本方案描述了一种用于评估25岁以下需要通过卵巢组织冷冻保存来实现生育力保存的患者卵巢储备功能的方法。该方法包括：（1）对皮质样本进行卵巢储备功能的组织学评估，（2）与参考数据集进行比较，以及（3）计算Z评分。
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本文内容
摘要
摘要
女性出生时具有一个不可再生的卵泡储备池，称为卵巢储备。该储备由卵巢中的原始卵泡组成，可能受到多种因素的影响，如遗传性和内分泌疾病、医疗干预措施以及内分泌干扰物。当必须进行具有生殖腺毒性的治疗时，建议实施生育力保存。对于女性而言，首选的生育力保存方法是卵母细胞和胚胎冷冻保存。然而，对于非常年幼且性未成熟的患者，卵巢组织冷冻保存是唯一可行的选择。了解冷冻保存的组织样本中卵泡密度，对于年轻患者的生育力咨询至关重要。本方案展示了使用Z评分评估25岁及以下接受生育力保存的女性和女孩卵巢组织质量的方法，即通过皮质卵泡密度的Z评分作为评估工具。患者样本中的卵泡密度将与Hassan等人建立的年龄标准化参考标准进行比较，以评估其与正常值的可能偏离程度。卵泡密度通过组织学定量测定。具体操作中，取一小块卵巢皮质组织（约2 mm × 2 mm × 2 mm），用Bouin液或甲醛溶液固定，经石蜡包埋后切成4 µm厚的切片，采用苏木精-伊红染色，并使用切片扫描仪进行数字化。皮质中存在的卵泡发育阶段从原始卵泡至初级卵泡不等。在组织学切片上，皮质区域定义为距表面上皮1 mm范围内的区域。卵泡密度采用Schmidt等人提出的修正公式进行计算，并结合参考均值和标准差确定Z评分。Z评分反映实测值相对于参考均值的偏离程度，用于判断卵巢储备是否降低（ 降低定义为Z评分<-1.7）。通过该方法，卵泡密度可作为需要生育力保存的年轻患者卵巢储备状况的一项重要评估指标。
引言
卵巢是一个动态的、具有内分泌活性的器官，由外层皮质和内层髓质组成。卵巢内不均匀分布着卵泡，卵泡包含生殖细胞卵母细胞，其周围被基质颗粒细胞所包围1。所有卵泡在胎儿发育期间即已形成，在妊娠约20周时数量达到峰值，随后呈指数级下降。出生时，皮质中残留100万至200万个原始卵泡，仅有数十万个可存活至青春期2。这一非生长状态的卵泡库，也称为卵巢储备，是影响女性生育力的诸多因素之一。卵巢储备位于皮质内，随着卵泡的生长和成熟逐渐移向髓质。部分研究者认为卵巢储备仅由原始卵泡构成，而另一些研究者则认为其包括所有单层卵泡（即原始卵泡、过渡卵泡和初级卵泡）3,4,5,6。在女性一生中，仅有300至400个卵泡能够成熟并最终排卵。当卵泡数量下降至约一千个时，即进入绝经期，通常发生在50岁左右2,7。目前关于成年女性卵巢中是否存在卵原干细胞（OSCs）仍存在持续争议，这类细胞据称在异种移植后可形成卵母细胞。一些研究提示可分离出表达原始生殖细胞基因谱系并能分化为卵母细胞的细胞
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方案
所有实验程序均获得瑞典伦理审查局（Sveafertil 患者，Dnr: 2019-03802）和赫尔辛基大学医院伦理委员会（HCH 患者，Dnr 340/13/03/03/2015）的批准。研究护士向受试者提供书面和口头研究信息，并根据《赫尔辛基宣言》的要求获取知情同意。对于18岁以下的患者，由其法定监护人签署知情同意书。所有样本均进行假名化处理，并依照《欧盟通用数据保护条例》（GDPR）进行处理。本研究中所用试剂与设备的详细信息列于 材料表.
1. 卵巢组织的采集与处理
注意：当根据当地指南（例如北欧、欧洲或国际特定指南）判断患者存在高或极高不孕风险时，应识别所有符合生育力保存条件的患者。在欧洲，仅可将未成年患者纳入生育力保存研究项目进行招募。应依据本国生育力保存指南评估不孕风险。
- 在全身麻醉下进行手术操作。麻醉诱导时给予静脉注射丙泊酚（2 mg/kg）、舒芬太尼（0.5 μg/kg）和罗库溴铵（0.6 mg/kg）。
- 插管并以潮气量 6–8 mL/kg 和 6–8 cm H₂O 的呼气末正压对患者进行通气2O. 输送1%至2%的七氟烷 通过 通过气管插管维持吸入麻醉。
- 手术过程中使用罗库溴铵（0.15 mg/kg）维持神经肌肉阻滞，以提供充分....
