径15 mm，外径18 mm），用5-0不可吸收缝线将金属环缝合固定于切口周围，防止切口周围皮肤收缩（图1A）。选用不锈钢材质以避免生锈和变形。
- 在伤口附近皮下注射一次0.1 mL的10%盐酸布托啡诺稀释液，用于缓解术后疼痛。
- 将小鼠放回洁净的独立笼具中，保持俯卧位。在小鼠恢复意识前不得无人看管。
- 每2天观察并拍摄小鼠伤口照片，按照步骤1.2所述麻醉后测量伤口大小。
- 伤口打标以获取活检组织
- 按照步骤1.1和1.2所述进行实验准备。
- 制备定制的小鼠伤口标记印章，圆形直径为8 mm，方形边长为10 mm（图1B）。
- 将小鼠置于俯卧位，用酒精棉签消毒背部皮肤。将印章蘸取印泥后，在小鼠背部中上部进行标记。
- 使用手术剪沿圆形标记小心切除整个背部皮肤层，完全暴露肌肉层。伤口保持开放，不包扎，以避免干扰伤口状态。通过将小鼠置于洁净消毒环境中，并让伤口自然结痂，以维持伤口无菌状态。
- 在伤口附近皮下注射一次0.1 mL的10%盐酸布托啡诺稀释液，用于缓解术后疼痛。
- 将小鼠放回洁净的独立笼具中，保持俯卧位。在小鼠恢复意识前不得无人看管。
- 每2天观察并拍摄小鼠伤口照片，按照步骤1.2所述麻醉后测量伤口大小。
- 按照1.4所述进行治疗干预。
- 治疗干预
- 小鼠恢复意识后4小时，按照步骤1.2.2–1.2.3所述进行麻醉。
- 对治疗组小鼠，在切口周围皮下注射所需治疗物，即100 µg人脐带间充质干细胞来源外泌体（hucMSC-Exo）溶于200 µL PBS中。
- 对对照组小鼠，在切口周围皮下注射200 µL PBS。
- 每两天重复一次步骤1.5.2和1.5.3，持续最多14天。检查注射部位是否有肿胀、发红或感染迹象。
单细胞RNA测序的准备工作
- 组织采集与制备
- 按照步骤 1.2.2–1.2.3 所述进行麻醉。
- 使用洁净镊子提起背部皮肤，去除结痂。在伤口附近剪下约 2 cm2 的皮肤，修剪掉脂肪组织和大血管。
- 用无菌镊子将皮肤活检样本转移至已加入 4 mL 预冷 PBS 的 6 孔板孔中。
- 通过将组织样本依次转移至装有 4 mL PBS 的新孔（6 孔板）中进行 PBS 洗涤，直至无可见血液残留。
- 用手术刀将皮肤切成约 2 mm 大小的组织块，进一步在含 0.04% BSA 的 DPBS 中洗涤，并去除所有碎片。
- 酶解消化（图 2）
- 在无菌锥形管中混合 1 mL 胶原酶 I（10 mg/mL）、1 mL 胶原酶 IV（5 mg/mL）、1 mL 胶原酶 D + 分散酶 II（15 mg/mL）、1 mL DNase I（5 mg/mL）以及 6 mL DPBS，配制消化液。充分混匀各组分以确保溶液均一。
- 将锥形管置于 37 °C 水浴中预热 10 分钟，使消化液达到预设温度。
- 向组织中加入 2.5 mL 消化液，在 37 °C 下消化 70 分钟，每 10 分钟翻转试管一次以充分混匀。
- 用洗涤缓冲液（PBS 中含 0.2% BSA）预先润湿 70 µm 细胞筛。使用 1 mL 宽口移液枪头将反应混合物（包括解离的细胞和残留组织碎片）转移至筛网上。
- 将该混合物通过预先润湿的 70 µm 细胞筛过滤至 15 mL 离心管中。
- 将含有消化后组织的反应混合物在室温下以 300 x g 离心 5 分钟。弃去上清液，保留沉淀（细胞）用于下一步解离。
- 红细胞裂解
- 将红细胞裂解液（10x）用双蒸水按 1:10 比例稀释。在锥形管中按 1:10 比例将细胞用 1x 红细胞裂解液稀释。
- 涡旋混合 5 秒，在室温下孵育 2 分钟，然后以 300 x g 离心 5 分钟。吸除上清液，用等体积的 DPBS 重悬细胞，并置于冰上保存。
- 过滤
- 取出细胞悬液，通过 40 µm 细胞筛过滤至新的锥形管中。
- 用 4.5 mL RPMI（含 10% FCS）冲洗原管 2 次，以确保收集所有残留细胞。
- 将细胞悬液在室温下以 300 x g 离心 5 分钟。
- 弃去上清液，轻弹管底使沉淀松散，用宽口枪头在 50 µL 含 0.04% BSA 的 PBS 中重悬细胞。整个过程保持细胞置于冰上。
- 死细胞去除
- 将死细胞去除试剂盒的 20x 储存缓冲液与无核酸酶水按 1:20 比例混合，获得 1x 结合缓冲液。
- 将样品以 300 x g 离心，弃去上清液，按每 60 mg 皮肤样本加入 10 µL 死细胞去除微珠。
- 室温孵育 15 分钟。加入储存缓冲液至总体积达 500 µL。将样品加载至试剂盒中已准备好的分离柱，并将其连接至解离仪。
- 运行解离仪程序以分离活细胞。程序结束后，将悬液通过 30 µm 滤膜过滤，并用等体积 D-PBS 稀释。
