使用光谱气体分析仪测量水生生态系统中的溶解甲烷

Summary

本研究展示了一种使用便携式光学分析仪测量水性样品中甲烷气体浓度的方法，该分析仪在闭环中耦合到注射室。结果与传统气相色谱法相似，提供了一种实用且低成本的替代方案，特别适用于远程现场研究。

Abstract

由于与气候变化相关，测量生态系统中的温室气体 （GHG） 通量和储存库在生态研究中变得越来越普遍。因此，对能够适应测量研究小组内不同池和通量的分析平台的需求也在增长。本研究旨在开发一种程序，使用最初设计和销售用于气体通量测量的便携式基于光谱的气体分析仪来测量水性样品中的 GHG 浓度。该方案涉及传统的顶空平衡技术，然后将顶空气体子样品注入通过闭环连接到气体分析仪入口和出口的腔室中。该腔室由通用梅森罐和简单的实验室用品制成，是可能需要进样前稀释的样品的理想解决方案。使用腔室测得的甲烷浓度与通过气相色谱-火焰电离检测 （GC-FID） 对来自同一样品瓶的子样品分别测定的浓度密切相关 （r² > 0.98）。该程序特别适用于色谱设备和用品不易获得的偏远地区的现场研究，为测量水生系统中甲烷和其他溶解温室气体浓度提供了一种实用、更便宜、更有效的解决方案。

Introduction

陆地-水生界面的生态系统，如湿地、湖泊、水库、河流和小溪，是二氧化碳 （CO₂）、甲烷 （CH₄） 和一氧化二氮 （N₂O） 等温室气体 （GHG） 的重要汇和来源^1,2。具体来说，CH₄ 是在沉积物孔隙的饱和孔隙中厌氧呼吸过程中产生的。一旦产生，一部分就会被氧化并转化为 CO₂，而其余部分最终会通过水柱和植被扩散或爆裂成气泡³。在给定时间，使沉积物孔隙（即孔隙水）饱和的水中的 CH₄ 浓度可以让我们得以一窥 CH₄ 产生、消耗和运输⁴ 之间的平衡。当在垂直剖面或时间上测量时，孔隙水浓度还可以识别 CH₄ 生产和消费中更活跃的区域及其季节性变化。

传统上，确定生态系统中孔隙水中温室气体浓度的方法涉及处理在现场收集的水样，以平衡形成的顶部空间中的气体。然后，通过气相色谱分析顶空以确定浓度⁵.虽然这种方法在生态学研究中得到广泛应用，但它需要台式气相色谱-火焰电离检测 （GC-FID） 系统，该系统需要分配传统的实验室空间和高度的专业知识来校准和作（例如⁶）。它还需要使用专门的耗材，例如大型载气罐（即氮气 （N₂） 和氦气 （He）），这些气体在偏远地区不容易获得。这些要求以及将样品运输到实验室的相关物流可能会限制采样设计，在某些情况下，当色谱设备不可用时，会限制研究的范围。

本研究旨在开发一种替代方法，使用基于便携式光谱的气体分析仪测量水溶液顶部空间样品中的溶解温室气体浓度。这种类型的光学气体分析仪是标准 GC-FID 系统的一种经济高效的替代方案，其便携性使其成为野外工作应用的理想选择。基于光谱法的便携式气体分析仪可产生高频气体浓度测量（即 ~ 1 ^s-1），响应时间为 2 - 5 s，具体取决于品牌和型号。这些仪器的设计和销售主要用于测定土壤、水和植被等温室气体排放表面的气体通量 ^7,8,9。光学分析仪允许在感兴趣的发射表面上部署的非稳态顶空室中通过连续浓度测量来计算通量。在表面腔室的常规预期用途中，对腔室中观察到的浓度变化率以及已知的腔室尺寸、压力和温度的高频测量允许将这些数据解释为单位表面积（即表面通量）的发射（或吸收）速率（即表面通量）¹⁰。然而，便携式气体分析仪既没有配备也没有针对水性介质中的溶解浓度进行优化，因此需要对此类分析进行额外的调整和解释。

