利用黑色素瘤患者来源类器官模型揭示治疗新机遇

摘要

在此，我们介绍一种通过培养新鲜黑色素瘤组织解离后的细胞悬液来生成黑色素瘤患者来源类器官的实验方案。这些类器官能够真实地再现患者特异性的肿瘤特征 体外 为研究肿瘤免疫抑制机制、药物筛选、耐药机制及癌症监测方法提供了创新途径。

摘要

随着免疫疗法的发展，人们迫切需要开发能够模拟原发肿瘤微环境的模型。传统的二维和三维模型虽然能够为癌症的发生和发展提供一定见解，但缺乏一些关键要素，难以真实再现原发肿瘤的特征。近年来备受关注的一种替代模型是患者来源类器官。这类类器官的建立能够重现肿瘤复杂的细胞间通讯、肿瘤微环境以及组织结构。本文描述了建立黑色素瘤患者来源类器官（MPDO）模型的实验方案。为验证这些模型的有效性，我们评估了类器官中的免疫细胞组成，包括T细胞活化标志物的表达水平，以确认类器官的细胞异质性。此外，为了探讨MPDO在细胞治疗中的潜在应用价值，我们检测了γδ T细胞对类器官的细胞毒性作用。综上所述，MPDO模型为理解肿瘤复杂性、验证治疗策略以及推动个体化治疗的发展提供了有前景的研究途径。

引言

传统的二维细胞培养模型是癌症研究中用于研究癌症进展和治疗的重要工具¹。这些模型不仅能够在受控的实验条件下研究癌症发生和发展的分子与细胞机制，还能提供成本较低且相对快速的实验结果。然而，由于单层培养模型无法重现肿瘤微环境（TME）中有限的细胞多样性，其应用受到限制²。此外，与人体实际环境相比，细胞培养模型所提供的环境过于简化³。因此，为了更深入地理解癌症的进展并开发有效的治疗方法，研究人员已转向创新的模型，旨在更真实地模拟肿瘤微环境的特性。相应地，在这些模型中保持与原始肿瘤的高度保真性至关重要。鉴于癌症的复杂性，任何与原始肿瘤的显著偏差都可能引入不可预见的变量，从而干扰对肿瘤行为的有意义结论。

尽管患者来源的异种移植瘤（PDX）已作为一种可监测肿瘤进展的模型系统出现 体内，某些局限性引发了人们对所构建的肿瘤在多大程度上能够模拟人类癌症生物学特征的质疑⁴例如，黑色素瘤的肿瘤微环境（TME）包含肿瘤浸润性免疫细胞和基质细胞。当以异种移植方式传代时，来自患者的非癌细胞将逐渐丢失，这可能导致所筛选出的适应性特征与患者原发肿瘤中的实际情况不同。尽管通过限制PDX的传代次数可在一定程度上缓解这些局限性 体内，不同物种之间的差异仍可能导致PDX发生偏离原发肿瘤的遗传改....

方案

人黑色素瘤组织来自宾夕法尼亚大学接受治疗的患者，采集过程遵循宾夕法尼亚大学机构审查委员会批准的组织采集方案（UPCC08607）。所有患者均已签署知情同意书。在切除人黑色素瘤组织后，肿瘤组织被置于杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，并在4 °C保存直至处理（6小时内）。黑色素瘤患者来源类器官（MPDOs）由新鲜肿瘤组织制备，如图1所示。

1. 从人黑色素瘤组织中分离细胞

1. 实验开始前的准备工作
   注意：可采用两种培养方法（Matrigel 和胶原凝胶）来培养解离的黑色素瘤组织：
   1. Matrigel 方法：通过将生长因子减少型（GFR）基底膜基质与类器官培养基（见表 1）按 1:2 比例稀释，制备包被溶液。将约 115 µL 解冻后的溶液加入 48 孔板的多个孔中，并在 37 °C 湿润培养箱中孵育 30 分钟使其凝固。
   2. 胶原凝胶方法：将 1 mL 胶原凝胶（见表 1）加入内径为 30 mm 的膜插件中。在 37 °C 湿润培养箱中孵育 30 分钟，使凝胶凝固。
2. 制备 L-WRN 条件培养基^1....

结果

通过监测 MPDO 的形态和大小随时间的变化，以研究其生长动态。如图2所示，在初始生长期，类器官的尺寸在所示的7天内显著增大。在观察了 MPDO 的生长动态后，研究重点转向评估免疫细胞组成，以验证类器官对原始肿瘤的忠实再现。该评估主要聚焦于 αβ T 细胞的丰度，从而揭示类器官与亲本肿瘤之间的相似性。如图所示，图3表明，在亲本肿瘤与分别在 Matrigel 或胶原蛋白中培养的相应类器官之间，αβ T 细胞比例无统计学显著差异。在证实了亲本肿瘤与类器官之间的相似性后，接下来我们通过流式细胞术评估 T 细胞活性。设门策略见于图4，该策略通过定义单细胞、活的白细胞，随后对 CD3⁺ 和 CD8⁺ T 细胞群体设门，以检测常见的 T 细胞活化标志物。

鉴于细胞毒性T细胞在产生细胞因子以及释放颗粒酶B和穿孔素等细胞毒性分子中的作用，对其表达水平进行了检测。颗粒酶B和穿孔素.......