注：若滴速明显减慢，应立即更换分离柱，防止杂质堵塞孔隙影响细胞回收率。 - 使用自动细胞计数仪进行吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）染色及细胞计数。采用以下接受标准：细胞活力 ≥ 85%，细胞聚集率 < 20%，无可见红细胞或细胞碎片。
- 多组织解离试剂盒解离流程（替代方案）
- 将 2.5 mL RPMI 1640、100 µL 酶 D、50 µL 酶 R 和 12.5 µL 酶 A1 混合至 gentle MACS C 管中（使用多组织解离试剂盒组分）。
- 将组织转移至含有酶混合液的 gentle MACS C 管中，并紧密封闭管盖。
- 将管置于 37 °C 水浴中 90 分钟，每 10 分钟轻柔翻转一次，确保组织充分接触解离液。
- 弃去解离液，用 DPBS 洗涤组织。
- 将单细胞悬液依次通过 70 µm 和 40 µm 细胞筛过滤，并在 4 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟。
- 使用红细胞裂解试剂按照步骤 2.3 的相同流程进行红细胞裂解。
- 使用死细胞去除试剂盒按照步骤 2.58 的相同流程去除死细胞。
- 使用自动细胞计数仪进行 AO/PI 染色及细胞计数。采用以下接受标准：细胞活力 ≥ 85%，细胞聚集率 < 20%，无可见红细胞或细胞碎片。
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结果
探索了多种实验方案的变体。优先选择印模（stamp）方案，因其对伤口愈合过程的干扰最小，并能维持伤口完整性，避免搔抓和缝合等因素的影响。这有助于在后续单细胞测序中避免引入噪声。在小鼠两侧均制造伤口时，由于小鼠皮肤固有的弹性，导致伤口区域出现明显差异。图3A，B）。双侧穿刺使伤口更靠近边缘区域，该区域易受小鼠自身抓挠行为的影响。7周龄及以上的小鼠被认为不适合本研究，因为其中一部分小鼠在约10周时出现背部皮肤不规则变暗的现象th 术后第几天，表明毛发生长开始（图4A）。这引入了一个不希望存在的额外变量。
使用橡胶环时，无论采用软橡胶还是硬橡胶，由于小鼠频繁活动以及橡胶环黏附性有限，这些环通常在约12小时内从伤口部位脱落或移位。通过缝线固定的橡胶环容易撕裂，需反复缝合以保持稳定。这种重复缝合操作反过来对小鼠造成额外创伤（图4B、C
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讨论
该实验方案的成功依赖于几个关键步骤。这些步骤包括通过彻底剃毛和清洁对伤口区域进行精确准备，创建特定大小和深度的标准伤口，以及仔细的伤口后护理以监测感染并给予适当的治疗。这些操作的标准化确保了不同实验条件之间的一致性，从而提高了结果的可靠性和可重复性10。
我们采用伤口印章标记法进行测序，因为其他方法会引入额外的变量，例如小鼠伤口刮擦和缝线撕裂2,5。印章模型提高了小鼠伤口初始状态的一致性，为评估伤口愈合提供了标准化的基准，从而减少了在小鼠模型中估算伤口愈合速率时可能产生的误差。此外，印章标记有助于使用ImageJ等软件进行分析。然而，由于该方法不使用敷料覆盖伤口，因此对实验环境的消毒要求更高。如果发生感染，则需要重复实验。
个体小鼠之间的生物学差异可能会引入实验结果的变异性，因此需要更大的样本量以进行可靠的统计分析。该模型可扩展至其他测序技术，例如空间测序，从而进...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由国家自然科学基金（#82373494) 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 75% 乙醇 | Liuhe | JIUJING500ML | |
| C57/BL6J 小鼠 | Charles River Laboratories | ||
| 胶原酶 D + Dispase II | Roche | 11088858001 | |
| 胶原酶 I | Roche | 5349907103 | |
| 胶原酶 IV | Roche | 5267439001 | |
| 棉签 | Haishi | MIANQIAN | |
| 死细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-090-10 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| gentleMACS 组织解离仪 | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| 医用尼龙缝线 | Jinlong | HM507 | |