利用之前使用光学分析仪测定顶空⁸ 离散样品中浓度的演示，我们设计了一个小型封闭腔室（即无发射表面），以闭环方式连接到分析仪。注射顶空气体子样品后浓度的变化，然后进行稀释计算，可以确定原始顶空浓度。通过将其结果与通过 GC-FID 在相同样品中获得的结果进行比较来评估该方法的精密度。该方法通过一个用例进一步证明了该方法，该用例分析了从路易斯安那州淡水沼泽实验地点收集的孔隙水样品中 CH₄ 的垂直剖面。

Protocol

1. 孔隙水采样和分析

1. 使用孔隙水透析采样器 （peepers）¹¹ 收集样品。将窥视器部署在研究地点的相关位置。在示范研究中，在淡水沼泽的两个主要植被斑块上部署了 6 个窥视器:三个在以 Sagitaria lancifolia 为主的斑块上，另外 3 个在 S. lancifolia 和 Typha latifolia 植被共同主导的斑块上。
2. 在 6 月、9 月、10 月和 12 月采集 4 次样品。从土壤表面到土壤表面以下 ~50 厘米的 10 个不同深度收集样品。采样遵循^12,13 中描述的方法。
   1. 采样前 ~20 天用 61 mL 去离子水填充采样池。在实验室中用 N₂ 将去离子水泡 5 分钟以去除氧气，然后再在现场使用。
   2. 在采样过程中，使用连接到细胞提取管线的注射器从细胞中取出 25 mL 水。然后，通过二级电池充电管线，用预先注入 N₂ 的新鲜去离子水重新填充电池。如果在采集后需要立即测量浓度，请继续执行步骤 2.1。
   3. 将提取的水加入 10 mL 玻璃瓶中，玻璃瓶中保存有 0.2 mL 0.1 M HCl，用隔垫封盖，然后冷藏直至实验室分析。
      注意:欢迎此方法的用户根据特定的研究需求修改采集深度、采样计划和频率。

