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方法文章

利用黑色素瘤患者来源类器官模型揭示治疗新机遇

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DOI：

10.3791/66509

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2024年9月6日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

本文内容

摘要

在此，我们介绍一种通过培养新鲜黑色素瘤组织解离后的细胞悬液来生成黑色素瘤患者来源类器官的实验方案。这些类器官能够真实地再现患者特异性的肿瘤特征 体外 为研究肿瘤免疫抑制机制、药物筛选、耐药机制及癌症监测方法提供了创新途径。

摘要

随着免疫疗法的发展，人们迫切需要开发能够模拟原发肿瘤微环境的模型。传统的二维和三维模型虽然能够为癌症的发生和发展提供一定见解，但缺乏一些关键要素，难以真实再现原发肿瘤的特征。近年来备受关注的一种替代模型是患者来源类器官。这类类器官的建立能够重现肿瘤复杂的细胞间通讯、肿瘤微环境以及组织结构。本文描述了建立黑色素瘤患者来源类器官（MPDO）模型的实验方案。为验证这些模型的有效性，我们评估了类器官中的免疫细胞组成，包括T细胞活化标志物的表达水平，以确认类器官的细胞异质性。此外，为了探讨MPDO在细胞治疗中的潜在应用价值，我们检测了γδ T细胞对类器官的细胞毒性作用。综上所述，MPDO模型为理解肿瘤复杂性、验证治疗策略以及推动个体化治疗的发展提供了有前景的研究途径。

引言

传统的二维细胞培养模型是癌症研究中用于研究癌症进展和治疗的重要工具1。这些模型不仅能够在受控的实验条件下研究癌症发生和发展的分子与细胞机制，还能提供成本较低且相对快速的实验结果。然而，由于单层培养模型无法重现肿瘤微环境（TME）中有限的细胞多样性，其应用受到限制2。此外，与人体实际环境相比，细胞培养模型所提供的环境过于简化3。因此，为了更深入地理解癌症的进展并开发有效的治疗方法，研究人员已转向创新的模型，旨在更真实地模拟肿瘤微环境的特性。相应地，在这些模型中保持与原始肿瘤的高度保真性至关重要。鉴于癌症的复杂性，任何与原始肿瘤的显著偏差都可能引入不可预见的变量，从而干扰对肿瘤行为的有意义结论。

尽管患者来源的异种移植瘤（PDX）已作为一种可监测肿瘤进展的模型系统出现 体内，某些局限性引发了人们对所构建的肿瘤在多大程度上能够模拟人类癌症生物学特征的质疑4例如，黑色素瘤的肿瘤微环境（TME）包含肿瘤浸润性免疫细胞和基质细胞。当以异种移植方式传代时，来自患者的非癌细胞将逐渐丢失，这可能导致所筛选出的适应性特征与患者原发肿瘤中的实际情况不同。尽管通过限制PDX的传代次数可在一定程度上缓解这些局限性 体内，不同物种之间的差异仍可能导致PDX发生偏离原发肿瘤的遗传改变5此外，PDX 模型通常建立在免疫缺陷小鼠中，以防止人源组织被排斥。这限制了对宿主免疫系统在癌症中作用的研究，尤其是在免疫治疗研究中。6我们及其他研究者已将PDX移植至“人源化”小鼠体内7,8然而，在人源化小鼠中建立PDX模型耗时较长且成本高昂。从患者的肿瘤样本中构建一个PDX模型可能需要数月到数年时间，从而限制了研究的速度和规模。尽管存在这些局限性，PDX模型已被证实能够准确模拟肿瘤微环境（TME）的生物学特性，因此被广泛应用于癌症治疗药物开发、个体化医疗以及免疫治疗等领域。9.

近年来出现了一种替代性的三维培养技术，即患者来源类器官（patient-derived organoid, PDO），该技术通过培养新鲜切除的患者肿瘤组织，构建出能够维持表型异质性、组织结构特征以及细胞间相互作用的模型10。已有研究证实，这种模型能够高度模拟原始肿瘤的特性，例如，由非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）和肌层浸润性膀胱癌（MIBC）患者来源的类器官在培养后成功再现了亲本肿瘤的关键特征11。由于PDO相较于其他模型具有显著优势和广阔潜力，因此可实现多种其他模型无法完成的定制化应用，包括但不限于免疫检查点抑制剂、细胞治疗及靶向治疗的研究与开发。例如，我们先前曾利用黑色素瘤患者来源类器官（MPDOs）研究肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）在IL-2和抗PD-1抗体（αPD-1）作用下的扩增能力。结果显示，经IL-2和αPD-1扩增的TILs不仅数量更多，而且能够更有效地浸润MPDOs并杀伤黑色素瘤细胞，其效率高于其他方法扩增的TILs12。其他研究团队也报道了类似结果，即使用抗PD-1和/或抗PD-L1抗体可使TILs在PDO中保持功能活性，进而引发肿瘤细胞杀伤效应13。此外，我们团队还利用MPDOs评估了γδ T细胞的浸润能力及其杀伤功能14。PDO的应用范围广泛，涵盖TIL扩增、细胞毒性研究以及小分子药物筛选等多个领域。上述各项应用均凸显了该模型所具备的巨大潜力与实用性。因此，本文详细描述了MPDOs的培养方案。

