本文提供了一种人食管类器官及其气液界面培养的实验方案。食管类器官的气液界面培养可用于研究细胞因子对食管上皮屏障功能的影响。
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本文内容
摘要
摘要
食管的鳞状上皮直接暴露于外界环境，持续接触外来抗原，包括食物抗原和微生物。维持上皮屏障的完整性对于预防感染以及避免由无害食物来源抗原引发的炎症至关重要。本文提供了从患者活检组织中建立人源食管类器官和气液界面培养体系的简化实验方案，用于在组织稳态和疾病背景下研究食管的上皮结构。这些方案在过去十年中具有重要的科学意义，首次实现了从患者来源的原代细胞中构建出三维、类器官结构以及气液界面培养模型。这些模型能够在保持供体表型和遗传特性的前提下，于三维环境中研究特定细胞因子、生长因子及信号通路在食管上皮中的功能。类器官可通过细胞因子刺激后的转录组和蛋白质组分析，提供有关组织微结构的信息；而气液界面培养体系则可用于通过跨上皮电阻（TEER）或大分子通量测定来评估上皮屏障的完整性。结合使用类器官与气液界面培养体系，是推动食管上皮屏障功能障碍相关研究的有力工具。
引言
食管炎症会破坏上皮屏障的完整性1,2,3,4,5，这在嗜酸性粒细胞性食管炎（EoE）中已有观察，EoE 是一种以 Th2 为主导的食管慢性炎症性疾病6。EoE 首次描述于 20 世纪 90 年代7,8，主要由食物抗原诱发9,10,11,12,13。成人人群中 EoE 最常见的症状是吞咽困难和食物嵌塞14。在儿童中，EoE 通常表现为生长迟滞、拒食、呕吐和腹痛15。全基因组关联研究（GWAS）已鉴定出参与上皮屏障完整性调控的 EoE....
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方案
本研究方案已获得瑞士西北部和中部伦理委员会（EKNZ；项目编号 2019-00273）的批准。所有患者在内镜检查前均签署了书面知情同意书，同意其活检样本用于实验研究。本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。
1. 食管类器官患者来源细胞的分离
注意：培养人食管类器官的培养基成分列表见表1。
- 获取活检组织。
注意：在本研究中，使用工作通道为 2.8 mm 的胃镜，在食管胃十二指肠镜检查过程中用活检钳从同一段食管获取两份活检组织。 - 将活检组织转移至市售的无血清角质形成细胞培养基（KSFM；Ca2+ 0.09 mM，1 ng/mL EGF，50 µg/mL BPE）中。
注意：活检组织可在冰上保存数小时，直至使用。 - 用 1 mL Dispase I（10 U/mL）替换 KSFM 培养基，并在室温下孵育 10 分钟。
- 在室温下以 300 × g 离心 2 分钟。
- 使用 1000 µL 移液器吸取 Dispase 溶液，避免接触活检组织及细胞碎片沉淀。
- 用 1 mL 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）冲洗活检组织。
- 在室温下以 ....
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结果
食管类器官将根据所提供的实验方案，由从患者活检样本中提取的原代细胞生长而成，这一过程可通过倒置明场显微镜观察（图1）。在将分离的细胞接种于基底膜提取物（作为支架）后，上皮干细胞（ASCs）在培养的最初两天内开始以自组织方式形成细胞簇。在倒置明场显微镜下可见，细胞簇的大小和数量在第一周内持续增加（图2）。然而，此时细胞簇尚未形成食管类器官典型的洋葱样多层结构。在培养第9天，类器官呈现出明显的洋葱样多层结构，并在中心区域出现逐渐增大的角化核心（图2A）。类器官培养最多可维持21天26。然而，已有研究表明，类器官在第11至第14天之间达到完全成熟并获得最大尺寸。从第11天起，培养过程主要表现为角化程度不断加深，同时代谢活跃的活细胞数量减少5,26。因此，获取用于实验的类器官的最佳时间取决于所需的研究分化.......
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讨论
所提供的操作步骤可高效地培养患者来源的类器官和气液界面（ALI）培养物。类器官培养方案借鉴了首个报道人类食管类器官生成的已发表方案26，并参考了近期发表的另一项方案32。Sherill 及其同事已描述了ALI模型22。在研究食管疾病（如嗜酸性食管炎EoE5,26）背景下细胞因子及其他介质对食管上皮屏障的影响时，类器官与ALI培养模型可相互补充、协同应用。
类器官培养方案的一个优势在于其培养过程和细胞培养基成分的简便性。与其他大多需要添加多种昂贵补充剂和生长因子的ASC和PSC相关方案24,25,27,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
J.H.N. 获得的瑞士国家科学基金会（SNSF）资助项目 310030_219210 在无任何限制条件下支持了本稿件的发表。图1 的制作得到了 BioRender.com 的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1250 µL Griptip - 滤芯吸头 | Integra | 4445 | |
| 300 µL Griptip - 滤芯吸头 | Integra | 4435 | |
| 70 µM细胞滤筛 | Sarstedt | 83.3945.070 | |
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich（默克） | A4544 | |
| 牛垂体提取物 | Gibco（Thermo Fisher Scientific） | 3700015 | |
| 氯化钙 | Sigma-Aldrich（默克） | 21115 | |
| 用于悬浮培养的细胞培养多孔板 CELLSTAR | Greiner Bio-One | 7.657 185 | |
| Cultrex 基底膜提取物（BME），2 型，Pathclear | R&D Systems（Bio-Techne） | 3532-010-02 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） >99.5% 生物科学级 | 卡尔·罗特 | A994 | |
| Dispase I | 康宁 | 354235 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich（默克） | D4693 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液 （DPBS） | Sigma-Aldrich（默克） | D8537 | |
| EVE全自动细胞计数仪 | NanoEntek | EVE-MC | |
| EVE 细胞计数板 | NanoEntek | EVS-050 | |
| Falcon 5 mL 圆底聚苯乙烯试管，带细胞滤网 snap cap | Falcon | 352235 | |
| 异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖 | Sigma-Aldrich（默克） | FD4 | 平均分子量 3000-5000 |
| Heraeus - Megafuge 40R | 赛默飞世尔科技 | 75004518 | |
| 人重组表皮生长因子 | Gibco（Thermo Fisher Scientific） | 3700015 | |
| 角质形成细胞无血清培养基 | Gibco（Thermo Fisher Scientific） | 17005042 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco（Thermo Fisher Scientific） | 15140122 | |
| 重组人KGF/FGF-7蛋白 | R&D Systems（Bio-Techne） | 251-KG-010/CF | |
| 15 mL 螺口管 | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 单通道 EVOLVE 100-1000 µL | Integra | 3018 | |
| 单通道 EVOLVE 20-200 µL | Integra | 3016 | |
| 1 mL 注射器 | 1134950 | ||
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
| 大豆（Glycine max）胰蛋白酶抑制剂 | Sigma-Aldrich（默克） | T9128 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | SAFC 生物科学（默克） | 59418C | |
| Y27632 二盐酸盐 | Tocris（Bio-Techne） | 1254 |
参考文献
- Wu, L., et al. Filaggrin and tight junction proteins are crucial for IL-13-mediated esophageal barrier dysfunction. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 315 (3), G341-G350 (2018).
- Davis, B. P., et al.
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重印与许可