2. 温室气体浓度测量

1. 对注射器中的孔隙水样品进行顶空平衡
   1. 使用平衡技术创建顶空气体样品¹⁴.使用 30 mL 注射器从现场收集的样品中抽取 5 mL 水 （V_pw），然后加入 15 mL N₂ （超高纯度 99.999%）以产生顶空 （V_hs）。
   2. 用力持续地搅拌注射器 5 分钟，手动或使用摇床（如果有）。按照以下步骤，将 12 mL 顶空气体亚样品注入 10 mL 预真空小瓶中，用于使用光学分析仪进行气体浓度测量（图 1）。使用蠕动泵¹⁵ 排空样品瓶，或手动将 60 mL 注射器的柱塞拉到封闭的样品瓶上，然后将空气抽出 3 次。
      注意:可以使用 He 代替 N₂ 来创建顶空。向注射器中添加 N₂ 或 He 的程序取决于用户可用的实际水箱的具体调整或调节器。这种添加通常涉及使用匹配的管道将注射器连接到水箱，或从适合水箱的采样端口与注射器进行萃取。根据现场条件和相关物流，用户可以使用环境空气来创造顶部空间。
2. 创建注射室
   1. 制造一个进样室，该进样室可以接受少量空气 （~1 - 5 mL） 进入密封体积的空气，该空气连接到气体分析仪的入口和流出处，形成一个闭环（材料表）。进样室和分析仪是该系统的两个主要元件（图 2）。
   2. 修改 365 mL 梅森罐的金属盖，钻一个直径为 11 mm 的孔，以适合一个隔膜作为进样口，并钻两个直径为 7 mm 的孔以插入与分析仪连接的旋塞阀。使用环氧树脂胶拧紧注射口和接头，确保腔室密封。
3. 将进样室连接到光学分析仪
   1. 使用 5/32 英寸内径 （I.D.） 和 1/4 英寸外径 （O.D.） 将广振罐与分析仪的入口和出口连接PFA 塑料管，并考虑其增加的体积。确保管路符合仪器制造商的建议，并且清洁干燥且无冷凝。
   2. 将连接进样室和仪器的阀门设置为打开，以创建一个闭环空气回路。等待气体浓度稳定。
4. 在腔室中注入样品
   1. 当腔室中的浓度和分析仪中的信号稳定（即标准偏差 <0.03 ppm）时，从包含步骤 2.1.2 中创建的顶空样品的小瓶中注入 2 mL 子样品。等待分析仪中的浓度再次稳定，然后再注入下一个子样品（图 3）。
   2. 如果浓度接近 100 ppm，则最多连续进样 20 个子样品，或者更少（参见⁸了解高于此阈值的准确度对准确性的影响）。分析每 5 个样品的 CH₄ 检查标准品，并使用相对标准偏差 （RSD） 评估与实际测量值的差异。
   3. 完成一组重迭进样后，拔下连接到仪器的一条管路，将腔室重置为环境压力，避免压力和甲烷浓度显著升高。
      注:根据多次测试运行，确定信号在进样后 ~15 秒稳定，但可能需要不同的时间以响应其他仪器记录规格（图 3）。所用仪器的流速为 ~1 L/min，响应时间为 5 s，不同日期不同分析期间的腔体压力范围为 720 至 745 Torr。
5. 计算顶空中的 CH₄ 浓度
   1. 对于每个子样品，使用公式 1 计算顶部空间 （C_hs - μmol/mol） 中目标 GHG（例如，CH₄、CO₂、N₂O）的浓度:
      方程 [1]
      其中 V_hs 是顶空子样本的体积。
   2. 计算注射前 （C_bi - μmol ^-1） 和之后 （C_ai - μmol ^-1） 的浓度，作为注射前 15 次测量 （~15 s） 和注射后信号稳定后 15 次测量的平均值。使用公式 2 和 3 计算进样前 （V_bi） 和进样后 （V_ai） 的体积（以 mL 为单位）:
      [2]
      和
      [3]
      其中 V_j （mL） 是染色缸 （365 mL） 和软管 （125.4 mL） 的添加体积， V_i （mL） 是注射的子样品的累积体积。
6. 计算孔隙水浓度
   1. 使用顶部空间中气体的摩尔分数和样品处理过程中的大气压 （P） 计算顶部空间 CO₂、CH₄ 或 N₂O 在顶部空间的分压 （P_i - MPa），使用公式 4:
      [4]
   2. 使用稀释方程（方程 5）计算孔隙水中 GHG 的水当量浓度，其中顶部空间和水当量浓度和体积:
      [5]
      其中 R 是通用气体常数 （0.008314 L MPa mol⁻¹ K⁻¹），是空气温度 （K），V_hs 是顶空体积 （mL），_{K H}^cp 是 CO₂、CH₄ 或 N₂O 的亨利挥发性常数（分别为 2.96、67.13 和 3.82 L MPa/mol）^16，V _pw 是用于创建顶空的液体子样品的体积 （mL）。
   3. 在测量过程中使用记录的 T 和 P。示范工程样品分析过程中的平均 T 和 P 分别为 295.15 K 和 0.101325 MPa。

3. 根据标准色谱测量进行验证

1. 在常规气相色谱仪中分析 10 mL 样品瓶中不同的已知 CH₄ 浓度。使用三组相同的 20 个标准品。最低浓度范围为 5 至 100 ppm，并以 5 ppm 的增量增加。
2. 通过在气相色谱仪上进行火焰离子化检测来确定 CH₄ 浓度。色谱仪使用多孔聚合物吸收剂填充柱，以 He （25 mL/min） 作为载气。要测量标准品的浓度，请将色谱仪校准至曲线拟合 （r²） > 0.99。
3. 色谱后，使用制造商校准的光学分析仪（即精密度（300 s，1σ）:0.3 ppb CH₄），使用上述方法继续测定相同标准样品瓶中的 CH₄ 浓度。
4. 通过对三个标准组的色谱和光学分析仪结果进行线性回归来评估方法的准确性。通过比较每组标准品中执行的回归的斜率和截距来评估方法的可重复性。使用标准最小二乘模型评估比较，重点是 Effect Leverage。以 0.05 的显著性水平评估所有回归和比较。