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方案

人黑色素瘤组织来自宾夕法尼亚大学接受治疗的患者，采集过程遵循宾夕法尼亚大学机构审查委员会批准的组织采集方案（UPCC08607）。所有患者均已签署知情同意书。在切除人黑色素瘤组织后，肿瘤组织被置于杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，并在4 °C保存直至处理（6小时内）。黑色素瘤患者来源类器官（MPDOs）由新鲜肿瘤组织制备，如图1所示。

1. 从人黑色素瘤组织中分离细胞

  1. 实验开始前的准备工作
    注意：可采用两种培养方法（Matrigel 和胶原凝胶）来培养解离的黑色素瘤组织：
    1. Matrigel 方法：通过将生长因子减少型（GFR）基底膜基质与类器官培养基（见表 1）按 1:2 比例稀释，制备包被溶液。将约 115 µL 解冻后的溶液加入 48 孔板的多个孔中，并在 37 °C 湿润培养箱中孵育 30 分钟使其凝固。
    2. 胶原凝胶方法：将 1 mL 胶原凝胶（见表 1）加入内径为 30 mm 的膜插件中。在 37 °C 湿润培养箱中孵育 30 分钟，使凝胶凝固。
  2. 制备 L-WRN 条件培养基15。L-WRN 条件培养基由经基因工程改造的 L-WRN 细胞系分泌产生，该细胞系可分泌 Wnt3a、R-spondin 3 和 Noggin 至单一条件培养基中，广泛用于细胞培养。
    1. 在 37 °C 水浴中解冻一支 L-WRN 细胞冻存管。将 5 mL L 细胞培养基（见表 1）和 L-WRN 细胞悬液加入 15 mL 圆底离心管中，在 4 °C 下以 120 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，确保底部保留约 500 µL 以重悬细胞沉淀。
    2. 将含上清液的细胞沉淀转移至冰上的 30 mL L 细胞培养基中，加入 150 µL 潮霉素（500 µg/mL）和 300 µL G418（500 µg/mL）。以 3 × 106 的密度将细胞接种于 T-150 培养瓶中，并在含 5% CO2 的湿润培养箱中 37 °C 培养至约 90% 汇合度。
    3. 当细胞达到约 90% 汇合度时，用 20 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，吸除液体后用 3 mL 胰蛋白酶替代物消化，然后将细胞分传至五个 T-150 培养瓶中。5 分钟后，加入 9 mL L 细胞培养基中和，随后在 4 °C 下以 120 × g 离心 5 分钟。当细胞达到约 100% 汇合度时，将五个 T-150 培养瓶中的细胞分传至 10 个三层 T-175 培养瓶中。
    4. 细胞汇合后，先用 2 × 50 mL PBS 洗涤，再用 25 mL 洗涤液（见表 1）洗涤。
    5. 向每个三层 T-175 培养瓶中加入 75 mL 初代培养基，并在含 5% CO2 的湿润培养箱中 37 °C 培养 3 天（见表 1）。
    6. 3 天后，将条件培养基收集至 50 mL 圆底离心管中，在 4 °C 下以 1,100 × g 离心 5 分钟。收集上清液（即条件培养基），确保底部保留 5 mL。
    7. 向每个三层 T-175 培养瓶中加入新鲜的 75 mL 初代细胞培养基，继续培养 3 天以收集更多条件培养基。
    8. 向收集的条件培养基中加入等体积的初代细胞培养基（即 50% 体积），使用 0.22 µm 滤器进行真空过滤。将滤液分装至 50 mL 管中，长期保存可置于 -20 °C，短期保存可置于 4 °C（最多 2–3 周）。使用该培养基补充类器官培养基（见表 1）。
      注意：使用前需在 4 °C 过夜解冻分装样品。
  3. 从新鲜黑色素瘤组织中收获细胞混合物
    1. 在含有洗涤液的 10 mL 培养皿中清洗新切除的黑色素瘤组织。第一次冲洗后，使用无菌镊子将肿瘤转移至第二个培养皿中进行进一步清洗，并在冰上重复此过程 3 次，以保持肿瘤完整性和活性。在整个冲洗过程中，使用无菌剪刀和刀片去除多余的结缔组织、脂肪和残留血液。三次清洗后，将肿瘤置于空培养皿中，使用无菌刀片将其充分切碎。