讨论

PDO的出现解决了以往 established 癌症研究方法存在的多种局限性，同时为该领域带来了变革性的应用前景。该类类器官技术最初由Hans Clevers及其同事于2009年提出，他们通过培养Lgr5+肠道干细胞，成功建立了肠道类器官培养体系。⁺ 从小鼠肠道中分离的干细胞，在含有R-spondin、EGF和Noggin因子的三维基质凝胶中培养²⁰几年后，即2020年，Koehler 团队报道了一种类器官培养模型，该模型能够生成皮肤 体外 首次仅使用人类多能干细胞（PSCs）²¹鉴于类器官技术的这些显著进展，肿瘤类器官模型的开发迅速兴起，有望彻底改变癌症研究和药物开发。

因此，本实验方案重点阐述从新近切除的人黑色素瘤组织中获取类器官的步骤，以推动对癌症生物学的理解并改进药物研发策略。为此，多个实验室已开展研究，以验证患者来源类器官（PDO）与其亲本肿瘤的相似性。值得注意的是，Sun 及其同事采用类似的 PDO 技术建立了黏膜黑色素瘤（MM）模型，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2 mL 红盖内螺纹聚丙烯冻存管	Corning	431420
50 mL 聚丙烯锥形离心管	Corning	352070
100 mm 细胞培养处理培养皿	Corning	353003
105 mm 聚苯乙烯无菌镊子	Caplugs Evergreen	222-1121-B1I
150 cm2 细胞培养瓶	Corning	CLS430825
A83-01	Tocris	2939
高级 DMEM/F12 (1x) 低血清培养基 (1:1)	Gibco	12634-010
B-27 添加剂 (50x)	Gibco	17504-044
Brilliant Violet 510 抗人穿孔素抗体	BioLegend	308120
Brilliant Violet 605 抗人 Ki-67 抗体	BioLegend	350522
Brilliant Violet 650 抗人 CD366 (Tim-3) 抗体	BioLegend	345028
Brilliant Violet 711 抗人 CD45 抗体	BioLegend	304050
细胞培养插件 0.4 µm，直径 30 mm	Millipore Sigma	PIHP03050
细胞染色缓冲液	BioLegend	420201
细胞筛 40 µm 尼龙	Corning	352340
细胞筛 70 µm 尼龙	Corning	352350
胶原酶 IV 型，粉末	Gibco	17104019
Cultrex 大鼠 I 型胶原蛋白	Trevigen	3440-100-01
培养板，聚苯乙烯，48 孔，带盖，细胞培养处理，无菌	Max Scientific	07-6048
二甲基亚砜 (DMSO) Hybri-Max	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM - 高糖 4.5 mg/mL	Corning	MT10-0130CV
脱氧核糖核酸酶 I - II 级	Millipore Sigma	10104159001
DPBS, 1%	Corning	21-031-CV
胎牛血清，FBS	Corning	MT35-010-CV
FITC Annexin V 凋亡检测试剂盒 I	BD Biosciences	556547
福斯科林	Tocris	1099
遗传霉素选择性抗生素 (G418 硫酸盐) (50 mg/mL)	ThermoFisher	10131035
GlutaMAX 添加剂	ThermoFisher	35050061
Ham's F12 营养混合物	ThermoFisher	11765054
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
潮霉素 B (50 mg/mL)	ThermoFisher	10687010
L-谷氨酰胺 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
L-WRN 细胞	ATCC	CRL-3276
Matrigel 无酚 & 生长因子减量	Corning	356231
Millex PVDF 注射器滤器，0.22 μm	Millipore Sigma	SLGVR33RB
N-乙酰半胱氨酸	Sigma-Aldrich	A9165-5G
烟酰胺	Sigma-Aldrich	N0636-100G
Nunc TripleFlask 处理细胞培养瓶	ThermoFisher	132867
PE/Cyanine5 抗人 CD8a 抗体	BioLegend	301010
PE-Cy 7 小鼠抗人 CD279 (PD-1)	BD Biosciences	561272
青霉素-链霉素溶液	Gibco	15140-122
重组人 EGF	Peprotech	AF-100-15-1MG
重组人酸性 FGF	Peprotech	100-17A
碳酸氢钠溶液 (NaHCO3) (7.5%)	Quality Biological	118-085-721
不锈钢外科刀片 No. 22	Integra	4-322
TrypLE Express	Gibco	12604-021