Results

光学分析仪与气相色谱法
通过气相色谱和光学分析仪获得的三组标准品的结果显示良好的线性拟合（即 r² > 0.98），斜率接近 1（图 4）。三个实验中回归的斜率在统计学上相似 （F（2） = 0.478，p = 0.623），表明结果的可重复性。需要注意的是，所有三种情况下的斜率都大于 1，这表明平均而言，与通过色谱法获得的浓度相比，可以预期使用光学分析仪测量的气体浓度略有低估。然而，零处的截距不同 （F（1） = 1648.49，p <0.0001），这警告在解释低 CH₄ 浓度（即 <10 μmol/mol）时要小心。事实上，在这些最低浓度下，光学分析仪和色谱法显示出最大的相对误差（表 1），表明在低浓度下测量存在挑战。

现场测试:使用协议确定路易斯安那州沿海湿地两个植被斑块孔隙水中的甲烷浓度
从现场样本中测定的孔隙水 CH₄ 浓度显示出明显的垂直和时间动态（图 5）。这些模式在湿地生态水文环境中是预期的，例如采样的环境，其中不同的湿地植被可以调节 CH₄ 的产生和氧化以及由此产生的与大气的气体交换^17,18。RSD ± 10.03%，低于在温室气体分析中采用色谱法的质量控制和保证 （QC/QA） 方案中通常用作阈值的 15%¹⁹。

图 1:协议概述。 显示协议主要步骤的示意图。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:系统组件。 （A） 主要组件和 （B） 注射室的详细视图。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:注射过程中的浓度。 在选定测量期间，进样室中的 CH₄ 浓度显示了进样后的典型响应。突出显示的区域表示计算时考虑的进样前后的浓度。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4:该方法与色谱法的测量结果比较。 在三个实验中，用气相色谱法 （GC-FID） 测定的 CH₄ 顶空浓度与用该方法测定的浓度之间的线性关系具有良好的线性拟合（即 r² > 0.98）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5:用例演示。 斑块中的孔隙水浓度以 （A） Sagittaria lancifolia 和 （B） Sagittaria lancifolia 和 Typha latifolia 的混合物为主。 请单击此处查看此图的较大版本。

CH4 标准 [ppm]	气相色谱 [%]	光学分析仪 [%]
5	24.3	22.8
10	9.6	3.4
15	16.7	6.1
20	0.6	3.4
25	1	6
30	1.5	6.7
35	1.7	8
40	1.3	13.3
45	1.4	8.2
50	0.2	6.9
55	1.4	7.9
60	1.6	4.6
65	0.4	8.8
70	2.4	4.3
75	1.4	6.3
80	0.9	7
85	0.4	4.1
90	1.6	3.3
95	3.4	9
100	4.2	3.3

表 1:相对误差 （%）。 气相色谱 （GC） 和光学分析仪对同一检查标准样品瓶进行测量。

Discussion

本研究证明了基于便携式光谱的气体分析仪与定制进样室耦合分析水样形成的顶部空间的适用性。演示的重点是 CH₄，但该协议可应用于分析其他相关 GHG，如 CO₂ 和 N₂O⁸。目标是扩展以前对这些闭环系统的系统评估，这些系统代表了 GHG 浓度测量研究中传统气相色谱法的替代分析平台。