      注意：切碎后，肿瘤应呈现凝胶状质地。肿瘤切得越细，细胞得率越高，因为较大的肿瘤团块更难消化，且可能无法通过后续步骤中的 70 µm 尼龙细胞筛。
    2. 待肿瘤组织充分清洗并切碎后，将其转移至含有 10 mL 预制消化液的 50 mL 圆底离心管中（见表 1）。将离心管置于 37 °C 水浴中，并确保每 5 分钟涡旋混匀一次。
    3. 25 分钟后，加入 30 mL 含 10% FBS 的 ADMEM/F12 培养基以终止消化。
      注意：上述指定体积适用于重量不超过 0.2 g 的肿瘤。
    4. 将消化后的细胞悬液通过 70 µm 尼龙细胞筛过滤，然后用含 10% FBS 的 ADMEM/F12 (1x) 低血清培养基（1:1）冲洗滤器。洗涤后，使用移液器吸取滤器底部残留的培养基，以确保回收尽可能多的细胞。随后在 4 °C 下以 300 × g 离心 7 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于类器官培养基中（见表 1）。
    5. 将黑色素瘤单细胞悬液接种于 Matrigel 或胶原凝胶培养系统中：
      1. Matrigel：计数单细胞悬液，确保在预温的 Matrigel 包被孔中接种约 2 × 105 个细胞，并补充 200 µL 类器官培养基。
        注意：基于 Matrigel 的类器官用于研究病理生理学、筛选药物疗效及检测药物毒性16。
      2. 胶原凝胶：计数单细胞悬液，确保约 106 个细胞与 1 mL 胶原凝胶混合。将混合物加入已预凝固的胶原凝胶膜插件中，并将其置于 6 孔板中。加入足够的类器官培养基以完全浸没含有细胞和胶原凝胶的插件。
        注意：胶原凝胶类器官用于测量 T 细胞迁移及研究组织发育16。
    6. 培养类器官，并确保每 3 天更换一次新鲜培养基。
    7. 当类器官生长至 150–200 µm 大小时进行传代，或将其冻存以备后续使用。
      1. 传代时，将类器官转移至 15 mL 圆底离心管中，用 1× DPSB 洗涤。在 4 °C 下以 300 × g 离心 7 分钟。弃去上清液，加入胰蛋白酶替代物（每个类器官 50–100 µL），在 37 °C 水浴中消化 10 分钟，期间每 3 分钟涡旋混匀一次。
      2. 使用含 10% FBS 的 ADMEM/F12 (1x) 低血清培养基（1:1）终止消化。将混合物在 4 °C 下以 300 × g 离心 7 分钟，然后重悬于类器官培养基中。
      3. 将单细胞悬液以相同的初始接种密度接种至新的 Matrigel/胶原包被孔中（在 48 孔板中，Matrigel 包被孔每孔 200 µL 类器官培养基含 2 × 105 个细胞；胶原包被的 30 mm 内膜插件每孔 1 mL 类器官培养基含 106 个细胞）。
      4. 冻存时，使用胰蛋白酶替代物将 MPDOs 消化为单细胞悬液，随后将 106 个细胞重悬于 1 mL 冻存液中（见表 1）。

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结果

通过监测 MPDO 的形态和大小随时间的变化，以研究其生长动态。如图2所示，在初始生长期，类器官的尺寸在所示的7天内显著增大。在观察了 MPDO 的生长动态后，研究重点转向评估免疫细胞组成，以验证类器官对原始肿瘤的忠实再现。该评估主要聚焦于 αβ T 细胞的丰度，从而揭示类器官与亲本肿瘤之间的相似性。如图所示，图3表明，在亲本肿瘤与分别在 Matrigel 或胶原蛋白中培养的相应类器官之间，αβ T 细胞比例无统计学显著差异。在证实了亲本肿瘤与类器官之间的相似性后，接下来我们通过流式细胞术评估 T 细胞活性。设门策略见于图4，该策略通过定义单细胞、活的白细胞，随后对 CD3+ 和 CD8+ T 细胞群体设门，以检测常见的 T 细胞活化标志物。

鉴于细胞毒性T细胞在产生细胞因子以及释放颗粒酶B和穿孔素等细胞毒性分子中的作用，对其表达水平进行了检测。颗粒酶B和穿孔素...