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结果
在成功完成切片、染色和载玻片扫描后，对卵巢卵泡进行定量分析。根据卵泡的不同发育阶段和健康状况进行区分并进一步分析。图4A展示了成年个体经Bouin液固定的卵巢的HE染色横截面，包含皮质和髓质组织的示例。图4B显示了儿童卵巢的代表性图像，并示出表面上皮的实例。卵巢储备（即非生长卵泡池）以及小型生长卵泡位于皮质中。通过使用虚拟显微镜对卵泡进行放大和分类，以确保仅纳入卵巢储备卵泡。图5展示了在Bouin液固定（图5A）和甲醛固定（图5B）的卵巢皮质组织中发现并计数的卵泡各发育阶段：（1）原始卵泡（直径约40 µm），（2）过渡期卵泡，以及（3）初级卵泡。图中编号为4–6的卵泡为应排除在计数之外的示例，因其无法准确判定其成熟阶段。图6展示了代表性卵巢皮质组织图像，其中卵泡缺失或数量极少（
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讨论
女性出生时具有有限的卵母细胞池，且无法再生。卵巢储备是决定女性生殖潜能的关键因素。本文介绍了一种通过组织学方法定量分析卵泡密度，并将其与参考标准进行比较的方法，即采用年轻患者及25岁以下女性卵巢皮质卵泡密度的Z评分进行评估。
在此方案中，从处于高或极高不孕风险且接受卵巢组织冷冻的女性和女孩中获取卵巢组织 用于生育力保存，或来自接受性别重置手术的患者。通过一小块卵巢组织来评估冷冻保存的材料。由于卵巢储备随年龄变化，将卵泡密度转换为Z分数可实现与从出生至性成熟期间按年龄标准化的参考值进行比较（Hassan等）。33使用Z分数可提供一种年龄标准化且与队列无关的方法，用于评估卵巢储备样本的正常性。首先建立基于年龄的参考组均值，随后用于计算个体样本的Z分数。该方法使得对正常性的评估不受研究人群内年龄分布的影响。卵巢储备的年龄标准化评估，使得来自不同研究人群中具有相似遗传背景或化疗暴露史的患者数据得以整合，从而促进大规模的荟萃分析。
该方法存在局限性。来自无已知卵巢病变患者的卵巢组.......
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致谢
我们感谢协助我们进行受试者招募和组织采集的医疗专业人员，以及所有捐赠卵巢组织的患者。同时感谢儿童癌症基金（PR2020-0096）和卡罗林斯卡学院博士生资助项目KID，本研究得益于这些基金的资助。我们还要感谢形态学表型分析平台在制备组织学切片过程中的支持。感谢Nicola Byers对本文稿的语言编辑工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1x 沃氏磷酸盐缓冲液 | Thermo Fisher | 14190144 | |
| 含 CaCl2、MgCl2、1 g/L D-葡萄糖、36 mg/L 丙酮酸盐的 1x 磷酸盐缓冲液 | Thermo Fisher | 14287-080 | |
| 37% 盐酸 | Sigma-Aldrich | 1.09057.1000 | |
| 70% 乙醇 | Histolabs | 01370.01L | |
| 95% 乙醇 | Fisher scientific | 10572143 | |
| 无水乙醇 | Histolabs | 01399.01L | |
| 波因液 | Sigma-Aldrich | HT10132-1L | |
| 伊红 Y 酸性品红 | Sigma-Aldrich | E4009-5G | |
| 甲醛 | Thermo Fisher | 28908 | |
| 德拉菲尔德苏木精染液 | Sigma-Aldrich | 03971-250ML | |
| ImageJ | |||
| Microsoft Excel | |||
| 切片机 | |||
| Pertex 封片液 | Histolabs | 00840-05 | |
| 丙泊酚 | Baxter Holding B.V. | N01AX10 | 提供 ATC 编码代替货号 |
| QuPath | https://qupath.github.io/ | ||
| 罗库溴铵 | B. Braun Melsungen AG | M03AC09 | 提供 ATC 编码代替货号 |
| Scott 人工自来水浓缩液 | Sigma-Aldrich | S5134-6x100ml | |
| 七氟烷 | Baxter Medical AB | N01AB08 | 提供 ATC 编码代替货号 |
| 切片扫描仪 | |||
| 舒芬太尼 | Hameln Pharma gmbh | N01AH03 | 提供 ATC 编码代替货号 |
| 舒更葡糖钠 | Baxter Holding B.V. | V03AB35 | 提供 ATC 编码代替货号 |
| SuperFrost plus 白片 | Histolabs | 06400 | |
| SuperFrost Plus 白片载玻片 | Histolabs | 06400 | |
| 二甲苯 | Saveen Werner | 131769.1611 |
参考文献
- Richards, J. A. S. The ovarian cycle. Vitam Horm. 107, 1-25 (2018).
- Wallace, W. H. B., Kelsey, T. W. Human ovarian reserve from conception to the menopause. PLoS One. 5 (1), 1-9 (2010).
- Monniaux, D., et al.
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重印与许可