| 多组织解离试剂盒 1 | Miltenyi Biotec | 130-110-201 | |
| 穿刺活检针 | Integra Miltex | ||
| 红细胞裂解液 | Miltenyi Biotec | 130-094-183 | |
| 手术剪 | Jinglu | JIANDAO | |
| 白凡士林 | Shangyuan | BAIFANSHILIN |
参考文献
- Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. J Dermatol Sci. 90 (1), 3-12 (2018).
- Wu, J., Landén, N. X. Investigation of skin wound healing using a mouse model. Meth Mol Biol. 2154, 239-247 (2020).
- Reinke, J. M., Sorg, H. Wound repair and regeneration. Eur Surg Res. 49 (1), 35-43 (2012).
- Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. J Vis Exp. (75), e50265(2013).
- Ganguli-Indra, G. Protocol for cutaneous wound healing assay in a murine model. Meth Mol Biol. 1210, 151-159 (2014).
- Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Front Cell Dev Biol. 10, 872688(2022).
- Levenberg, S., Ferreira, L. S., Chen-Konak, L., Kraehenbuehl, T. P., Langer, R. Isolation, differentiation and characterization of vascular cells derived from human embryonic stem cells. Nat Protoc. 5 (6), 1115-1126 (2010).
- Dead cell removal kit. , Available from: https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_9ndq9pouph0pvf6lmr5osgv41s?content-disposition=inline (2015).
- Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., Dipietro, L. A., Koh, T. J. The murine excisional wound model: Contraction revisited. Wound Repair Regen. 23 (6), 874-877 (2015).
- Rowland, M. B., Moore, P. E., Bui, C., Correll, R. N. Assessing wound closure in mice using skin-punch biopsy. STAR Protoc. 4 (1), 101989(2023).
- Gao, C., Zhang, M., Chen, L. The comparison of two single-cell sequencing platforms: Bd rhapsody and 10x genomics chromium. Curr Genomics. 21 (8), 602-609 (2020).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Front Cell Dev Biol. 6, 108(2018).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
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重印与许可