与气相色谱法类似，在这种方法中，使用检查标准品来确保分析过程中的质量控制和评估至关重要。使用该方法分析的标准品与标准色谱分析的标准品相当（图 4）。然而，主要的优点包括缺乏载气或频繁的校准程序。用户还可以在现场采样后立即运行样品，从而减少水样品中 CH₄ 等反应性物质的微生物氧化时间。即使无法使用无 GHG 气体来产生样品制备所需的顶部空间，假设目标水中的浓度高于空气²⁰，用户仍然可以使用环境空气产生顶部空间。此外，还存在一些明显的缺点，例如测量大型样品集所需的时间。尽管单个样品分析所需的时间与 GC-FID 相似，但在光学分析仪中没有自动化方法进行进样，并且与更成熟的 GC 自动进样器系统相比，这种方法需要更多的作时间。

这种方法与其他具有在线进样口（例如 ⁸）的闭环系统之间的主要区别在于增加了一个进样室。在该研究中，高浓度样品可以作为分析过程中常规作的一部分进行稀释，从而避免在样品注入定量环之前进行额外稀释步骤。在实践中，作人员可以继续从顶空进样到腔室中，而不是对疑似高浓度的样品进行稀释。腔室容积可以修改和增大以容纳高浓度样品，或减小腔室容积以容纳低浓度样品。与其他采用在线进样的闭环系统相比，该方法在分析多个样品的效率方面具有另一个优势，即每次进样后无需冲洗腔室即可进行堆栈进样。在我们测试的 20 叠式进样方法中，进样室中的稀释使定量环中的甲烷浓度始终保持在 100 ppm CH₄ 以下，之前的工作将其确定为定量环浓度阈值，在该阈值下，CH₄ 分析的准确度开始下降³。

总体而言，该方法适用于偏远地区的样品分析，或者适用于色谱仪（包括便携式色谱仪²¹）不可行或不可用的情况。例如，在偏远地区进行野外考察的科学家将能够在一些简单的步骤后确定水体和水系统中的实际 GHG 浓度，从而在现场创建顶部空间并就采样优先级和需求做出决定，而不必将样品带回配备色谱仪的实验室或野外站。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4英寸内径 x 3/8英寸外径透明乙烯基管材	家得宝	SKU # 702098	用于耦合连接到仪器的旋塞阀和管道。两短片 （~4 cm）。
5/16 - 5/8 英寸不锈钢软管夹	Everbilt	6260294	用于固定连接旋塞阀的管道和连接到仪器的管道。
用于化学品的抗裂特氟龙 PFA 半透明管，内径 5/32 英寸，外径 1/4 英寸	McMaster-Carr	51805K86	用于将进样室连接到仪器的入口和出口。我们在实验中使用了两根 0.68 m 长的管子。
用钛阶梯钻头钻孔	多家公司		用于在罐子的金属盖上钻隔膜和旋塞阀的孔。
Gay butyl septum （stopper）	Weathon Microliter	20-0025-B	用作注射口和小瓶隔膜（如果兼容的话。
顶空样品瓶 20 ml （23x75mm），透明，钳口圆底	Restek	21162	用于储存顶空样品。
重型钢粘结环氧大猩猩焊接	大猩	4330101	用于将旋塞阀和隔膜粘在罐子的金属盖上。
Hypodermic Needles	Air-Tite Products Co.	N221	用于从现场样品瓶中提取水，将 heaspace 样品注入样品瓶中，并将子样品注入进样室。
梅森罐 （12 oz）	球形、Kerr、Jarden		样品浓度选择更大或更小的腔室体积。
基于光谱的气体分析仪	多家公司	Picarro G4301、Licor 7810、Licor 7820、ABB GLA131-GGA	这些是可以耦合到注射室的分析仪的一些具体示例。我们认识到，这不是一个广泛的列表，其他光谱分析仪也可能适用于该方法。
旋塞阀	DWK Life Sciences	420163-0001	在正常运行期间保持阀门打开。
注射器 （2.5 mL）	Air-Tite Products Co.	R2	用于从顶空样品瓶中提取子样品，并将其注入注入喷射室进行分析。
注射器 （30 mL）	Air-Tite Products Co.	R30HJ	用于创建气体分析的顶部空间。