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讨论

PDO的出现解决了以往 established 癌症研究方法存在的多种局限性，同时为该领域带来了变革性的应用前景。该类类器官技术最初由Hans Clevers及其同事于2009年提出，他们通过培养Lgr5+肠道干细胞，成功建立了肠道类器官培养体系。+ 从小鼠肠道中分离的干细胞，在含有R-spondin、EGF和Noggin因子的三维基质凝胶中培养20几年后，即2020年，Koehler 团队报道了一种类器官培养模型，该模型能够生成皮肤 体外 首次仅使用人类多能干细胞（PSCs）21鉴于类器官技术的这些显著进展，肿瘤类器官模型的开发迅速兴起，有望彻底改变癌症研究和药物开发。

因此，本实验方案重点阐述从新近切除的人黑色素瘤组织中获取类器官的步骤，以推动对癌症生物学的理解并改进药物研发策略。为此，多个实验室已开展研究，以验证患者来源类器官（PDO）与其亲本肿瘤的相似性。值得注意的是，Sun 及其同事采用类似的 PDO 技术建立了黏膜黑色素瘤（MM）模型，...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究部分由以下基金资助：R01(CA258113)、SPORE (CA261608) 和 P01 (CA114046)。图1 使用 BioRender.com 制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2 mL 红盖内螺纹聚丙烯冻存管Corning431420
50 mL 聚丙烯锥形离心管Corning352070
100 mm 细胞培养处理培养皿Corning353003
105 mm 聚苯乙烯无菌镊子Caplugs Evergreen 222-1121-B1I
150 cm2 细胞培养瓶CorningCLS430825
A83-01Tocris2939
高级 DMEM/F12 (1x) 低血清培养基 (1:1)Gibco12634-010
B-27 添加剂 (50x)Gibco17504-044
Brilliant Violet 510 抗人穿孔素抗体BioLegend308120
Brilliant Violet 605 抗人 Ki-67 抗体BioLegend350522
Brilliant Violet 650 抗人 CD366 (Tim-3) 抗体BioLegend345028
Brilliant Violet 711 抗人 CD45 抗体BioLegend304050
细胞培养插件 0.4 µm，直径 30 mmMillipore SigmaPIHP03050
细胞染色缓冲液BioLegend420201
细胞筛 40 µm 尼龙Corning 352340
细胞筛 70 µm 尼龙Corning 352350
胶原酶 IV 型，粉末Gibco17104019
Cultrex 大鼠 I 型胶原蛋白Trevigen3440-100-01
培养板，聚苯乙烯，48 孔，带盖，细胞培养处理，无菌Max Scientific 07-6048
二甲基亚砜 (DMSO) Hybri-MaxSigma-AldrichD2650
DMEM - 高糖 4.5 mg/mLCorningMT10-0130CV
脱氧核糖核酸酶 I - II 级Millipore Sigma10104159001
DPBS, 1% Corning21-031-CV
胎牛血清，FBSCorningMT35-010-CV
FITC Annexin V 凋亡检测试剂盒 IBD Biosciences 556547
福斯科林Tocris1099
遗传霉素选择性抗生素 (G418 硫酸盐) (50 mg/mL)ThermoFisher10131035
GlutaMAX 添加剂ThermoFisher35050061
Ham's F12 营养混合物ThermoFisher11765054
HEPES (1 M)Gibco15630-080
潮霉素 B (50 mg/mL)ThermoFisher10687010
L-谷氨酰胺 200 mM (100x)Gibco25030-081
L-WRN 细胞ATCCCRL-3276
Matrigel 无酚 & 生长因子减量Corning356231
Millex PVDF 注射器滤器，0.22 μmMillipore SigmaSLGVR33RB
N-乙酰半胱氨酸Sigma-AldrichA9165-5G
烟酰胺Sigma-AldrichN0636-100G
Nunc TripleFlask 处理细胞培养瓶ThermoFisher132867
PE/Cyanine5 抗人 CD8a 抗体BioLegend301010
PE-Cy 7 小鼠抗人 CD279 (PD-1)BD Biosciences 561272
青霉素-链霉素溶液Gibco15140-122
重组人 EGFPeprotechAF-100-15-1MG
重组人酸性 FGFPeprotech100-17A
碳酸氢钠溶液 (NaHCO3) (7.5%)Quality Biological 118-085-721
不锈钢外科刀片 No. 22Integra4-322
TrypLE Express Gibco12604-021

参考文献

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